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O que é miopia. A miopia é um erro refrativo do globo ocular no qual a imagem dos objetos no olho é focada incorretamente focados à frente da retina, fazendo com que a visão dos objetos distantes pareça turva

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O que é miopia. A miopia é um erro refrativo do globo ocular no qual a imagem dos objetos no olho é focada incorretamente focados à frente da retina, fazendo com que a visão dos objetos distantes pareça turva

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Nesse caso há um afastamento da retina em relação ao cristalino, fazendo que a imagem seja formada antes da retina, tornando que é o ponto onde a imagem é nítida, está a uma distância finita, maior ou menor, conforme o grau da miopia. 

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Nesse caso há um afastamento da retina em relação ao cristalino, fazendo que a imagem seja formada antes da retina, tornando que é o ponto onde a imagem é nítida, está a uma distância finita, maior ou menor, conforme o grau da miopia. 

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a hipermetropia faz com que a reflaçao que faz a retina focar atras do olhos que faz as coisas que estao perto ficar dificil de enchegar

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a hipermetropia faz com que a reflaçao que faz a retina focar atras do olhos que faz as coisas que estao perto ficar dificil de enchegar

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A Lente EVO  Visian Implantável é Ideal para Correção da Sua Miopia . Tecnologia que Provê o Máximo de Liberdade Visual.

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A Lente EVO  Visian Implantável é Ideal para Correção da Sua Miopia . Tecnologia que Provê o Máximo de Liberdade Visual.

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hipermetropia e uma globo ocular mais curto que o normal que faz as imagem esse plobema pode ser corigido com lente 

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hipermetropia e uma globo ocular mais curto que o normal que faz as imagem esse plobema pode ser corigido com lente 

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 hipermetropia é um erro refrativo em que as imagens formam-se atrás da retina devendo ser corrigido o mais rapidamente possível por oculos especiais

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 hipermetropia é um erro refrativo em que as imagens formam-se atrás da retina devendo ser corrigido o mais rapidamente possível por oculos especiais

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Para corrigir a hipermetropia usamos as lentes do tipo convergente. Hoje em dia existem diversos tipos de lentes para hipermetropia sendo elas: lentes CR-39 (ORMA®)

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Para corrigir a hipermetropia usamos as lentes do tipo convergente. Hoje em dia existem diversos tipos de lentes para hipermetropia sendo elas: lentes CR-39 (ORMA®)

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Esquema de uma lente divergente. As lentes divergentes são lentes que possuem uma curvatura interna, ou seja, suas bordas são mais grossas que o centro. Por afastarem os raios de luz.

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Esquema de uma lente divergente. As lentes divergentes são lentes que possuem uma curvatura interna, ou seja, suas bordas são mais grossas que o centro. Por afastarem os raios de luz.

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O contato com a luz natural ajuda no desenvolvimento do globo ocular. Para não termos riscos algum, é também recomendado a utilização de óculos de sol com proteção contra raios UV

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O contato com a luz natural ajuda no desenvolvimento do globo ocular. Para não termos riscos algum, é também recomendado a utilização de óculos de sol com proteção contra raios UV

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nao e possivel impedir a hipermetropia mais essas doenças também podem surgir por causa de cirurgias e procedimentos que possam alterar o formato do globo ocular

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nao e possivel impedir a hipermetropia mais essas doenças também podem surgir por causa de cirurgias e procedimentos que possam alterar o formato do globo ocular

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o astgmatismo cauza os objetos são focados em mais do que um ponto distorcendo desta forma a visao

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o astgmatismo cauza os objetos são focados em mais do que um ponto distorcendo desta forma a visao

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astigmatismo e causado por uma curvatura irregular da córnea que provoca uma deformação da mesma A forma da córnea é mais ovalada do que redonda

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astigmatismo e causado por uma curvatura irregular da córnea que provoca uma deformação da mesma A forma da córnea é mais ovalada do que redonda

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CAUSAS DO DALTONISMO Este distúrbio acontece devido a problemas com os pigmentos de determinadas células nervosas do olho, localizadas na retina. Se apenas um pigmento estiver faltando, é o suficiente para  a pessoa apresentar dificuldades para identificar certas cores como o vermelha, verde e a azul

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CAUSAS DO DALTONISMO Este distúrbio acontece devido a problemas com os pigmentos de determinadas células nervosas do olho, localizadas na retina. Se apenas um pigmento estiver faltando, é o suficiente para  a pessoa apresentar dificuldades para identificar certas cores como o vermelha, verde e a azul

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O tratamento para astigmatismo passa pela correçao do erro refratido pode ser corrigido através de óculos ou lentes de contato

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O tratamento para astigmatismo passa pela correçao do erro refratido pode ser corrigido através de óculos ou lentes de contato

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O daltonismo é resultado de um defeito na retina, a parede do fundo do olho. Esse defeito afeta as células responsáveis pela percepção das cores .

