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Transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET).

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Transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET).

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-Ocurre sólo cuando los fluoróforos reportero y extintor son muy
cerca uno del otro, lo que lleva a la detección de luz en el extintor
-Frecuencia de emisión cuando el reportero es estimulado por la luz de su frecuencia de excitación.

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Recibió el premio Nobel de Química por su intuición en 1993.

Pocos avances en las ciencias biológicas han tenido  el alcance y incluso el impacto de cambio de paradigma de la reacción en cadena de la polimerasa.
(PCR). Aunque existe evidencia de que los principios básicos subyacentes del método fueron comprendidos y de hecho utilizados en la práctica por un
pocas personas aisladas antes de 1983.
Crédito para independientes
conceptualizaciones de la tecnología madura y previsión de las solicitudes deben dirigirse a Kary Mullis.

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Reducir la Temperatura de fusión (Tm) de una reacción de PCR

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Reducir la Temperatura de fusión (Tm) de una reacción de PCR

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Esta técnica ha sido exitosa empleado para el descubrimiento de nuevas especies de virus.
También durante una clonación dirigida por PCR de un gen o región de interés planificada,
los desajustes en la secuencia del cebador y las Tm ligeramente reducidas pueden utilizarse para introducir mutaciones deseadas en un proceso llamado sitio-mutagénesis dirigida.

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Aplicaciones médicas como la detección de enfermedades infecciosas.
Agentes con sensibilidades, especificidades y velocidades mucho mayores que métodos alternativos.
Los biólogos han utilizado la PCR para amplificar el ADN de
muestras conservadas, como insectos encerrados en ámbar, millones de
años de edad, con posterior secuenciación y análisis filogenético, arrojando resultados fascinantes sobre la continuidad y evolución de la vida en
Tierra.
La sensibilidad a una sola molécula, esto tiene proporcionó a los forenses criminales herramientas lo suficientemente poderosas para identificar individuos a partir de ADN residual en la escena del crimen, evidencia tan pequeña como
colillas de cigarro, huellas dactilares borrosas o un solo cabello.

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La PCR es una técnica sencilla que se utiliza para crear múltiples copias de los fragmentos de ADN deseados.. RT PCR, en la otra mano, se utiliza para la amplificación de ARN. De lo contrario, qPCR participa en la cuantificación de los ácidos nucleicos en la muestra respectiva.

La plantilla inicial para PCR es ADN de doble cadena., mientras que RT PCR solo puede usar ARN como plantilla.

La PCR es una técnica con baja sensibilidad y especificidad.. A diferencia de, RT PCR y qPCR son muy sensibles y específicas.

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PCR: Para  la PCR convencional solo se necesita una DNA polimerasa, magnesio, nucleótidos, primers, el DNA molde que se desea amplificar y un termociclador.
RT-PCR:La PCR de transcripción inversa o RT-PCR, permite el uso de RNA como molde. Un paso adicional permite la detección y amplificación del RNA. El RNA se transcribe de forma inversa en DNA complementario (cDNA) utilizando una transcriptasa inversa. La calidad y pureza del RNA molde es esencial para el éxito de la RT-PCR.

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Las técnicas de punto final posteriores a la reacción incluyen electroforesis en gel y tinción con tinte especifico de ADN

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Ciclos de extensión del cebador impulsados ​​térmicamente donde
Los cebadores de polaridad opuesta tienen sitios de cebado cercanos en cada uno de
las dos hebras plantilla conducen a la producción exponencial del
secuencia corta definida de cebador a cebador (el “amplicón”).

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"Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa"

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"Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa"

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Detecta los productos de amplificación por PCR durante su síntesis, y es más sensible y cuantitativa que  PCR convencional.

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PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

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La reacción en cadena de la polimerasa permite el exponencial
amplificación de una secuencia deseada mediante el uso de cebadores que
recocer a la secuencia de interés.

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En general las reacciones de PCR se ejecutan con valores T cuidadosamente optimizados que maximizan la sensibilidad y la cinética de amplificación ,al tiempo que garantiza que los cebadores solo se hibriden con sus coincidencias exactas de hibridación.

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1.- INICIO
2.- DESNATURALIZACION
3.-ALINEAMIENTO O UNIÓN DEL CEBADOR
4.-EXTENSIÓN O ELONGACIÓN DE LA CADENA
5.-ELONGACIÓN FINAL
6.-CONSERVACIÓN

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La RT-PCR utiliza la transcriptasa inversa para convertir el ARN en
ADN para su uso en una reacción en cadena de la polimerasa.

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Video- Reacción en cadena de la polimerasa

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Video- Reacción en cadena de la polimerasa

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PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa (divulgación científica IQOG-CSIC)

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Hasta ahora se ha restringido  a la amplificación de una reacción o PCR  simple . Aunque  esta es la aplicación mas común ,es posible combinar  múltiples reacciones de PCR  independientes en  una sola reacción permitiendo que un experimento  consulte una muestra  única y diminuta  para la presencia ,ausencia o posiblemente  la cantidad de múltiples  secuencias  no relacionadas .

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Un último punto de interés para muchos estudiantes con respecto a la PCR es su consideración desde una perspectiva filosófica. En la práctica, el desempeño de este método ahora increíblemente generalizado requiere la uso de una polimerasa termoestable, como se indicó anteriormente. Estos polimerasas (de las cuales existen varias variedades) principalmente derivan de ADN polimerasas bacterianas identificadas originalmente en extremófilos que viven en aguas termales hirvientes y volcánicas de aguas profundas respiraderos térmicos.

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Alternativamente, las metodologías de PCR en tiempo real emplean alguna forma de detectar directamente la producción en curso de amplicones en el recipiente de reacción, más comúnmente mediante el monitoreo de una directa o cambio de fluorescencia indirecto vinculado a la producción de amplicones por métodos ópticos. Estos métodos permiten que el recipiente de reacción permanezca sellado durante todo el proceso. A diferencia de los métodos de punto final para cuya concentración final de ampliación tiene poca relación con concentración de plantilla inicial.