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ELABORADO POR: LAURA LIZET CALIXTO CARMONA

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EDITORIAL:

Bienvenidos a este mural de las Técnicas de la Biología Molecular. En este espacio, exploráremos las diferentes técnicas utilizadas en la biología molecular para el análisis y manipulación de ácidos nucleicos. Desde la purificación y análisis de ADN y ARN hasta la clonación de genes y la secuenciación, este mural te guiará a través de las herramientas y técnicas más importantes en este campo.

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Tecnicas de Biología Molecular - Carlos Villarroel

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1.-Métodos de purificación y análisis de ácidos nucleicos:

*Purificación de Ácidos Nucleicos

La purificación de ácidos nucleicos es esencial para obtener muestras limpias y libres de contaminantes que puedan interferir con análisis posteriores. Algunos métodos comunes incluyen:

Lisis Celular: Para liberar los ácidos nucleicos de las células, se utilizan detergentes y enzimas que rompen las membranas celulares y nucleares.

Extracción Fenólica/Cloroformo: Este método utiliza fenol y cloroformo para separar proteínas de los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se encuentran en la fase acuosa.

Precipitación con Alcohol: El etanol o isopropanol se utiliza para precipitar los ácidos nucleicos, los cuales se pueden recolectar mediante centrifugación.

Columnas de Sílica: Estas columnas unen selectivamente los ácidos nucleicos en presencia de ciertos buffers, permitiendo el lavado de contaminantes y la elución de ácidos nucleicos puros.

Métodos de Afinidad: Utilizan matrices con afinidad específica para los ácidos nucleicos, como columnas de poliacrilamida.

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2.-Técnicas de hibridación:

Las técnicas de hibridación son métodos utilizados en biología molecular para detectar y analizar secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) mediante el uso de sondas complementarias:

Southern Blot: Utiliza sondas de ADN para detectar secuencias específicas de ADN en una muestra. El ADN se separa por tamaño mediante electroforesis en gel, se transfiere a una membrana y se hibrida con la sonda marcada.

Northern Blot: Similar al Southern Blot, pero se utiliza para detectar ARN mensajero (ARNm) en lugar de ADN.

Hibridación In Situ (ISH): Detecta secuencias específicas de ADN o ARN dentro de células o tejidos, permitiendo la localización espacial de la expresión génica.

Hibridación de Ácidos Nucleicos Fluorescentes In Situ (FISH): Utiliza sondas fluorescentes para detectar y localizar secuencias específicas de ADN en cromosomas o células.

Hibridación en Solución: Detecta secuencias específicas de ADN o ARN en solución sin necesidad de separarlas por tamaño.

Citometría de Flujo: Utiliza sondas fluorescentes para analizar la expresión génica en células individuales.

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3.-Técnicas de clonación de genes (Tecnología del ADN recombinante):

La tecnología del ADN recombinante permite la inserción de genes de un organismo en otro, creando una molécula de ADN híbrido que puede ser replicada y expresada en el organismo huésped.

Aislamiento del Gen de Interés: Se utiliza una enzima de restricción para cortar el ADN en un punto específico, permitiendo la extracción del gen deseado.

Preparación del Vector: Un plásmido o un virus se prepara para aceptar el gen de interés. El vector también puede contener un marcador seleccionable, como resistencia a antibióticos1.

Inserción del Gen en el Vector: El gen de interés se inserta en el vector utilizando la enzima ligasa, que une los fragmentos de ADN.

Transformación del Organismo Huésped: El vector recombinante se introduce en el organismo huésped (por ejemplo, bacterias) mediante métodos como la electroporación o la transformación química.

Selección y Expresión del Gen: Las células que han incorporado el vector se seleccionan utilizando el marcador seleccionable y se inducen a expresar el gen de interés

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*Análisis de Ácidos Nucleicos:

Una vez purificados, los ácidos nucleicos se analizan mediante una variedad de técnicas para estudiar su cantidad, calidad, y secuencia. Los métodos más comunes incluyen:

Electroforesis en Gel: Utiliza un gel de agarosa o poliacrilamida para separar los ácidos nucleicos por tamaño. La tinción con bromuro de etidio o SYBR Green permite visualizar las bandas.

Espectrofotometría: Mide la absorbancia a 260 nm para cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos, mientras que las relaciones A260/A280 y A260/A230 indican la pureza.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): Amplifica segmentos específicos de ADN para su análisis. La RT-PCR se utiliza para amplificar ARN.

