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EXPOSIÇÃO A AFLATOXINAS: FATOR DE RISCO PARA CÂNCER DE FÍGADO

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EXPOSIÇÃO A AFLATOXINAS: FATOR DE RISCO PARA CÂNCER DE FÍGADO

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O estudo confirmou a relação da exposição à aflatoxina com a incidência  de  carcinoma  hepatocelular, mesmo a ingestão não sendo em quantidades exageradas.

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Micotoxinas - Qualidade Sanitaria de Grão e de Forragens Conservadoras X Desepenho animal e qualidade dos seus produtos

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Micotoxinas - Qualidade Sanitaria de Grão e de Forragens Conservadoras X Desepenho animal e qualidade dos seus produtos

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O artigo em questão aborda a dieta animal, buscando uma avaliação da qualidade Sanitária da mesma, uma vez que, esses animais servirão para abastecer a população brasileira e o impacto na saúde é extremamente preocupante. O foco do artigo é trazer as possíveis micotoxinas que podem ser encontradas nos insumos que servirão de base para a alimentação animal, e consequentemente, seu acúmulo na carne, acaba trazendo impactos econômicos e de saúde pública, destacando os ruminantes.

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Qualidade Nutricional e determinação de compostos tóxicos em alface (Lactuca sativa L.) e tomate de mesa (Lycopersicon esculentum Mill)

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Qualidade Nutricional e determinação de compostos tóxicos em alface (Lactuca sativa L.) e tomate de mesa (Lycopersicon esculentum Mill)

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A alface e o tomate são um dos alimentos orgânicos mais consumidos pela população brasileira. Portanto, a preocupação dos consumidores frente a ingestão desses alimentos tende a aumentar, tendo em vista seu alto consumo. A ingestão deles podem estar associados ao risco de ocorrência de doenças, seja pela presença de aditivos, agrotóxicos, hormônios, toxinas naturais ou ainda outros tipos de substâncias. Portanto, o artigo em questão tem como objetivo verificar a presença de substâncias tóxicas como aflotoxinas e selênio em amostras de alface crespa e tomate de mesa. As amostras para análises foram obtidas em feira de pequenos produtores rurais e supermercado na cidade de Diamantina-MG.

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O artigo em questão tem como objetivo investigar os principais aditivos encontrados em alimentos industrializados para o publico infantil, contrastando com as possíveis doenças provocadas pelo consumo dessas substâncias.
Embora os aditivos alimentares exerçam um importante papel no processamento dos alimentos, eles podem causar danos a saúde, principalmente em crianças, uma vez que esse público é mais vulnerável. Dessa forma, o artigo em questão é de grande relevância, principalmente para as mães, que muitas vezes não sabem ao certo que o consumo excessivo de alimentos industrializados podem trazer uma série de malefícios para os seus filhos, como: alergias de pele, urticária, dislipidemias, obesidade e diabetes mellitus.

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VERIFICAÇÃO DE ADITIVOS EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS

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Achei interessante esse artigo. Apesar de ser um pouco mais antigo (2009) mostra bem a trajetória do uso de agrotóxicos no país e, como sabemos, de lá para cá só houve aumento na utilização dessas substâncias. Ele traz um enfoque para a produção de maçãs no país, já que a fruta é consumida geralmente com casca e apresenta maiores resíduos de agrotóxicos quando comparada a pêra, alface e suco de laranja. Ainda é muito utilizada para produção de sucos e papinhas para bebês, potencializando o risco de intoxicação crônica na população.

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Escolhas alimentares saudáveis são um desafio na nossa sociedade frente ao marketing da indústria de alimentos e o paladar contemporâneo construído associado diretamente a alimentos ultraprocessados. Tem-se o ideal de que às condições financeiras favoráveis estão diretamente relacionadas a escolhas melhores e mais ricas do ponto de vista do valor nutritivo. Todavia, o consumo de produtos diet e light por esse público tendo-se a perspectiva de mais saúde é enganosa do ponto de vista de aditivos potencialmente presentes. Segundo a POF 2017-2018, há o rendimento familiar superior a 10 mil reais nesses produtos, pelo ideal de sofisticação e preço.

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1 de 3 Pesquisas da USP analisaram a presença de aditivos em uma série de alimentos e bebidas - Foto: Divulgação/ Esalq-USP

Pesquisas da USP analisaram a presença de aditivos em uma série de alimentos e bebidas - Foto: Divulgação/ Esalq-USP

Milhões de brasileiros consomem em excesso alimentos com corantes, conservadores e outros aditivos com potencial cancerígeno ou que podem causar outros danos à saúde, como reações alérgicas, doenças autoimunes ou hiperatividade. É o que mostram duas pesquisas da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalq/ USP), que estimaram a ingestão dessas substâncias pela população brasileira.

Os dois estudos foram orientados pela professora Marina Vieira da Silva, do departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição e utilizaram como base dados das Pesquisas de Orçamentos Familiares (POF) de 2008-2009 e de 2017-2018, do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE).

Uma das pesquisas, desenvolvida pela engenheira de alimentos Sílvia Panetta Nascimento, mostra que os aditivos identificados com maior frequência nos alimentos ultraprocessados consumidos no Brasil foram, em ordem decrescente, os conservadores sorbato de potássio e benzoato de sódio, seguidos pelos corantes amarelo crepúsculo, tartrazina e vermelho 40.

"Embora o uso dos aditivos seja regulamentado pelas organizações de saúde, alguns estudos têm demonstrado efeitos adversos à saúde causados pelo consumo de alguns corantes artificiais e conservadores", aponta a pesquisadora.

No caso do sorbato de potássio, Silvia lembra que, por não interferir nas características sensoriais do alimento e apresentar baixa toxicidade, o conservador é aprovado para uso em todas as categorias de alimentos. "No entanto, foram descritas alergias na forma de urticárias em indivíduos predispostos".

Sobre o benzoato de sódio, a autora do estudo reforça que, apesar de apresentar baixa toxicidade, há relatos de quadros de alergia e hiperatividade.

"O benzoato de sódio é usado principalmente em alimentos ácidos, como refrigerantes e sucos, o que pode ser um problema, já que, quando associado ao ácido ascórbico, presente em muitos desses produtos (refrigerantes e sucos), ocorre formação de benzeno, um composto evidenciado como cancerígeno", alerta.

Sílvia aponta outros índices preocupantes detectados pela pesquisa. "O consumo acima do limite máximo para alguns aditivos, como os corantes eritrosina e vermelho 40 e os conservadores benzoato e metabissulfito de sódio, e a maior frequência de consumo de corantes entre os adolescentes são pontos importantes a serem destacados", cita. Alguns estudos associam o consumo de vermelho 40 a casos de hiperatividade em crianças.

2 de 3 Pesquisa aponta que associação entre dois ingredientes que podem ser encontrados no refrigerantes pode causar câncer - Foto: Danielle Oliveira/G1

Pesquisa aponta que associação entre dois ingredientes que podem ser encontrados no refrigerantes pode causar câncer - Foto: Danielle Oliveira/G1

No caso do metabissulfito de sódio, o produto é muito utilizado em produtos de panificação e biscoitos. "O uso dos sulfitos é amplamente questionado por haver relatos desta classe de substâncias provocar efeitos adversos em indivíduos alérgicos e asmáticos, somado ao fato de seu uso levar a perdas da vitamina B1", explica Silvia.

Consumo superior a limite determinado

Segundo estudo conduzido pela nutricionista Claudia Simone Cavassani, na POF 2008-2009, a proporção de pessoas cujo consumo estimado do corante caramelo IV - utilizado para coloração de bebidas, confeitarias, balas e outros - foi superior ao limite determinado por lei e somou quase 13 milhões de pessoas.

