# data[].attributes.body
Alunos:

Bruna Barroso

Carlos Eduardo Faria

Manuela Pascoal

Maria Eduarda Vieira

Mateus Caixeta

Milena Resende

# data[].attributes.body
A eletroforese é uma técnica laboratorial simples, rápida e de grande poder informativo. Dentre suas principais aplicações atuais, destaca-se a determinação e caracterização de moléculas de ácidos nucléicos, tanto DNA como RNA, além de contribuir no campo da genética médica. Dessa forma, as vantagens se tornam muito claras, desde a facilidade na execução até a aplicação da técnica no SUS, como no diagnóstico da anemia falciforme e gamopatias monoclonais, por exemplo.

O gel de agarose envolvido na técnica é um polissacarídeo extraído de diversos gêneros de algas marinhas, que apresenta ampla capacidade de separação de proteínas. Pelo fato de poder ser facilmente preparado no laboratório, torna a técnica prática e de baixo custo, porém chama atenção o poder contaminante que o gel pode causar no meio ambiente, sendo uma característica considerada desvantagem da técnica.

A eletroforese consiste no fracionamento de proteínas presentes em diversos tipos de fluido, levando em consideração suas cargas elétricas e seu peso molecular. A mobilidade eletroforética está diretamente proporcional à carga da partícula e inversamente proporcional à viscosidade do meio.

Em função disso, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras, gerando diferentes bandas, representadas por albumina, globulinas alfa e beta e gama. As frações separadas são observadas a partir de um corante sensível a proteínas.

As moléculas com carga negativa migram para o polo positivo, as moléculas com carga positiva migram para o polo negativo e as que apresentam cargas elétricas equilibradas permanecerão estáticas. Em razão das proteínas serem capazes de adquirirem carga positiva ou negativa em função do pH, é indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de soluções-tampão.

# data[].attributes.body
A RFLP ( Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição) é uma técnica que combina PCR, enzima de restrição e eletroforese, visando obter um diagnóstico mais específico e, por consequência, um tratamento melhor para o paciente.

• Polimorfismo de DNA são variações na sequencial dos nucleotídeos, que não são necessariamente patógenas.

• Existem 3 principais tipos: polimorfismo de nucleotídeo único (troca as bases), ideal A (insere), ideal B (deleção).

• Composto por 7 etapas:

Isolar o DNA alvo (PCR)

Digestão (forma 2 extremidades na fita)

Eletroforese em gel

Transferência para membrana

Híbridação

Detecção

Análise de resultados

• Utiliza-se a técnica para diferenciação e reconhecimento de microorganismos, genotipagem (identificar cepas), teste de paternidade, identificar restos mortais e mutações, medicina baseada em genômica (eficácia de medicamentos e detecção de variantes que aumentam/diminuem riscos de transtornos)

• Usa-se também para diagnóstico de ANEMIA FALCIFORME, detectando uma alteração gênica de uma base A por T no códon B-hemoglobina (GAG -> GTG: ácido glutãmico -> valina)

• Algumas principais vantagens são que, o meio não influencia e equipamentos necessários estão presentes nos laboratórios. Já as desvantagens, é trabalhosa e necessita de mão de obra qualificada, usa-se grande quantidade de DNA, precisa de sondas específicas para a hibridização e é demorada e cara.

• Usa- se no SUA em exames de HIV, Hepatite C, HPV, Clamídia e Alzheimer.

• Usa- se na rede particular para identificação de micobactérias, hemocromatose, pneumovírus aviário do grupo A e B e pancreatite crônica.

# data[].attributes.body
O teste PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma ferramenta crucial na detecção de diversas doenças infecciosas, incluindo COVID-19. Ele envolve a amplificação de material genético específico do patógeno, geralmente o RNA viral no caso do COVID-19. Amostras são coletadas de secreções respiratórias, como swabs nasofaríngeos, e o RNA viral é extraído. Em seguida, ocorre a amplificação do material genético em múltiplos ciclos de aquecimento e resfriamento, permitindo a detecção do vírus, se presente.

As vantagens incluem alta sensibilidade, pois a PCR é capaz de detectar mesmo baixas quantidades de material genético viral, aumentando a precisão diagnóstica; especificidade, pois permite a detecção específica do material genético do vírus, reduzindo a chance de resultados falso-positivos; disponibilidade, visto que com o avanço da tecnologia o teste tornou-se disponível em laboratórios ao redor do mundo; e rapidez, através de novas técnicas, como PCR em tempo real, que permitiu resultados mais rápidos em comparação com métodos tradicionais de cultivo viral.

