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Electroforesis en gel de agarosa -Para que es y sus pasos-

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Electroforesis en gel de agarosa -Para que es y sus pasos-

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La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las proteínas. A pesar de que la electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple y fácil, posee dotes de separación eficaces.

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El gel se fabrica disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón hirviente. A continuación, se deja enfriar la solución a 55°C y se vierte en un soporte, donde se solidifica. Se sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de electrodos que contiene solución tampón.

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¿Cómo se preparan las muestras para la electroforesis?

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¿Cómo se preparan las muestras para la electroforesis?

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Para preparar las muestras para la electroforesis, éstas se mezclan con componentes que les agregan densidad, como el glicerol o la sacarosa. Estos proporcionan a las muestras más densidad que la del tampón de electroforesis. Las muestras pueden entonces colocarse por medio de una micropipeta o pipeta de transferencia en las rendijas visibles en el gel con la ayuda de una plantilla. Por su densidad, las muestras se sumergen en la solución tampón y permanecen en los pocillos. El equipo de electroforesis se conecta a una fuente de corriente continua directa y se somete a tensión. Las moléculas cargadas contenidas en las muestras penetran en los capilares del gel. Las moléculas de carga neta negativa migran hacia el electrodo positivo del aparato de electroforesis (ánodo), mientras que las moléculas de carga neta positiva migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Dentro de ciertos márgenes, cuanto más fuerte sea el campo eléctrico, mas rápido migran las moléculas. El tampón sirve a la vez para conducir la electricidad y para controlar el pH. Efectivamente, el pH tiene una infl uencia sobre la carga y la estabilidad de las moléculas biológicas

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combina la tecnología de la documentación de geles con la capacidad de detectar una señal quimioluminiscente mediante una cámara CCD super-enfriada, el ChemiDoc XRS+ le permite documentar geles de proteínas teñidos con colorantes fluorescentes (p.e. Flamingo) y visibles (p.e. Coomasie) así como geles de ácidos nucleicos teñidos con bromuro de etidio o SYBR green y señales quimioluminiscentes.
Además tiene un software que permite que se puedan observar los geles y tomar fotos que también pueden ser editables para agregar contraste o nitidez, también se le puede añadir filtros para detectar fluorescencia en distintas longitudes de onda.
Por su parte el transiluminador permite observar el gel directamente, el gel tiene que teñirse primero para que después se puedan observar las bandas teñidas al estar expuesto a la luz UV, además en este equipo se pueden hacer cortes del mismo gel para diferentes aplicaciones.

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El gel debe colocarse con las muestras en dirección al cátodo, pues el ADN deberá migrar hacia el ánodo y de esa manera separar la muestra, es importante que para poder realizar la cuantificación se pueda colocar un marcador de peso molecular.
Cámara horizontal de electroforesis con los accesorios correspondientes (molde para hacer el gel, peine, cables para conectar a la fuente de alimentación) • Fuente de alimentación o de poder
Transiluminador (fuente de luz ultravioleta) • Equipo fotográfico que permita tomar fotos del gel

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El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente para la visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. El BrEt absorbe luz ultravioleta de λ ≈ 300 nm, y emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante la cual podemos observar la posición y cantidad relativa del ADN en el gel tras la electroforesis. La solución stock de BrEt se prepara a una concentración de 10 mg/ml en agua, y se conserva a temperatura ambiente o a 4°C en un tubo envuelto en papel de aluminio. Existen dos formas diferentes de realizar el teñido del ADN: 1. Preparar el gel con BrEt incorporado. 2. Teñir el gel una vez finalizada la electroforesis con una solución de BrEt. En ambos casos, la concentración final del BrEt en el gel o en la solución de teñido debe ser de 0.5 µg/ml.

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Como buffer de electroforesis y para la preparación del gel puede utilizarse opcionalmente TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El TAE tiene una menor capacidad de amortiguación que el TBE, y puede resultar en una acidificación del medio si la electroforesis se desarrolla durante un periodo muy prolongado, pero funciona muy bien con tiempos normales de electroforesis, además tiene una mayor capacidad de resolución que el TBE para tamaños grandes de ADN. Ambos suelen prepararse como soluciones concentradas, que pueden almacenarse a temperatura ambiente (previa esterilización en autoclave), éstas se diluyen con agua antes de cada electroforesis para lograr la concentración de uso: 1x para el TAE y 0.5x para el TBE.

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¿Para que es el marcador de peso molecular?

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¿Para que es el marcador de peso molecular?

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Es una mezcla de ADN con peso molecular conocido, se usa para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN. 

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El buffer de carga debe tener una alta densidad que permita que la muestra se introduzca en el pocillo del gel, además de colorantes que nos indiquen cuando debe detenerse la electroforesis. Existen varios tipos de buffers de carga, a continuación se detallan los dos más utilizados (la inclusión de xileno cianol es opcional) • Buffer de carga tipo I (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 40% sacarosa, en agua. Almacenar a 4°C. • Buffer de carga tipo II (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 30% glicerol, en agua. Almacenar a 4°C.

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Existen alternativas a la tinción con BrEt. El SYBR Gold (nombre comercial) es un colorante muy sensible con una elevada afinidad por el ADN, que puede detectar cantidades de tan sólo 20 pg de ADN. Se utiliza en una dilución 1/10 000 en agua para el teñido del gel tras la electroforesis. Su elevado precio hace que sólo sea recomendable su uso para la detección de cantidades muy pequeñas de ADN que no sean detectables mediante tinción con BrEt. Otros colorantes disponibles actualmente son el SYBR Green, también de alta sensibilidad, y el SYBR Safe, con una sensibilidad similar al BrEt pero menor capacidad mutagénica. Existen además toda una nueva gama de colorantes con diferentes propiedades para la tinción del ADN; compañías como Invitrogen han desarrollado un buen número de estos colorantes, con diferentes niveles de sensibilidad y destinados a diferentes aplicaciones.

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La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a mediados de los años 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus. Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas de ADN. Éste es exactamente el principio en que se basa la electroforesis de ácidos nucleicos. Sometidos a un campo eléctrico, la carga neta negativa del ADN y el ARN hará que estos se muevan en dirección al ánodo. Si se fuerza a los ácidos nucleicos a moverse a través de un gel formado por una malla tridimensional de un polímero como la agarosa, la fricción hará que las moléculas de mayor tamaño migren con más lentitud, mientras las de menor tamaño avanzan más en el gel, permitiendo que las diferentes moléculas se separen en función de su tamaño. 
Existen diferentes tipos de agarosa que se clasifican en función de la temperatura a la que se disuelven y solidifican. Las agarosas estándar se disuelven en el buffer a una temperatura de 90-95°C y solidifican a 35-45°C. Las agarosas de bajo punto de fusión se disuelven a unos 65°C y solidifican a 30-35°C. Existen además otros tipos, como las agarosas de alta fuerza de gel o las de baja viscosidad, que permiten respectivamente una mejor separación y un rango inferior del tamaño de las moléculas a separar. La concentración (p/v) de la agarosa es un parámetro de gran importancia pues determina el rango de tamaños en los que obtendremos una buena separación de los fragmentos de ADN.
TAE es un tampón ampliamente utilizado para aplicaciones de electroforesis en gel de agarosa que requieren una alta resolución y separación de ADN bicatenario de alto peso molecular.
La composición del buffer TAE 1X es Tris-acetato de 0,04 M,EDTA 1 mM, pH 8,0.
Ideal para recuperación de DNA y manipulaciones en gel
Baja fuerza iónica
Mejor resolución de grandes fragmentos de ADN:> 12Kb