Já a ingestão de nitrito, substância empregada na produção de embutidos e enlatados, está acima do recomendado na alimentação de mais de 55 milhões de brasileiros, de acordo com a pesquisa

"No caso da POF 2017-2018, percebemos uma redução na proporção de pessoas cuja ingestão superou a ingestão diária aceitável para caramelo IV e nitrito. Por outro lado, nota-se um aumento no caso do nitrato".

Essas substâncias, presentes respectivamente em refrigerantes e lanches gordurosos, afetam sensivelmente crianças e adolescentes na faixa de 10 a 13 anos, diz a pesquisa. Também segundo a POF 2008-2009, em média 30% das crianças brasileiras estavam acima do peso.

"Este histórico, provavelmente, teve grande contribuição no consumo de alimentos ultraprocessados, fonte das análises desta pesquisa, sobretudo estimulado pela exposição às propagandas publicitárias, já que mais de dois terços dos anúncios televisivos sobre alimentos são direcionados às crianças e adolescentes, incentivando o consumo regular e em grande quantidade de produtos de redes de fast food, salgadinhos, refrigerantes", analisa Claudia Cavassani.

3 de 3 Pesquisadora cita incentivo publicitário ao consumo de fast food - Foto: Paul J. Richards / AFP

Pesquisadora cita incentivo publicitário ao consumo de fast food - Foto: Paul J. Richards / AFP

Também presentes nos diets e lights

Outro ponto para o qual o estudo chama atenção é a ingestão de aspartame e ciclamato, presentes na linha de produtos diet e light. Neste caso, a POF 2017-2018 destaca reflexo direto no grupo com rendimento familiar igual ou superior a R$ 10 mil, já que são alimentos mais sofisticados e caros.

"É conhecido que condições financeiras favoráveis possibilitam escolhas alimentares mais variadas e ricas nutricionalmente, mas também há maior aquisição de alimentos industrializados e refeições prontas, como ocorre com produtos diet e light, potencialmente adicionados das substâncias", complementa a pesquisadora.

De acordo com a nutricionista, estimar a ingestão dessas substâncias potencialmente cancerígenas possibilita identificar grupos vulneráveis da população brasileira.

"Estimar a prevalência de exposição ao risco para desenvolvimento de câncer e fornecer possibilidades de identificação dos estágios iniciais do problema pode potencializar os efeitos de intervenções que visem melhorias da situação. Com a rotina cada vez mais acelerada, a sociedade precisa que a indústria alimentícia atue na fabricação de alimentos pouco processados, nutritivos e saborosos", sugere.

"Os resultados obtidos poderão direcionar pesquisas futuras e oferecer dados para as necessárias atualizações das regulamentações referentes aos aditivos alimentares e aos alimentos ultraprocessados envolvidos, bem como para a adoção de políticas públicas voltadas à qualidade e segurança dos alimentos", afirma Silvia Nascimento.

VÍDEOS: Veja reportagens sobre a região

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Estudos da USP de Piracicaba apontam excesso de consumo de aditivos com potencial cancerígeno em alimentos

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Pesquisas da USP analisaram a presença de aditivos em uma série de alimentos e bebidas - Foto: Divulgação/ Esalq-USP Milhões de brasileiros consomem em excesso alimentos com corantes, conservadores e outros aditivos com potencial cancerígeno ou que podem causar outros danos à saúde, como reações alérgicas, doenças autoimunes ou hiperatividade.

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Em sala foi discutido principalmente a contaminação por HPA's em alimentos que passam por processo de grelha, defumação, e aqueles com alto índice de gorduras. O artigo trás outras possibilidades, discutindo a contaminação da cana de açúcar por HPA's devido à queima das lavouras, que é significativa, apesar de atenuada durante o processamento para produção de derivados da cana.

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Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos formados a partir da queima incompleta de material orgânico e compreendem uma importante classe de contaminantes ambientais, muitos deles comprovadamente carcinogênicos. No presente estudo, amostras de caldo de cana-de-açúcar colhida verde e cana colhida queimada e produtos intermediários e finais do processo de obtenção do açúcar de cana foram analisados para a presença de 5 HPAs carcinogênicos. Para a análise dos compostos foi utilizada a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector de fluorescência. Os resultados obtidos evidenciaram a presença de HPAs em níveis relativamente maiores nos caldos obtidos da cana queimada, o que confirma que a queima dos canaviais é fonte de emissão de HPAs que podem ser transferidos para a cana-de-açúcar. A análise dos produtos intermediários do processamento da cana evidenciou uma redução dos níveis de HPAs conforme a cana-de-açúcar passa pelas diferentes etapas de processamento para obtenção de açúcar (caldo misto, caldo decantado, xarope, massa de primeira e açúcar), indicando um efeito positivo das etapas de clarificação, flotação e turbinagem na redução dos níveis desses compostos no produto final.

hidrocarbonetos policíclicos aromáticos; cana-de-açúcar; processamento; açúcar; CLAE

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a large class of environment contaminants formed during incomplete combustion or pyrolysis of organic matter. Many of these compounds are considered clearly carcinogenic and genotoxic. In the present study, samples of sugar cane juice (produced with burnt and not-burnt sugar cane), intermediary products and by-products of the cane sugar industry were analysed for the presence of 5 PAHs. The analyses were carried out by HPLC with fluorescence detection. Results show relatively higher levels of PAHs in cane juice from burnt sugar cane samples. This confirms that the practice of burning sugar cane before harvest is a source of PAHs emission in the environment which may be transferred to the sugar cane. Analysis of intermediary products of the process shows a decrease in the levels of PAHs along the cane sugar process (cane juice, clarified cane juice, syrup and sugar). This indicates a positive effect of clarification, floatation and centrifugation steps on the PAHs levels reduction on the final product.

polycyclic aromatic hydrocarbons; sugar cane; sugar; process; HPLC

Efeito do processamento na contaminação de cana-de-açúcar e derivados por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

Effect of the process on the contamination of sugar cane and its by-products by polycyclic aromatic hydrocarbons

Silvia Amélia Verdiani TfouniI, ; Silvia Helena Pereira VitorinoII; Maria Cecília de Figueiredo ToledoII

ICentro de Química de Alimentos e Nutrição Aplicada, Instituto de Tecnologia de Alimentos – ITAL, Av Brasil, 2880, Jardim Chapadão, CP 139, CEP 13070-178, Campinas - SP, Brasil, E-mail: tfouni@ital.sp.gov.br

II Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, CP 6121, CEP 13083-970, Campinas - SP, Brasil

RESUMO

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos formados a partir da queima incompleta de material orgânico e compreendem uma importante classe de contaminantes ambientais, muitos deles comprovadamente carcinogênicos. No presente estudo, amostras de caldo de cana-de-açúcar colhida verde e cana colhida queimada e produtos intermediários e finais do processo de obtenção do açúcar de cana foram analisados para a presença de 5 HPAs carcinogênicos. Para a análise dos compostos foi utilizada a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector de fluorescência. Os resultados obtidos evidenciaram a presença de HPAs em níveis relativamente maiores nos caldos obtidos da cana queimada, o que confirma que a queima dos canaviais é fonte de emissão de HPAs que podem ser transferidos para a cana-de-açúcar. A análise dos produtos intermediários do processamento da cana evidenciou uma redução dos níveis de HPAs conforme a cana-de-açúcar passa pelas diferentes etapas de processamento para obtenção de açúcar (caldo misto, caldo decantado, xarope, massa de primeira e açúcar), indicando um efeito positivo das etapas de clarificação, flotação e turbinagem na redução dos níveis desses compostos no produto final.