Por outro lado, as desvantagens incluem o tempo de processamento, que pode resultar em atrasos na obtenção de resultados; custos altos, que inclui equipamentos, reagentes e pessoal treinado, limitando o acesso em algumas regiões; possíveis falsos negativos, em casos de baixa carga viral ou amostragem inadequada, comprometendo a eficácia do diagnóstico e por fim infraestrutura especializada e pessoal treinado, o que pode ser uma limitação em áreas com recursos limitados.

Em suma, o teste PCR se logra muito eficaz na detecção de doenças infecciosas, proporcionando vantagens significativas em termos de sensibilidade e especificidade. No entanto, suas desvantagens, como custo e necessidade de infraestrutura especializada, destacam a importância contínua do desenvolvimento de novas tecnologias de diagnóstico.

# data[].attributes.body
Em 1999 foi publicada a primeira sequência de um cromossomo humano. Atualmente, o projeto Genoma Humano (iniciado em 1990) obteve o sequenciamento de todo o genoma humano numa tentativa de curar e prevenir patologias. Com isso, a relação genótipo-fenótipo mostrou-se heterogênea: muitas condições hereditárias com fenótipos que eram considerados idênticos são, na realidade, devidas a mutações em diferentes genes ou diferentes mutações no mesmo gene.

A técnica de sequenciamento consiste num procedimento laboratorial que utiliza métodos bioquímicos com a finalidade de identificar a sequência de bases de nucleotídeos em um DNA. É uma técnica feita por órgãos de pesquisa e os dados são públicos, utilizados para estudar a estrutura e a função dos genes, identificar variantes genéticas e entender como elas podem influenciar os fenótipos. A partir disso, pode-se dar o diagnóstico, o prognóstico ou o tratamento de câncer, doenças genéticas, dentre outros. Ao identificar mutações genéticas a partir da técnica, os médicos podem realizar um tratamento personalizado para o paciente de forma a ser mais eficaz e evitar reações adversas.

1)Método de Sanger: são preparados 4 tubos de reação de sequenciamento que correspondem a cada um dos nucleotídeos. Cada tubo contém o molde do DNA a ser sequenciado, primers, DNA-polimerase, os 4 trifosfatos de didesoxinucleotídeo, um trifosfato de didesoxinucleotídeo marcado por um corante fluorescente radioativo específico para cada tubo e um didesoxinucleotídeo que determina o fim da síntese da fita. Primeiramente extrai-se uma fita de DNA por desnaturação (fita molde), a qual será separada em 4 partes. Adiciona-se então um primer no início de cada uma para que a DNA-polimerase possa agir. Após isso, incorpora-se o didesoxinucleotídeo radioativo e interrompe-se a síntese, fazendo uma mistura de fragmentos de tamanhos distintos que serão separados por eletroforese. Por fim, um filme de raio-x irá identificar a sequência. Esse é o método mais utilizado devido a seu custo benefício. Atualmente o método é automatizado de forma que softwares são utilizados para converter fluorescência em cromatograma. Dessa forma, cada nucleotídeo terá sua cor.

2) Método Pirosequenciamento: esse método determina a ordem de nucleotídeos no DNA a partir da detecção da liberação de pirofosfato na incorporação dos nucleotídeos (sequenciamento por síntese). O DNA molde é imobilizado e a solução contendo os nucleotídeos é adicionada e removida após cada reação, sendo que a luz é produzida apenas quando a solução de nucleotídeos complementa a primeira base sem par da fita molde. A sequência dos sinais quimioluminescentes permite a determinação da sequência dos respectivos nucleotídeos complementares à fita molde.

3) Sequenciamento Ion Torrent: É uma metodologia de alto rendimento que permite o sequenciamento rápido dos pares de bases em amostras de DNA ou RNA. Nele, íons de hidrogênio são liberados quando um nucleotídeo se atribui a uma fita de DNA e sensores detectam essa reação e a alteração de PH.

4) Método Oxford Nanopore: apresentando 99% de confiança, a fita de DNA passa por um poro de proteína capaz de captar sinais elétricos.

