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El 16 de noviembre de 1532, el triunfador de la guerra de sucesión incaica, Atahualpa, se encontró con los españoles en la plaza de Cajamarca. Pizarro le había invitado para entrevistarse con él, pero ello no era sino una argucia para tenderle una emboscada. Atahualpa todavía no se había coronado como Inca, hallándose precisamente en camino al Cuzco, donde planeaba ceñirse la mascapaicha o borla imperial. Previamente, había ordenado la matanza de los nobles u orejones cuzqueños afines a Huáscar, tarea que cumplieron sus generales quiteños Rumiñahui, Challcuchimac y Quisquis.​
Los españoles, con ayuda de los grupos étnicos opuestos a la dominación cuzqueña o simplemente opuestos a que Atahualpa fuera el gobernante en lugar de Huáscar, se apostaron de manera estratégica por toda la plaza de Cajamarca. Así, entró Atahualpa, llevado en andas, seguido por el curaca de Chincha, también en andas debido a su importante condición como aliado del imperio, con su enorme séquito y algunos guerreros, mientras que el grueso del ejército se quedó en las afueras de la ciudad. El sacerdote dominico Vicente de Valverde fue el portavoz de los españoles, que demandaron al Inca que se sometiera a la voluntad del Rey de España y se convirtiera al cristianismo, siguiendo la fórmula del Requerimiento. El diálogo que siguió ha sido narrado de forma diferente por los testigos. Según algunos cronistas, la reacción del Inca fue de sorpresa, curiosidad, indignación y desdén. Atahualpa exigió más precisiones, por lo que recibió de manos de Valverde un breviario, al que revisó minuciosamente. Al no encontrarle significado alguno, el Inca lo tiró al suelo. A una señal, los españoles atacaron al Inca y a su séquito, matando a centenares de indígenas. Tras esta matanza de Cajamarca, Atahualpa fue puesto en prisión, donde ofreció llenar una sala con objetos de oro y dos con objetos de plata, a cambio de su libertad, lo que los españoles, codiciosos, aceptaron.​
En 1533, los españoles, desconociendo la promesa de libertad que habían hecho a Atahualpa, lo sometieron a juicio, acusándolo de idolatría, poligamia, incesto, de haber asesinado a su hermano Huáscar y de tramar la muerte de los españoles. De la manera más arbitraria, el Inca fue condenado a la pena de estrangulamiento, que se cumplió en la noche del 26 de julio de 1533, en la plaza de Cajamarca,​ hecho que constituyó un detestable crimen que la misma corona española habría de condenar.

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Los españoles y sus aliados indígenas recorrieron el imperio hacia el sur, utilizando los magníficos caminos incaicos, siendo recibidos entusiastamente por los huancas en la ciudad de Jatun Xauxa (Jauja). Tras enfrentarse con éxito a las tropas atahualpistas, arribaron al Cuzco el 14 de noviembre de 1533, ciudad a la que sometieron al pillaje. Luego impusieron a Manco Inca (hijo de Huayna Cápac y uno de los pocos sobrevivientes de la matanza perpetrada por los atahualpistas) como nuevo gobernante de un imperio ya desmembrado. Esta inicial alianza de Manco Inca y otros nobles cuzqueños con los españoles, se entiende debido a que, probablemente, creyeron que estos eran un grupo étnico más llegado desde tierras lejanas y que a la larga los podrían someter cuando ya no los necesitaran. Esta élite no tenía forma de saber que a la larga el juego de favores con estos primeros invasores se les escaparía de las manos con la llegada de más españoles, por la desconfianza que se originaría entre ellos y de su falta de unión frente a una fuerza extranjera.

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Efectivamente, Manco Inca no tardó en enfrentarse a los españoles al darse cuenta de la verdadera entraña de estos invasores, muy ávidos de metales preciosos e inclinados a cometer villanías y a faltar la palabra empeñada. Así, en 1536 puso sitio al Cuzco, cercando a un grupo de españoles y sus aliados indígenas, y a la vez envió parte de su ejército, al mando de Titu Yupanqui, a sitiar la recientemente fundada población española de Lima, además de enviar una expedición "de castigo" contra los huancas por su "traición" al imperio. Tras meses de asedio, los españoles y sus aliados rompieron el cerco del Cuzco y tras tomar la fortaleza o templo de Saqsayhuamán recuperaron el control de la ciudad. Los ejércitos del inca que atacaban Lima, también se desbandaron (1538).​

De todos modos, la rebelión de Manco Inca constituyó una verdadera guerra de reconquista incaica, en la que perecieron unos dos mil españoles y muchos miles de indígenas de uno y otro bando, lo que prueba fehacientemente que la conquista española no había finalizado en Cajamarca en 1532. Hasta mediados del siglo XX, era tópico común sostener que los españoles, pese a su inferioridad numérica, habían triunfado gracias a su superioridad técnica, al uso de las armas de hierro y de los caballos o por el auxilio divino, pero este mito fue desmontado por el historiador peruano Juan José Vega, quien resaltó el importante papel cumplido por las etnias dominadas por los incas, como los huancas, los chachapoyas, los cañaris, quienes apoyaron en masa a los conquistadores españoles, siendo en realidad los verdaderos artífices de la victoria española.

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Al perder su autoridad y su imperio, Manco Inca se retiró a su reducto de Vilcabamba, en las selvas al norte del Cuzco. Allí, él y sus descendientes, conocidos como los incas de Vilcabamba, resistieron hasta 1572, año en que el último de ellos, Túpac Amaru I, fue finalmente capturado y trasladado al Cuzco, donde fue ejecutado.

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Sin embargo, el acontecimiento más importante de estos años es la dramática disminución de la población que se registró en los Andes Centrales. Durante los años de la Conquista y los primeros del régimen colonial, grandes epidemias (enfermedades traídas por los europeos para los que los andinos no tenían defensas naturales) asolaron la población de los Andes. Se cree que el mismo Huayna Cápac (y su primer heredero nombrado, Ninan Cuyuchi, cuya imprevista muerte habría desatado la guerra civil incaica) murieron de viruela. De hecho, los cronistas de la conquista (Cieza de León, por ejemplo, en su recorrido por la costa peruana) registran testimonios de un masivo despoblamiento de los territorios andinos. Algunos cálculos sugieren que la población andina habría sido de 9 millones antes de la invasión europea y que 100 años después solo era de 600 mil habitantes. A ello habría contribuido también una baja en la tasa de natalidad, producto de los profundos cambios sociales que caracterizaron la etapa siguiente.