Palavras-chave: hidrocarbonetos policíclicos aromáticos; cana-de-açúcar; processamento; açúcar; CLAE.

ABSTRACT

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) constitute a large class of environment contaminants formed during incomplete combustion or pyrolysis of organic matter. Many of these compounds are considered clearly carcinogenic and genotoxic. In the present study, samples of sugar cane juice (produced with burnt and not-burnt sugar cane), intermediary products and by-products of the cane sugar industry were analysed for the presence of 5 PAHs. The analyses were carried out by HPLC with fluorescence detection. Results show relatively higher levels of PAHs in cane juice from burnt sugar cane samples. This confirms that the practice of burning sugar cane before harvest is a source of PAHs emission in the environment which may be transferred to the sugar cane. Analysis of intermediary products of the process shows a decrease in the levels of PAHs along the cane sugar process (cane juice, clarified cane juice, syrup and sugar). This indicates a positive effect of clarification, floatation and centrifugation steps on the PAHs levels reduction on the final product.

Keywords: polycyclic aromatic hydrocarbons; sugar cane; sugar; process; HPLC.

1 Introdução

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) constituem uma ampla classe de compostos formados a partir da queima incompleta de material orgânico e são considerados importantes contaminantes ambientais. Estes compostos têm sido muito estudados nos últimos anos devido ao fato de muitos deles serem potencialmente carcinogênicos 35,36. O JECFA (Comitê Conjunto FAO/OMS de Peritos em Aditivos Alimentares), durante sua 64ª reunião, realizada em 2005, avaliou toxicologicamente o grupo dos HPAs e concluiu que 13 desses compostos são claramente carcinogênicos e genotóxicos, incluindo os 5 selecionados para o presente estudo ³⁶.

A presença de HPAs em alimentos deve-se principalmente à sua formação durante certos tipos de processamentos como defumação, torrefação e secagem direta com madeira, à poluição do ar e da água e à sua presença em solos terrestres e marinhos ³⁵. Assim, os HPAs têm sido encontrados nas mais diferentes categorias de alimentos, incluindo produtos como óleos vegetais, margarinas, maionese, produtos lácteos, frutas, vegetais, produtos defumados, chá, café, açúcar, cereais, água, alimentos de origem marinha, alimentos grelhados, entre outros. Os estudos publicados reportam a presença de diferentes HPAs em variados níveis de contaminação, indicando que não há um perfil padrão de contaminação por estes compostos 3, 6-11,13,15,18-20,26,27,32,37.

No Brasil, a produção de açúcar utiliza como matéria-prima a cana-de-açúcar, cuja colheita é feita principalmente após a queima dos canaviais. Este recurso é utilizado para eliminar a palha e a ponteira da cana e facilitar a colheita manual, permitindo um maior acesso à cultura. Além disso, protege os cortadores de cana de folhas afiadas, insetos e cobras e aumenta o teor de açúcar devido à evaporação da água 12,14,26,38. Ao mesmo tempo, a prática da queima dos canaviais antes da colheita introduz partículas de palhiço queimado na atmosfera, assim como inúmeros compostos potencialmente tóxicos, entre eles os HPAs. Estes compostos podem contaminar a cana-de-açúcar e, conseqüentemente, os produtos obtidos de seu processamento 1,14,25,26.

O Brasil é o maior produtor mundial de cana e de açúcar, seguido pela Índia e a Austrália. O período de safra da cana é de maio a novembro na região Centro-Sul, e de setembro a março na Norte-Nordeste. Assim, portanto, produz-se cana no país o ano todo ³³. Na safra 2005/2006, as usinas do país processaram 386,5 milhões de toneladas de cana-de-açúcar, produzindo 25,8 milhões de toneladas de açúcar destinadas aos mercados interno e externo. No ano de 2005, foram exportados 18,1 milhões de toneladas de açúcar, sendo a Rússia o maior importador de açúcar brasileiro e responsável por 20% desse volume 24,33.

O processamento da cana-de-açúcar para a produção de açúcar segue basicamente as seguintes etapas ²¹⁻²³:

Colheita: a cana-de-açúcar pode ser colhida verde (sem queimar) ou queimada, manualmente ou mecanicamente, inteira ou picada;

Lavagem da cana (opcional) e preparo para moagem;

Moagem: formação do caldo misto;

Clarificação: limpeza do caldo. Envolve basicamente as etapas de sulfitação (adiciona-se SO

₂ (dióxido de enxofre) ao caldo), calagem (o caldo recebe leite de cal) e adição de compostos poliméricos de cadeia longa. O caldo é aquecido e ocorre decantação e conseqüente formação do caldo clarificado (ou decantado) que segue para a etapa de concentração. As impurezas são concentradas em um lodo que passa por um processo de filtração formando o caldo filtrado e a torta;

Evaporação: etapa de concentração do caldo com formação do xarope;

Flotação: etapa de limpeza com adição de compostos poliméricos de cadeia longa;

Cozimento: etapa de concentração com formação da massa cozida (mistura de sacarose e mel);

Turbinagem: o açúcar é separado do mel em turbinas;

Secagem/Resfriamento;

Acondicionamento (envase); e

Refino: o açúcar cristal produzido nas usinas pode ser utilizado diretamente pelas indústrias ou seguir para as refinarias, onde é dissolvido em água e sofre novamente todo o processo de flotação até a obtenção do açúcar refinado.

Os tipos de açúcar produzidos pelas usinas variam dependendo do tamanho dos cristais de sacarose, do grau de clarificação do açúcar, da polarização, entre outros, conforme exemplificado a seguir:

Açúcar cristal: Pode ser comercializado dessa forma ou enviado às refinarias para obtenção do açúcar refinado amorfo. A granulometria dos cristais pode variar de 0,6 a 0,7 mm.

Açúcar VHP (very high polarization) e VVHP (very very high polarization): Este açúcar é utilizado como matéria-prima nas refinarias sendo também um produto de exportação. A diferença entre o açúcar VHP e VVHP está na polarização mínima destes produtos, 99 e 99,6% respectivamente.

A literatura internacional não apresenta dados específicos sobre a contaminação de cana-de-açúcar ou de açúcar de cana por HPAs. No Brasil, ensaios preliminares sobre a presença de HPAs em cana-de-açúcar e derivados recomendaram a realização de estudos detalhados e dirigidos para os diversos produtos intermediários e finais do processamento da cana-de-açúcar ²⁶. Pesquisa mais recente, conduzida por CAMARGO ⁵, identificou a presença de HPAs em açúcar de cana, sendo este alimento considerado a segunda maior fonte de ingestão destes contaminantes pela população brasileira.

Em 1991, o JECFA recomendou a elaboração de estratégias por parte das indústrias e dos consumidores a fim de minimizar a exposição humana aos HPAs ³⁴ e, em 2005, recomendou algumas práticas para redução dos níveis de HPAs em alimentos durante processos de secagem e defumação. No presente está sendo elaborado, no Âmbito do Codex Alimentarius, um Código de Prática para a redução da contaminação de alimentos por HPAs ³⁶.

Em vista desta realidade, torna-se importante o estudo dos processos de obtenção do açúcar de cana identificando os prováveis pontos de contaminação, desde a colheita da cana até a obtenção do produto final. Também é necessário que seja estudada a influência de cada etapa do processamento da cana no nível inicial de contaminação, de forma a identificar as etapas que possam estar envolvidas com a eliminação e/ou redução dos níveis destes compostos e possibilitar que sejam recomendadas práticas que reduzam a presença de HPAs no produto final.