Dentre as vantagens do sequenciamento cita-se: possibilitar a escolha do melhor tratamento para o paciente, conhecer as estruturas, funções e regulação do gene para desenvolver novas terapias, diagnósticos pré-natais e pré-sintomáticos de doenças genéticas, rastrear mutações e permitir a elaboração de medicamentos mais precisos.

Dentre as desvantagens tem-se que ainda não exite um catálogo completo dos genes, o aumento no número de abortos seletivos, o uso antiético das informações, o uso social como forma de discriminação e o alto custo.

O Sistema Único de Saúde autoriza a utilização desse método em doenças raras e, em 2020, foi feito um projeto de lei com proposta de realização de testes genéticos para prevenção, diagnóstico e tratamento de cânceres de mama e ovário no SUS.

# data[].attributes.attachment_caption
Exemplo de análise em um suposto teste de paternidade (inclusão de paternidade).

# data[].attributes.body
O teste de paternidade é uma ferramenta crucial para determinar a relação genética entre um suposto pai e uma criança. Com avanços na genética molecular, esses testes tornaram-se mais precisos, oferecendo respostas importantes para questões de filiação.

A técnica envolve a coleta de amostras de DNA do suposto pai, da criança e, às vezes, da mãe. Essas amostras podem ser coletadas através de swabs bucais ou de saliva. O DNA é então isolado das células coletadas e analisado para identificar marcadores genéticos específicos. A comparação dos perfis genéticos entre o suposto pai e a criança permite determinar a probabilidade de paternidade com alta precisão.

Marcadores com alto nível de polimorfismo, como o DNA minissatélite, são visualizados e especificamente analisados após a eletroforese. A partir disso, é feito a comparação já mencionada, indicando ou não maior probabilidade de parentesco.

As vantagens se baseiam na precisão extremamente alta, geralmente com uma margem de erro muito baixa; na coleta simples e não invasiva, envolvendo na maioria dos casos apenas um swab bucal; na confidencialidade, protegendo a privacidade dos envolvidos; e na resolução de questões legais, como custódia de crianças, pensão alimentícia e herança.

Em contrapartida, as desvantagens incluem o custo relativamente elevado do teste, especialmente se envolverem a participação de laboratórios certificados; a complexidade emocional com relação às partes envolvidas, especialmente se os resultados não forem conforme o esperado; o tempo de espera, podendo levar semanas para os resultados serem concluídos, o que pode ser angustiante para os envolvidos; e ainda assim, possibilidade de resultados inconclusivos, exigindo testes adicionais ou reconsideração dos métodos utilizados.

Apesar de todas as desvantagens citadas, os testes de paternidade oferecem uma maneira confiável de determinar a filiação biológica, fornecendo respostas importantes para questões familiares e legais. Com avanços contínuos na tecnologia genética, espera-se que esses testes se tornem ainda mais precisos e acessíveis no futuro.

# data[].attributes.headline
FISH (Hibridização in situ fluorescente)

# data[].attributes.subject
FISH (Hibridização in situ fluorescente)

# data[].attributes.body
A técnica:

- É o mapeamento de um gene por hibridização molecular de uma sequência de DNA, marcada por fluorescência, num cromossomo espalhado em lâmina. Esse procedimento de hibridização usado para o mapeamento consiste no pareamento entre uma sonda de DNA com fluorescência e o DNA estudado correspondente.

- Nesse pareamento, haverá ligações entre a sonda e a sequência alvo do DNA que serão detectadas pela fluorescência. Para detectá-las, deve ser usado um microscópio epifluorescente.

- É usada para uma hipótese diagnóstica prévia, pois identifica deleções, duplicações ou translocações.

- A técnica tem 11 etapas:

1) Fixação das Células ou Tecidos

2) Permeabilização

3) Marcação das Sondas

4) Hibridização

5) Lavagem

6) Montagem da lâmina

7) Contrarrótulo

8) Coloração nuclear

9) Microscopia de Fluorescência

10) Captura de imagens

11) Interpretação

Vantagens:

- Alta eficácia de hibridização e de detecção de anormalidades bem pequenas, sensibilidade e especificidade elevadas, permite a correlação direta entre aspecto citogenético e morfológico, diagnóstico de doenças cromossômicas minuciosas, não depende da fase de metáfase na análise e é uma técnica rápida ofertada pelo SUS.