Secuenciación de ADN: Determina la secuencia de nucleótidos en un fragmento de ADN. Métodos comunes incluyen Sanger y secuenciación de próxima generación (NGS).

Northern Blotting: Analiza ARN mensajero específico mediante hibridación con sondas marcadas.

Southern Blotting: Detecta secuencias específicas de ADN mediante transferencia a una membrana y hibridación con sondas.

Microarrays: Analizan la expresión génica de miles de genes simultáneamente mediante hibridación con sondas de ADN en un chip.

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ELECTROFORESIS de ADN en GEL de AGAROSA [TEÓRICO y PRÁCTICO]

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4.-Técnicas de secuenciación:

La secuenciación de ADN es una técnica fundamental en biología molecular que permite determinar el orden de los nucleótidos en una molécula de ADN:

Secuenciación de Sanger: Desarrollada por Frederick Sanger, esta técnica utiliza dideoxinucleótidos terminadores marcados con fluorescencia para detener la síntesis de ADN y generar fragmentos de diferentes longitudes que se separan mediante electroforesis en gel.

Secuenciación de Illumina: También conocida como secuenciación de próxima generación (NGS), esta técnica permite la secuenciación masiva de fragmentos de ADN mediante la amplificación y detección de señales fluorescentes.

Secuenciación de Ion Torrent: Utiliza sensores de flujo para detectar los cambios en el pH que ocurren cuando se incorporan nucleótidos en una cadena de ADN en crecimiento.

Secuenciación de PacBio: Ofrece secuenciación de largo alcance mediante la detección de la interrupción de la corriente de iones durante la síntesis de ADN.

Secuenciación de Oxford Nanopore: Utiliza nanoporos para detectar los cambios en la corriente iónica a medida que los fragmentos de ADN pasan a través de ellos

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5.-Prueba de PCR en el diagnóstico de enfermedades:

La prueba de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica esencial en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas. Su capacidad para amplificar pequeñas cantidades de material genético la hace una herramienta poderosa para detectar la presencia de patógenos o mutaciones genéticas en muestras clínicas.

Proceso de PCR

1. Preparación de Muestras: Las muestras biológicas (por ejemplo, sangre, saliva, tejido) se recolectan y preparan para extraer el ADN o ARN.

2. Desnaturalización: La mezcla de reacción se calienta a aproximadamente 95°C para separar las hebras de ADN.

3. Hibridación (Anillamiento): Se reduce la temperatura (alrededor de 50-65°C) para permitir que los cebadores se unan a las secuencias complementarias en el ADN molde.

4. Extensión: La temperatura se incrementa a aproximadamente 72°C para que la ADN polimerasa añada nucleótidos a los cebadores, extendiendo las nuevas hebras de ADN.

5. Ciclos: Estos pasos (desnaturalización, hibridación y extensión) se repiten durante 20-40 ciclos, duplicando la cantidad de ADN objetivo en cada ciclo.

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La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se utiliza ampliamente en el diagnóstico de una variedad de enfermedades infecciosas y genéticas debido a su alta sensibilidad y especificidad. Se utiliza para:

Enfermedades Infecciosas:

COVID-19: La PCR se usa para detectar el ARN del virus SARS-CoV-2 en muestras nasofaríngeas y orofaríngeas.

VIH/SIDA: Se utiliza para cuantificar la carga viral y detectar infecciones en etapas tempranas.

Hepatitis B y C: Detecta y cuantifica el ADN o ARN viral, ayudando en el diagnóstico y monitoreo del tratamiento.

Tuberculosis: La PCR puede identificar rápidamente Mycobacterium tuberculosis en muestras respiratorias.

Infecciones de Transmisión Sexual (ITS): Se usa para detectar patógenos como Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae.

Virus del Papiloma Humano (VPH): Identifica y tipifica diferentes cepas del VPH en muestras cervicales.

Enfermedades Genéticas:

Fibrosis Quística: Detecta mutaciones específicas en el gen CFTR.

Anemia Falciforme: Identifica la mutación en el gen HBB que causa la enfermedad.

Enfermedades Hereditarias: Se usa para detectar diversas mutaciones genéticas, como las que causan la enfermedad de Huntington y la distrofia muscular de Duchenne.

Diagnóstico Prenatal: Permite identificar anomalías genéticas en fetos a partir de muestras de vellosidades coriónicas o líquido amniótico.

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