Desta forma, o objetivo do presente estudo é analisar o caldo de cana-de-açúcar verde e queimada e produtos intermediários e finais do processo de obtenção do açúcar de cana quanto à presença dos seguintes HPAs: benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a)pireno e dibenzo(ah)antraceno.

2 Material e métodos

2.1 Materiais

Amostras

Duas usinas de açúcar e álcool do Estado de São Paulo colaboraram com o estudo fornecendo as amostras necessárias, que foram coletadas no ano de 2004. Uma das usinas produz açúcar cristal branco como produto final (usina A) e a outra produz açúcar VHP (usina B).

O estudo foi conduzido em duas etapas. Em estudo preliminar, realizado para se delinear o plano de amostragem e conduzido junto à usina A no ano de 2003, foram coletadas amostras nos seguintes pontos do processamento: caldo misto, caldo sulfitado, caldo caleado, caldo decantado, xarope, massa de primeira e açúcar cristal. A coleta dessas amostras foi feita em 3 períodos de um mesmo dia de modo a verificar a existência de variação diária. Ao se verificar que não houve variação nos teores de HPAs durante um mesmo dia, foi estabelecido o plano de coleta a seguir.

Foram feitas 3 coletas de amostras durante a safra de 2004 (nos meses de junho, setembro e novembro) em vários pontos do processamento junto às duas usinas colaboradoras. Foram coletadas amostras dos seguintes produtos: caldo misto, caldo decantado, xarope e massa cozida. As usinas também forneceram 6 amostras, coletadas em diferentes épocas do ano de 2004, do seu produto final (açúcar cristal e açúcar VHP). Foram coletadas adicionalmente em uma das usinas, em épocas diferentes, 5 amostras de caldo de cana-de-açúcar colhida verde e queimada. Na Figura 1, apresenta-se um esquema simplificado da fabricação de açúcar, identificando-se as etapas amostradas.

Adicionalmente, na safra de 2005 foram coletadas apenas amostras de lodo, caldo filtrado e mel, os quais, no decorrer da pesquisa, foram identificados como importantes para interpretação dos resultados que estavam sendo obtidos.

Todas as amostras foram analisadas quanto à presença dos seguintes HPAs: benzo(a)antraceno (B(a)A), benzo(b)fluoranteno (B(b)F), benzo(k)fluoranteno (B(k)F), benzo(a)pireno (B(a)P) e dibenzo(ah)antraceno (D(ah)A).

Solventes e reagentes

Os padrões de B(a)A e D(ah)A foram adquiridos da Supelco Inc. e os demais foram obtidos da Aldrich Chemical Co. Os solventes e reagentes utilizados foram acetonitrila grau cromatográfico (JT Baker); cicloexano e dimetilformamida grau cromatográfico (Tedia Company Inc.); sulfato de sódio anidro; e sílica gel 60 (70-230 mesh, ASTM) da Merck AS Chemical Industries. A água utilizada foi obtida através de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore Co.).

2.2 Métodos

Extração e limpeza

A metodologia utilizada para extração dos HPAs das amostras foi baseada nos métodos de SPEER et al. ²⁸ e GRIMMER e BOHNKE ¹⁵. O método de extração utilizado variou de acordo com a amostra analisada, conforme descrito a seguir:

Lodo, caldo filtrado, mel e massa de primeira

As amostras foram homogeneizadas e pesadas (25 g) em erlenmeyer, adicionaram-se 100 mL de hidróxido de potássio metanólico (2 mol.L⁻¹), agitou-se por 60 minutos e deixou-se em descanso por uma noite. O material foi filtrado em funil de Buchner, transferido para um funil de separação e extraído com 2 porções de 100 mL de cicloexano. Juntaram-se as porções de cicloexano e lavou-se a fase orgânica, primeiramente, com 100 mL de metanol-água (1:1, v.v⁻¹) e, a seguir, com 100 mL de água.

Caldo misto, caldo decantado e xarope

As amostras foram homogeneizadas, pesadas (25 g) e transferidas para um funil de separação. O material foi extraído com 3 porções de cicloexano (50, 35 e 35 mL) e os extratos foram combinados.

Açúcar

Às amostras homogeneizadas e pesadas (25 g) foram adicionados 100 mL de cicloexano; a mistura foi homogeneizada por 1 minuto em um homogeneizador Turratec TF-102 (Tecnal) e, a seguir, foi deixada sob agitação por 60 minutos. O material foi filtrado e transferido para um funil de separação.

Para todas as amostras, após a etapa descrita acima, os HPAs foram extraídos sucessivamente do cicloexano com 3 porções de dimetilformamida-água (9:1, v.v⁻¹) (50, 25 e 25 mL). Adicionaram-se ao extrato combinado 100 mL de solução aquosa de sulfato de sódio 1%, e este foi re-extraído com 3 porções de cicloexano (50, 35 e 35 mL). Em seguida, foi feita uma lavagem com água, sendo a água residual removida com sulfato de sódio anidro. O extrato foi então concentrado em um evaporador rotativo a 40 °C.

Para a limpeza dos extratos, foi utilizada uma coluna de vidro empacotada com sílica gel (desativada com 15% água) e eluição do extrato com 85 mL de cicloexano. O volume foi recolhido em um balão de fundo redondo, concentrado em evaporador rotativo, seco sobre fluxo de nitrogênio e suspenso em 2 mL de acetonitrila para posterior injeção no cromatógrafo.

Análise cromatográfica

A análise dos HPAs foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência. Foi utilizado um sistema cromatográfico Waters composto de bomba quaternária modelo 600, degaseificador em linha, injetor automático modelo 717 e detector de fluorescência 474. Os dados foram adquiridos e processados através do software Millenium 32. Para a separação dos compostos foi empregada uma coluna C18 polimérica (Vydac 201 TP54, 25 cm, 4,6 mm d.i., partículas de 5 µm, estabilizada a 30 °C) e fase móvel composta por acetonitrila-água (75:25, v.v⁻¹) a um fluxo de 1 mL.min⁻¹. A detecção foi feita em comprimentos de onda de 290 nm (excitação) e 430 nm (emissão). O volume de injeção foi de 30 µL. Para a quantificação foi utilizado o método de padronização externa. A identidade dos compostos foi confirmada através da comparação dos tempos de retenção dos picos das amostras com os dos padrões e de co-cromatografia.

Recuperação

Foram realizados testes de recuperação nas diferentes matrizes analisadas. As amostras foram fortificadas com soluções padrão de HPAs em 3 diferentes concentrações. Os níveis de HPAs adicionados variaram de 0,3 a 3,0 µg.kg ⁻¹ nas amostras de açúcar cristal, caldo misto, caldo decantado, xarope e massa de primeira e de 3,0 a 20,0 µg.kg ⁻¹ nas amostras de lodo, caldo filtrado e mel. As análises foram feitas em duplicata, e os níveis de recuperação foram calculados a partir da diferença na concentração de HPAs, entre as amostras fortificadas e não fortificadas. A repetibilidade do método foi avaliada pelo coeficiente de variação (CV) associado às medidas de cada HPA durante os testes de recuperação. Os limites de detecção foram calculados de acordo com TAYLOR ²⁹.

Os resultados analíticos reportados não foram corrigidos em função da porcentagem de recuperação.

3 Resultados e discussão

As Tabelas 1 e 2 mostram os resultados dos testes de recuperação, seus respectivos coeficientes de variação e os limites de detecção para os 5 HPAs estudados nas diversas matrizes analisadas. Os valores médios de recuperação obtidos ficaram acima de 60,0%, com um coeficiente de variação máximo de 31,2%, valores que estão dentro dos limites aceitos para análise de contaminantes em níveis de µg.kg ⁻¹ 16,17.