Desvantagens:

- Utilização de um microscópio específico, necessidade de uma mão de obra especializada e qualificada, exame de alto custo, hipótese diagnóstica prévia e é preciso ter uma sonda sintetizada disponível para determinada anormalidade.

Aplicação do método FISH:

- O FISH pode ser usado para identificar leucemias crônicas (mieloide e linfocítica), câncer de mama (amplificações do HER2 podem ser identificadas pelo FISH), alterações estruturais dos cromossomos (pré-natal) e pode ser usado no processo de fertilização in vitro.

# data[].attributes.body
O teste do pezinho mais conhecido como triagem neonatal. É um conjunto de ações preventivas que tem como objetivo identificar precocemente doenças metabólicas, enzimáticas, genéticas e endocrinológicas, ele é realizado entre o 3 e 5 dia do recém nascido.

Metodologia : o sangue é coletado no calcanhar do bebê, e colocado em um papel específico em áreas determinadas no teste.

Prós: reduz a morbidade e a mortalidade infantil, como consequência do diagnóstico pode ser realizado o tratamento precoce de doenças e prevenção de complicações.

Contras em alguns casos pode ocorrer o chamado falso negativo que pode gerar estresse e ansiedade desnecessária a família do paciente, além de atrasar o tratamento bem como sua implementação efetiva.

No teste do pezinho é utilizado a espectrometria em massa, a vantagem disso é a automatização em que é possível analisar cerca de 600 amostras em 24 horas, garantindo uma agilidade em relação ao resultado e a precisão que mostra um baixo índice de falsos negativos.

Os principais métodos cromatográficos são a cromatografia em camada delgada, em papel, gasosa e líquida. No teste do pezinho é utilizado principalmente a cromatografia em camada delgada, que é uma técnica de separação e de identificação de compostos que se baseia na diferença de afinidade por uma fase estacionária e uma fase móvel.

O ensaio imunoenzimático: é utilizado para detectar a presença de uma molécula ligante e um anticorpo em amostra líquida, utilizando um antígeno específico. Essa ação vai ser realizada por uma enzima que produz uma cor que pode ser analisada por um espectrofotômetro, e sua intensidade é diretamente proporcional a quantidade de anticorpo específico na amostra.

Hipotireoidismo congênito: é um distúrbio metabólico relacionado com a secreção insuficiente de hormônios tireoidianos T3 e T4. Pode ser causada pela disgenesia ou pode ser causada por disormonogênese.

A fenilcetonúria: é uma doença metabólica causada pelo acúmulo do aminoácido fenilalanina no organismo, ela possui herança autossômica recessiva. A fenilcetonúria é causada por uma mutação no gene da enzima fenilalanina hidroxilase que transforma a fenilalanina em tirosina. Ocasionando no aumento de fenilalanina.

Doença falciforme é uma doença hereditária em que as hemácias, diante de certas condições, alteram sua forma e se tornam parecidos com uma foice, sendo assim, nome falciforme. As células morrem prematuramente, causando escassez de glóbulos vermelhos saudáveis podendo obstruir o fluxo sanguíneo, levando a um quadro de anemia. Com o diagnóstico sendo feito por eletroforese em gel.

Fibrose cística é um transtorno hereditário que danifica os pulmões e outros órgãos digestivos, doença causada por variantes genéticas hereditárias que vão fazer com que secreções espessas e pegajosas obstruem os pulmões e outros órgãos. Para que um indivíduo desenvolva a fibrose cística é necessário ter ambos os cromossomos 7 com o gene CFTR mutado. Em relação ao diagnóstico: é realizado o teste do pezinho e em casos suspeitos é realizado o teste do Suor.

Deficiência da biotinidase: consiste em um erro inato do metabolismo e vai causar problema em uma via metabólica. É a falta da vitamina B5. Ela se manifesta a partir da sétima semana de vida, causando distúrbios neurológicos e cutâneos.

Hiperplasia adrenal congênita: é um distúrbio raro que vai compreender um grupo de doenças autossômicas recessivas causada por mutação que atrapalha no processo de esteroidogênese adrenal que é o processo de produção de hormônios esteróides na adrenal.

Até 2021, o teste do pezinho realizado pelo SUS, englobava essas 6 doenças . Entretanto após 2021, foi sancionada uma lei que expande o teste do pezinho de 6 para 50 doenças.

# data[].attributes.attachment_caption
Sistema CRISPR Cas-9. A técnica envolve basicamente três moléculas: uma nuclease, um RNA guia e o alvo (frequentemente o DNA)

# data[].attributes.body
A terapia gênica é um procedimento médico que envolve a modificação genética de células como forma de tratar doenças, a partir da introdução do gene de interesse.

Em doenças causadas por mutações gênicas, a introdução de um gene normal poderá reverter o quadro clínico. Células geneticamente modificadas poderão ativar mecanismos de defesa naturais do organismo, como o sistema imune, ou produzir moléculas de interesse terapêutico.

O gene de interesse é transportado por vetores virais ou não virais.

Algumas das formas de transferência utilizam vírus, sendo o método mais amplamente utilizado, no qual os principais são os retrovírus, os adenovírus e os vírus adeno-associados. A grande imunogenicidade e a expressão gênica transiente relacionadas a estes vetores limitam suas aplicações, ou seja, apresentam riscos associados.

Outras formas de transferência incluem a injeção direta do gene no organismo (microinjeção), assim como métodos utilizando princípios físicos (biolística, eletroporação). A eficiência e reprodutibilidade deste método são muito baixas, acarretando desafios de entrega.

Para terapia gênica no tratamento do câncer o efeito desejável é o de provocar a morte seletiva das células tumorais. Uma das estratégias para a transferência de genes no câncer de mama envolve a reposição do gene supressor de tumor mais comumente alterado nesse caso como o p53.

A terapia gênica é utilizada também em pacientes com HIV, que se trata de um vírus de RNA que utiliza as proteínas CCR5 e CXCR4 como receptor para entrar nas células de defesa como linfócitos T CD4 e macrófagos, e através dessa entrada, multiplicar-se e destruir as células de defesa que geram imunodepressão no paciente. Essa técnica apresenta grande eficácia em editar o genoma, e fazer mudanças direcionadas ao genoma de células vivas, contribuindo para que a proteína CCR5 seja não funcional. Como essa proteína é o sitio primário de ligação do vírus HIV com as células T, sem o receptor exposto na membrana, o vírus não consegue infectar a célula, resultando na diminuição da carga viral e sucedendo a cura ao paciente.

Essa técnica tem avançado seja pela otimização dos tipos de vetores, pela introdução de novas técnicas como as células-tronco pluripotentes induzidas em combinação com modelos atuais de edição gênica (CRISPR-Cas9), até por ensaios em células germinativas, que carregam os aspectos éticos e morais que margeiam a técnica.

A incorporação da terapia gênica no Brasil pelo Ministério da Saúde e a sua disponibilidade pelo SUS ainda não foi solucionada. Pacientes portadores de AME enfrentam ações judiciais para conseguir o tratamento pelo SUS.

# data[].attributes.body
SNUSTAD, D. Peter. Fundamentos de Genética/D. Peter Snustad, Michael J. Simons; revisão técnica Claudia Vitória de Moura Gallo. - 7. ed. -Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.

BORGES-OSÓRIO, Maria Regina; ROBINSON, Wance Miriam. Genética humana. 3. ed Porto Alegre: Artmed, 2013

OLIVEIRA, Evelyn et al. Eletroforese: conceitos e aplicações. Enciclopédia Biosfera, v. 11, n. 22, 2015.

BRAMMER, S. P. A técnica de eletroforese: importância e aplicações em análises genéticas. 2001.

GONÇALVES, Giulliana Augusta Rangel; PAIVA, Raquel de Melo Alves. Terapia gênica: avanços, desafios e perspectivas. Einstein (São Paulo), v. 15, p. 369-375, 2017.

DA SILVA RAMOS, Vagner Damião et al. O princípio elementar de Mendel aplicado a teste de paternidade: uma simulação a partir do triângulo amoroso em Dom Casmurro. Genética na escola, v. 13, n. 1, p. 70-81, 2018

NEVES, S. M. N.; GUEDES, R. M. C. Hibridização in situ fluorescente: princípios básicos e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina veterinária. Arquivos do Instituto Biológico, v. 79, p. 627-632, 2012.

NUSSBAUM, Robert L.; MCINNES, Roderick R; WILLARD, Huntington F. Thompson & Thompson. Genética Médica. 7.ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2002.