A Tabela 3 apresenta os teores de HPAs nas amostras de caldo de cana colhida verde e queimada. Esses caldos apresentaram uma média da somatória dos HPAs estudados de 0,32 mg.kg ⁻¹ e 1,32 mg.kg ⁻¹, respectivamente, indicando que os níveis encontrados em caldo de cana queimada são até 4 vezes maiores que os encontrados no caldo de cana verde. A maior concentração de HPAs nos caldos obtidos de cana queimada evidencia que a queima dos canaviais é uma fonte de contaminação do caldo de cana e, conseqüentemente, do açúcar produzido a partir deste. Hipótese semelhante foi sugerida por SERRA et al. ²⁶, que não detectaram a presença de HPAs em cana verde, entretanto encontraram em cana queimada níveis de HPAs de até 1,55 mg.kg ⁻¹ (somatória dos níveis de benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno, fenantreno e naftaleno).

Os teores de HPAs encontrados nas amostras fornecidas pelas usinas A e B, referentes aos produtos intermediários e finais do processamento da cana-de-açúcar, estão apresentados na Tabela 4.

Apesar de o caldo misto da usina B apresentar uma contaminação inicial quatro vezes maior que o da usina A, a redução nos níveis de HPAs no decorrer do processo ocorreu em ambas as usinas. Considerando-se a etapa de clarificação, os níveis médios da somatória de HPAs presentes no caldo misto foram reduzidos em 52% (usina B) e 70% (usina A). O mesmo ocorreu nas etapas de flotação e turbinagem, nas quais a redução nos níveis de HPAs do xarope para a massa de primeira foi de 39% (usina B) e 70% (usina A), e a redução nos níveis de HPAs da massa de primeira para o açúcar foi de 43% (usina B) e 100% (usina A).

O fato de a redução nos níveis de contaminação ter sido maior no processamento da usina A provavelmente se deve ao fato de que esta usina, por ser produtora de açúcar cristal, faz uso de etapas de clarificação e flotação mais rigorosas (adição de maior quantidades de agentes clarificantes) do que a usina B, que é produtora de açúcar VHP. De qualquer forma, em ambos os processos ocorreu uma redução considerável na contaminação (de 89 a 100%). O açúcar VHP apresentou uma média da somatória dos HPAs de 0,36 µg.kg ⁻¹, enquanto que, no açúcar cristal, não foi detectada a presença dos HPAs nas amostras coletadas ao longo do ano de 2004. Isso reforça a teoria de um efeito positivo das etapas de clarificação e flotação na redução da contaminação de açúcar por HPAs. Essa possibilidade já havia sido considerada em trabalhos anteriores, nos quais a contaminação do açúcar refinado (que é submetido a dois processos de flotação) foi menor do que a de outros tipos de açúcar como o mascavo e o açúcar cristal comercial 26,30.

Ao se verificar que a clarificação e a turbinagem são importantes na eliminação dos HPAs, decidiu-se analisar os produtos residuais dessas etapas a fim de se verificar se houve transferência de HPAs para eles. Para tanto, foram analisadas amostras de lodo e caldo filtrado (produtos da decantação) e mel (produto da turbinagem) coletadas junto às duas usinas no ano de 2005. Conforme apresentado na Tabela 4, foram encontrados altos teores de HPAs nessas amostras, evidenciando uma transferência dos HPAs para esses resíduos, confirmando a teoria de que as etapas de clarificação e turbinagem levam a uma diminuição nos níveis de HPAs no produto final (açúcar).

Entre os resíduos do processo, o caldo filtrado e o mel retornam ao processamento para obtenção do açúcar. A torta, por sua vez, segue para os canaviais para ser utilizada como adubo. Apesar de este resíduo ter sido analisado no presente trabalho, a recuperação foi bastante baixa (30%), portanto os níveis encontrados não foram apresentados na Tabela 4 e, tampouco, considerados na discussão. Entretanto, tendo em vista os resultados encontrados para o lodo e o caldo filtrado, é de se esperar que a torta também apresente níveis elevados de HPAs. A presença de HPAs na torta pode levar à contaminação do solo onde ela será adicionada representando assim uma fonte adicional de contaminação para as culturas que venham a ser cultivadas no local.

Originalmente, o objetivo do trabalho era estudar isoladamente o processo de produção do açúcar a partir de cana verde e a partir de cana queimada. Entretanto, devido ao fato de o processo ser contínuo e a introdução da cana na moenda ocorrer de forma misturada (cana verde e queimada), conforme a chegada dos caminhões nas usinas, não foi possível analisar o processo dessa forma. Como a quantidade de cana queimada utilizada no processamento de um determinado produto é uma variável de difícil controle, isso pode explicar os diferentes níveis de HPAs encontrados em vários trabalhos a respeito da contaminação de produtos derivados da cana-de-açúcar, como açúcares e cachaças 2,7,30,31.

Apesar de existirem outras possíveis fontes de contaminação além da queima da cana (como, por exemplo, a água de lavagem da cana, a água de lavagem dos gases, a solda utilizada nas moendas e as incrustações de caldo nos trocadores de calor que queimam devido às altas temperaturas), o presente estudo evidenciou que o caldo, ao passar pelas etapas de clarificação, flotação e turbinagem tem os seus níveis de HPAs reduzidos, o que demonstra a eficiência dessas etapas na redução da contaminação no produto final.

4 Conclusões

Os resultados indicam que a prática da queima dos canaviais pode levar à contaminação do caldo de cana-de-açúcar por HPAs. Entretanto, a contaminação do caldo não significa que o produto final venha a apresentar níveis semelhantes de contaminação, uma vez que as diversas etapas de limpeza a que o caldo é submetido para obtenção do produto final (açúcar) são eficazes na redução e/ou eliminação desses contaminantes.

A literatura relata que outros produtos derivados de cana-de-açúcar, como cachaça, melado, açúcar refinado, açúcar mascavo e açúcar demerara também apresentam níveis variados de HPAs, e que os cortadores de cana estão altamente expostos aos HPAs no período de safra, devido à queima dos canaviais 2,4,7,30,31, identificando assim a necessidade de que seja conduzida uma avaliação integrada do risco à saúde humana por exposição aos HPAs originados na queima dos canaviais.

Para tanto, recomenda-se que os níveis de HPAs nos produtos derivados da cana, assim como no solo utilizado para o cultivo e no sangue e/ou urina dos trabalhadores rurais, sejam monitorados de modo a possibilitar ações que venham a reduzir a exposição humana a compostos com potencial carcinogênico.

Agradecimentos

Ao CNPq pela bolsa de doutorado e taxa de bancada (processo 141400/2002-1) e à FINEP/RECOPE.

Recebido para publicação em 22/2/2006

Aceito para publicação em 24/1/2007 (001676)

*

1. AZEVEDO, D. A.; SANTOS, C. T. M.; NETO, F. R. A. Identification and seasonal variation of atmospheric organic pollutants in Campos dos Goytacazes, Brazil. Atmospheric Environment, Amsterdam, v. 36, n. 14, p. 2383-2395, mai. 2002.

2. BETTIN, S. M.; FRANCO, D. W. Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) em aguardentes. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 25, n. 2, p. 234-238, abr/jun. 2005.

3. BIRKHOLZ, D. A.; COUTTS, R. T.; HRUDEY, S. E. Determination of polycyclic aromatic compounds in fish tissue. Journal of Chromatography A, Amsterdam, v. 449, p. 251-260, 1988.

4. BOSSO, R. M. V. Investigação de biomarcadores de suscetibilidade e de exposição ambiental em indivíduos ocupacionalmente expostos à queima de canaviais 106p. Tese (Doutor em Ciência Biológicas) Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista (UNESP), São José do Rio Preto, 2004.

5. CAMARGO, M. C. R. Avaliação da ingestão de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos através da dieta 267 p. Tese (Doutor em Ciência de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2001.

6. CAMARGO, M. S. F. O.; TOLEDO, M. C. F. Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em margarina, creme vegetal e maionese. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 20, n. 1, p. 51-55, abr. 2000.

7. CAMARGO, M. C. R.; TOLEDO, M. C. F. Avaliação da contaminação de diferentes grupos de alimentos por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Brazilian Journal of Food Technology, Campinas, v. 5, p. 19-26, 2002.

8. CAMARGO, M. C. R.; TOLEDO, M. C. F. Chá-mate e café como fontes de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAS) na dieta da população de Campinas. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 22, n. 1, p. 49-53, jan/abr. 2002.

9. CAMARGO, M. C. R.; TOLEDO, M. C. F. Polycyclic aromatic hydrocarbons in Brazilian vegetables and fruits. Food Control, Amsterdam, v. 14, n. 1, p. 49-53, jan. 2003.

10. CHEN, B. H.; WANG, C. Y.; CHIU, C. P. Evaluation of analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in meat products by liquid chromatography. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Columbus, v. 44, n. 8, p. 2244-2251, ago. 1996.

11. De VOS, R. H.; Van DOKKUM, W.; SCHOUTEN, A.; De JONG-BERKHOUT, P. Polycyclic aromatic hydrocarbons in Dutch total diet samples (1984-1986). Food and Chemical Toxicology, Amsterdam, v. 28, n. 4, p. 263-268, 1990.

12. FURTADO, F. Mecanização da colheita da cana traz benefício ambiental. Ciência Hoje on-line. Disponível em <http://cienciahoje.uol.com.br/controlPanel/materia/view/1382>. Acesso em: 05 abril 2005.

13. GARCIA-FALCÓN, M. S.; GONZÁLEZ-AMIGO, S.; LAGE-YUSTY, M. A.; SIMAL-LOZANO, J. Determination of benzo(a)pyrene in some Spanish commercial smoked products by HPLC-FL. Food Additives and Contaminants, London, v. 16, n. 1, p. 9-14, 1999.

14. GODOI, A. F. L.; RAVINDRA, K.; GODOI, R. H. M.; ANDRARDE, S. J.; SANTIAGO-SILVA, M.; VAECK, L. C.; GRIEKEN, R. V. Fast chromatographic determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in aerosol samples from sugar cane burning. Journal of Chromatography A, Amsterdam, v. 1027, n. 1/2, p. 49-53, fev. 2004.

15. GRIMMER, G.; BOHNKE, H. Polycyclic aromatic hydrocarbons profile of high protein foods, oil and fats by gas chromatography. Journal of Association of Official Analytical Chemists, Gaithersburg, v. 58, n. 4, p. 724-733, 1975.

16. HORWITZ, W.; KAMPS, L. R.; BOYER, K.W. Quality Assurance in the analyses of foods for trace constituents. Journal of Association of Official Analytical Chemists, Gaithersburg, v. 63, n. 6, p. 1344-1354, 1980.

17. JENKE, D. Chromatographic method validation: A review of current practices and procedures. II. Guidelines for primary validation parameters. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, London, v. 19, n. 5, p. 737-757, 1996.

18. KAYALI-SAYADI, M. N.; RUBIO-BARROSO, S.; -BECEIRO-ROLDAN, C.; POLO-DIEZ, L. M. Rapid determination of PAHs in drinking water samples using solid-phase extraction and HPLC with programmed fluorescence detection. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, London, v. 19, n. 19, p. 3135-3146, 1996.

19. KISHIKAWA, N.; WADA, M.; KURODA, N.; AKIYAMA, S.; NAKASHIMA, K. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in milk samples by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Amsterdam, v. 789, n. 2, p. 257-264, jun. 2003.

20. LAWRENCE, J. F. WEBER, D. F. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in Canadian samples of processed vegetables and dairy products by liquid chromatography with fluorescence detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Columbus, v. 32, n. 4, p. 794-797, jul. 1984.

21. MARAFANTE, L. J. Tecnologia da fabricação do álcool e do açúcar 1.ed. São Paulo: Ícone Editora Ltda., 1993. 148p.

22. MARTUCCI, E. T. Tecnologia do açúcar de cana 1.ed. Campinas: Fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia, 1983.

23. MASSON, N. P. M. Caracterização das fontes poluidoras na fase industrial de uma usina de açúcar e álcool e proposição de melhorias 52p. Monografia (Especialização em Gestão Ambiental) Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 1999.

24. PROCANA Ligado no dia a dia do setor. Disponível em: <http://www.procana.com.br/Conteudo/Conheca%20o%20Setor.asp>. Acesso em: abril 2005.

25. SANTOS, C. Y. M.; AZEVEDO, D. A.; AQUINO NETO, F. R. A. Selected organic compounds from biomass burning found in the atmospheric particulate matter over sugarcane plantation areas. Atmospheric Environment, Amsterdam, v. 36, n. 18, p. 3009-3019, jun. 2002.

[26] SERRA, G. E.; PUPIN, A. M.; TOLEDO, M. C. F. Ensaios preliminares sobre a contaminação da cana-de-açúcar e derivados por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Boletim da Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 29, n. 2, p. 134-137, 1995.

27. SIMKO, P. Review - Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked meat products and smoke flavouring food additives. Journal of Chromatography B, Amsterdam, v. 770, n. 1/2, p. 3-18, abr. 2002.

28. SPEER, K.; STEEG, E.; HORTSMANN, P.; KUHN, T.; MONTAG, A. Determination and distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in native vegetable oils, smoked fish products, mussels and oysters, and bream from the river Elbe. Journal of High Resolution Chromatography, Weinheim, v. 13, n. 2, p. 104-111, fev. 1990.

29. TAYLOR, J. K. Quality assurance of chemical measurements 1. ed. Chelsea: Lewis Publishers Inc., 1987. 352p.

30. TFOUNI, S. A. V.; TOLEDO, M. C. F. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in cane sugar. Food Control, Amsterdam, v. 18, n. 8, p. 948-952, ago. 2007.

31. TFOUNI, S. A. V.; MACHADO, R. M. D.; CAMARGO, M. C. R.; VITORINO, S. H. P.; VICENTE, E.; TOLEDO, M. C. F. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in cachaça by HPLC with fluorescence detection. Food Chemistry, Amsterdam, v. 101, n. 1, p. 334-338, 2007.

32. TOLEDO, M. C. F.; CAMARGO, M. S. F. O. Benzo(a)pireno em óleos de milho produzidos e comercializados no Brasil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 18, n. 1, p. 73-76, jan/abr. 1998.

³³

UNICA - União da Agroindústria Canavieira de São Paulo. Disponível em: <http://www.unica.com.br/pages/unica_perfil1.asp>. Acesso em: abril 2005.

³⁴

WHO - World Health Organization. Toxicological evaluation of certain food additives and contaminants (37 th report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives). Technical Report Series, Geneva, n. 28, 1991.

35. WHO World Health Organization. Selected non-heterocyclic polycyclic aromatic hydrocarbons. Environmental Health Criteria, Geneva, n. 202, 1998.

³⁶

WHO - World Health Organization. Rome. Summary and conclusions of the sixty-fourth meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives 2005. 47p.

37. YABIKU, H. Y.; MARTINS, M.; TAKAHASHI, M. Y. Levels of benzo(a)pyrene and others of polycyclic aromatic hydrocarbons in liquid smoke flavour and some smoked foods. Food Additives and Contaminants, London, v. 10, n. 4, p. 339-405, 1993.

38. ZAMPERLINI, G. C. M.; SANTIAGO-SILVA, M.; VILEGAS, W. Solid-phase extraction of sugar cane soot extract for analysis by gas chromatography with flame ionisation and mass spectrometric detection. Journal of Chromatography A, Amsterdam, v. 889, n. 1/2, p. 281-286, ago. 2000.

* A quem a correspondência deve ser enviada

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Efeito do processamento na contaminação de cana-de-açúcar e derivados por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

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Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos formados a partir da queima incompleta de material orgânico e compreendem uma importante classe de contaminantes ambientais, muitos deles comprovadamente carcinogênicos. No presente estudo, amostras de caldo de cana-de-açúcar colhida verde e cana colhida queimada e produtos intermediários e finais do processo de obtenção do açúcar de cana foram analisados para a presença de 5 HPAs carcinogênicos.

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Identificação molecular de Aspergillus spp. isolados de grãos de café

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Identificação molecular de Aspergillus spp. isolados de grãos de café

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GENETICS AND PLANT BREEDING

Molecular identification of Aspergillus spp. isolated from coffee beans

Identificação molecular de Aspergillus spp. isolados de grãos de café

Marciane MagnaniI; Thiago FernandesII; Cássio Egidio Cavenaghi PreteIII; Martin HomechimIII; Elisabete Yurie Sataque OnoI; Laurival Antonio Vilas-BoasII; Daniele SartoriII; Márcia Cristina FurlanetoIV; Maria Helena Pelegrinelli FungaroII,

I UEL - Departamento de Bioquímica, C.P. 6001 - 86051-990 - Londrina, PR - Brasil

II UEL - Depto. de Biologia Geral

III UEL - Depto. de Agronomia

IV UEL - Depto. de Microbiologia

ABSTRACT

Some species belonging to the genus Aspergillus are potential producers of ochratoxin A (OA), a mycotoxin with nephrotoxic, immunosuppressive, teratogenic and carcinogenic effects. The aim of the present study was to identify the species of Aspergillus that contaminate the inside of coffee beans collected in the stage of maturation and drying, from 16 producing areas located in the northern region of the State of Paraná, in the South of Brazil. A total of 108 isolates of Aspergillus spp. was identified at the species level, by sequencing the internal transcribed spacer (ITS1-5.8S-ITS2) of ribosomal DNA (rDNA). The results revealed the presence of potentially ochratoxigenic species in 82% of the geographic regions studied, among which Aspergillus niger was the species most frequently detected, followed by A. ochraceus and A. carbonarius. The presence of A. carbonarius in immature coffee fruits harvested from trees is reported for the first time.

Key words: ITS, ribosomal DNA, ochratoxin, mycotoxin

RESUMO

Algumas espécies pertencentes ao gênero Aspergillus possuem potencial para produção de Ocratoxina A (OA), uma micotoxina de efeitos nefrotóxicos, imunossupressivos, teratogênicos e carcinogênicos. Com o objetivo de identificar as espécies de Aspergillus que contaminam o interior de grãos de café, foram coletadas amostras em diferentes estádios de maturação do produto, em 16 propriedades produtoras do norte do estado do Paraná. Um total de 108 isolados de Aspergillus spp. foram identificados ao nível de espécie, pelo sequenciamento dos espaços internos transcritos (ITS1-5,8S-ITS2) do DNA ribossomal (rDNA). Os resultados revelaram a presença de espécies potencialmente ocratoxigênicas em 82% das regiões analisadas, sendo dentre estas, Aspergillus niger a espécie mais freqüentemente detectada,seguida por A. ochraceus, e A. carbonarius. É relatada pela primeira vez a presença de A. carbonarius em frutos de café coletados na árvore.

Palavras-chave: ITS, DNA ribossomal, ocratoxina, micotoxina

INTRODUCTION

The ochratoxin A (OA) is the mycotoxin of greatest significance found in coffee beans and beverage. The presence of OA in coffee was first reported by Levi et al. (1974) followed by several other studies (Abarca et al., 1994; Moss 1996; Bucheli et al., 1998; Batista et al., 2003; Taniwaki et al., 2003).

The presence of this mycotoxin in food has been considered a worldwide problem in public health. In countries with tropical climates, species of Aspergillus have been the main ones responsible for the production of OA in coffee (Taniwaki et al., 2003). Based on this, studies aimed at identifying the species of Aspergillus that contaminate coffee and that are potential OA producers have become of great importance in the last decade.

The identification of fungal species by classic taxonomy is based mainly on the use of morphological markers. However, the number of these markers available is generally low, which makes difficult the classification and/or identification of related species. The development of molecular biology techniques for the genetic differentiation of species has resulted in substantial advances in taxonomy due to their sensitivity and specificity. The amplification of internal transcribed spacer (ITS1-5.8S-ITS2) of ribosomal DNA (rDNA) by the polymerase chain reaction (PCR) (Mullis & Faloona, 1987), combined with sequencing of the amplicon and analysis of similarity between the sequences obtained and those already deposited in the gene bank, has been frequently employed for identification of fungal species. Despite this, no studies have been published using molecular approaches for the identification of Aspergillus spp. in coffee beans.

The aim of the present study was to isolate and identify, by sequencing of the ITS regions, Aspergillus spp. that contaminate the inside of coffee beans, produced in the northern region of the State of Parana, in the South of Brazil.

MATERIAL AND METHODS

Material - Samples of coffee ( Coffea arabica) at different stages of maturation (immature fruits from trees, cherries from the drying yard and overripe cherries from soil) and from storage in barns were obtained from 16 coffee properties in northern region of state of Paraná, in the south region of Brazil. The sampling consisted of a random collection of 1 kg coffee beans. After external disinfecting of the beans with 1% solution of sodium hypochlorite, 200 beans were submitted to a Blotter test (Neergard, 1979) to expose the fungi. The differentiation of Aspergillus from other genera uncovered was conducted according to Pitt & Hocking (1997). A total of 108 isolates of Aspergillus spp. were purified for molecular identification at the species level. These isolates were coded as indicated in Table 1.

Extraction of genomic DNA - Conidia of each isolate was inoculated in liquid medium (Pontecorvo et al., 1953) and incubated at 28ºC, for 24 h, at 180 rpm. Genomic DNA was extracted according to Azevedo et al. (2000) and quantified by a fluorimetric method (Dyna Quant, Phamarcia).

PCR of ITS region - Fragments of the ITS1-5.8S-ITS2 were amplified by the use of the primers ITS1 and ITS4 (White et al., 1990). The final volume of each reaction was 25 mL, containing 2.5 mL of buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,4 - 500 mM KCl, 1x concentrated), 2.0 mL of dNTPs (2.5 mM), 1.5 mL of each of the primers ITS1 and ITS4 (Invitrogen 10 pmol mL⁻¹), 1.0 mL MgCl ₂ (50 mM), 0.2 mL Taq DNA polymerase (5 U mL⁻¹), 2 mL DNA (5 ng mL⁻¹) and 14.3 mL of distilled water. The reaction mixture was placed in a PTC-100 thermocycler (MJ Research, Inc.) programmed to conduct 35 cycles after an initial denaturation of 4 min at 92ºC. Each amplification cycle consisted of three steps: denaturation (92ºC, 40 s), annealing (55ºC, 1 min and 30 s) and elongation (72ºC, 2 min). Final elongation at 72ºC for 5 min was used. The amplified fragments were analyzed by gel electrophoresis in 1x TEB buffer according to Sambrook & Russel (2001). The 1% agarose gels were treated with ethidium bromide and the bands visualized under UV light.

Sequencing of the ITS region - The fragments of ITS1-5.8S-ITS2 amplified by PCR were sequenced according Sanger et al. (1977). The sequencing reaction was 10 mL, containing 2.0 mL of ITS4 primer (Invitrogen- 3.0 m mL⁻¹), 4.0 mL of premix of DYEnamic ET terminator (Amersham Biosciences) and 4.0 mL of the rDNA amplification product (100 ng mL⁻¹). The reaction was submitted to a Mastercycler thermocycler gradient (Eppendorf), programmed to perform 35 cycles after initial denaturation (95ºC, 2 min). Each cycle consisted of three steps: denaturation (95ºC, 1 min), annealing (55ºC, 1 min) and elongation (60ºC, 1 min). At the end of the cycles, there was a final elongation step (60ºC, 5 min). Sequencing was performed on a MegaBACE TM 1000 sequencer (Amersham Biosciences). The conditions for injection and electrophoresis were 2 Kv/60 s and 6 Kv/230 min, respectively.

Sequence analysis - The quality of the sequences was examined by Phred/Phrap/Consed package. For the identification of the isolates, the nucleotide sequences obtained were compared with those already deposited in the data bank of the National Center for Biotecnology and Information (NCBI), using BLAST search tool (Altschul et al., 1990). The identification of the species was determined based on the best score.

A. niger and A. tubingensis discrimination - The discrimination between the species A. niger and A. tubingensis was performed by RFLP analysis of rDNA in silico, by searching for the Rsa I restriction site (GT/AC at positions 295 and 303 bp) directly in the rDNA sequences of both species. The analysis was conducted with the aid of the programs Phred/Phrap/Consed and BioEdit (Hall, 1999).

RESULTS AND DISCUSSION

The amplification of the ITS1-5.8S-ITS2 region of rDNA for the 108 Aspergillus isolates, using the universal primers ITS1 and ITS4 (White et al., 1990) originated a fragment of approximately 600 bp. This result is in accordance to the literature (Henry et al., 2000). These authors found ITS1-5.8S-ITS2 amplicons of sizes varying between 565 and 613 bp.

Analysis of the nucleotide sequences of the amplified fragments allowed the identification of the isolates at the species level ( Table 2). The percentage of occurrence of each species among all Aspergillus identified is shown in Figure 1.

With the exception of A. tubingensis and A. carbonarius, the other species here identified have already been reported as contaminants of coffee samples from the state of Minas Gerais (Batista et al., 2003). According to these authors, among 155 isolates of Aspergillus identified by classical taxonomy, the species A. ochraceus, A. sulphureus, A. tamarii, A. niger and A. flavus represented 71% of the isolates. Despite A. sulphureus has been frequently detected in coffee produced in Minas Gerais, this species was not found in coffee samples from Paraná.

The isolates belonging to the section Nigri were detected in 93.75% of the geographical regions and represented 35% of the total Aspergillus spp. identified. Among the fungi of this section, 24% of the isolates were characterized as A. niger, 10% as A. tubingensis and 1% as A. carbonarius.

Currently, the presence of A. tubingensis in Brazilian coffee beans has not been described, probably because only classical taxonomy has been utilized, and it does not allow the discrimination of A. tubingensis from A. niger. These two species have a high morphological similarity and A. tubingensis was considered as a subspecies of A. niger. The utilization of molecular methods allowed a better distinction of the A. niger group until 1991 (Kusters-Van Someren et al., 1991; Varga et al., 1993; 1994; Accensi et al., 1999; 2001) and the classification of A. niger and A. tubingensis as distinct species.

In the present study, the distinction between A. niger and A. tubingensis was determined by RFLP analysis in silico. This analysis was based on the presence of the restriction site (at positions 295 and 303 bp) for the endonuclease RsaI (GT/AC) in ITS1 sequence from A. niger and its absence in A. tubingensis (Accensi et al., 1999). The correct discrimination between these species is relevant because A. niger has been reported as OA producer in coffee, while A. tubingensis is a non-producer species of this mycotoxin.

Varga et al. (2000) described that some non-ochratoxigenic strains of A. niger has potential to decompose OA, through the secretion of a carboxypeptidase that converts OA to ochratoxin a and phenylalanine. Since A. tubingensis is unable to produce OA its potential to to control this mycotoxin in coffee should be addressed.

Of all the Aspergillus spp. identified, 48% included the section Flavi represented by the species A. flavus/A. oryzae (31.5%) and A. tamarii (16.5%), which were detected in 75% of the geographical regions analyzed. Reports in the literature on the taxonomy of this section have been conflicting. According to Varga et al. (2003), the section Flavi includes the clades " A. flavus" and " A. tamarii," which includes respectively A. flavus/oryzae and A. tamarii. The comparison between A. flavus and A. oryzae, based on molecular approaches, has demonstrated that they have high genetic similarity (Kurtzman et al., 1986; Chang et al., 1991; Nikkuni et al., 1996). Nikkuni et al. (1998) studied the nucleotide sequence of rDNA from Aspergillus spp. and showed that this methodology did not allow the discrimination of the species A. flavus and A. oryzae. Identical findings were observed in the present study by analyzing the ITS1, 5.8S and ITS2 rDNA regions.

Although A. oryzae and A. tamarii belong to distinct clades of the section Flavi, Nikkuni et al. (1998) showed that these species differ in a single nucleotide and three gaps in the alignment of the ITS sequences. Although some isolates belonging to species of the section Flavi have potential to produce mycotoxins in cereal grains, none of them produce OA in coffee beans (Varga et al., 2003).

The species A. ochraceus (section Circundati) was detected in 44% of the geographical regions. Approximately 17% of the isolates here identified belong to this species ( Figure 1). This frequency is similar to that found by Batista et al. (2003) in coffee samples from Minas Gerais. According to Taniwaki et al. (2003), 75% of the isolates of A. ochraceus have potential for producing OA. Therefore, the presence of this species in coffee beans should be a warning for good practices for farming, particularly during drying and storage.

Aspergillus species that are potential producers of OA were found in 82% of the geographical regions examined. Among these, the species identified most frequently was A. niger, followed by A. ochraceus and A. carbonarius. An extensive study conducted by Taniwaki et al. (2003), in coffee beans (408 samples) from the states of São Paulo and Minas Gerais also showed A. niger as the most common species. Although A. niger was found at higher frequency than the other two species, only 3% of the isolates were capable of producing AO.

The A. carbonarius species is considered a potent producer of OA, since approximately 77% of its isolates are ochratoxigenic. Taniwaki et al. (2003) detected A. carbonarius in samples originated from drying and storage areas at São Paulo state. In the present study we demonstrated, for the first time, the presence of A. carbonarius in samples of fruit taken from trees. Recently, Fungaro et al. (2004) developed a specific marker for the detection of A. carbonarius in coffee beans. The use of this marker to determine the presence of this species in coffee beans is strongly recommended.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by grants and fellowships from Fundação Araucária, CNPq and CAPES. We thank Dr. Albert Leyva for his assistance in the preparation of the manuscript.

Received May 05, 2004

Accepted September 13, 2004

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Molecular identification of Aspergillus spp. isolated from coffee beans

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GENETICS AND PLANT BREEDING Molecular identification of Aspergillus spp. isolated from coffee beans Identificação molecular de Aspergillus spp. isolados de grãos de café Marciane MagnaniI ; Thiago FernandesII ; Cássio Egidio Cavenaghi PreteIII ; Martin HomechimIII ; Elisabete Yurie Sataque OnoI ; Laurival Antonio Vilas-BoasII ; Daniele SartoriII ; Márcia Cristina FurlanetoIV ; Maria Helena Pelegrinelli FungaroII, I UEL - Departamento de Bioquímica, C.P.