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O daltonismo é resultado de um defeito na retina, a parede do fundo do olho. Esse defeito afeta as células responsáveis pela percepção das cores .

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o astigmatismo ocular pode ser compensado com uma lente tórica lentes cilindricas que vai compensar a deficiência corneana

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o astigmatismo ocular pode ser compensado com uma lente tórica lentes cilindricas que vai compensar a deficiência corneana

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Lentes corretivas tratam astigmatismo por contrariar a curvatura desigual da sua córnea. Tipos de lentes corretivas incluem

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Lentes corretivas tratam astigmatismo por contrariar a curvatura desigual da sua córnea. Tipos de lentes corretivas incluem

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No entanto, pode ser feito um tratamento para que suas consequências sejam minimizadas.

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No entanto, pode ser feito um tratamento para que suas consequências sejam minimizadas.

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Vendidos a preços que variam de R$ 500 a R$ 800 por uma empresa brasileira e ao preço inicial de US$ 299 na mais famosa fabricante norte-americana

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Vendidos a preços que variam de R$ 500 a R$ 800 por uma empresa brasileira e ao preço inicial de US$ 299 na mais famosa fabricante norte-americana

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Para corrigir esse defeito, ou seja, para que a imagem forme-se exatamente sobre a retina, a pessoa que tem esse problema deve utilizar óculos com lentes divergentes.

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Para corrigir esse defeito, ou seja, para que a imagem forme-se exatamente sobre a retina, a pessoa que tem esse problema deve utilizar óculos com lentes divergentes.

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O daltonismo não possui prevenção é considerado um defeito adquirido, com o tempo pode regredir ou estabilizar o correto  é  utilizar a  com  segurança a prevenção com  exames  frequentes.Na  maioria  das  pessoas é  da  genética na alteração do cromossomo, trazendo as dificuldades na percepção das  cores  e  com  a deficiência   específicas da visão perfeita das cores certas.

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O daltonismo não possui prevenção é considerado um defeito adquirido, com o tempo pode regredir ou estabilizar o correto  é  utilizar a  com  segurança a prevenção com  exames  frequentes.Na  maioria  das  pessoas é  da  genética na alteração do cromossomo, trazendo as dificuldades na percepção das  cores  e  com  a deficiência   específicas da visão perfeita das cores certas.

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O daltonismo não possui prevenção é considerado um defeito adquirido, com o tempo pode regredir ou estabilizar o correto  é  utilizar a  com  segurançaa presença com  exames  labora

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Tradução Cláudio M. Rocha-de-Souza Pesquisador visitante do Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos Bio-Manguinhos - FIOCRUZ. Doutor em Microbiologia Médica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

Revisão técnica desta edição José Procópio Moreno Senna Pesquisador da vice-diretoria de desenvolvimento tecnológico do Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos Bio-Manguinhos - FIOCRUZ. Professor da disciplina de Bacteriologia do Mestrado Profissional em Tecnologia de Imunobiológicos Bio-Manguinhos - FIOCRUZ. Doutor em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

M626 Microbiologia médica de Jawetz, Melnick e Adelberg [recurso eletrônico] / Geo. F. Brooks ... [et al.] ; [tradução: Cláudio M. Rocha-de-Souza ; revisão técnica: José Procópio Moreno Senna]. - 26. ed. - Dados eletrônicos. - Porto Alegre : AMGH, 2014. Editado também como livro impresso em 2014. ISBN 978-85-8055-335-2 1. Microbiologia. I. Brooks, Geo. F. CDU 579 Catalogação na publicação: Ana Paula M. Magnus - CRBl0/2052

Um livro médico LANGE Geo. F. Brooks, MD

Stephen A. Morse, PhD

Professor of Laboratory Medicine and Microbiology and lmmunology Chief, Microbiology Section Clinica/ Laboratories University of California, San Francisco, California

Associate Director for Environmental Microbiology Division ofFoodborne, Waterborne, and Environmental Diseases National Center for Emerging and Zoonotic lnfectious Diseases Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia

Karen C. Carroll, MD Professor of Pathology The Johns Hopkins University School ofMedicine Director, Division Medical Microbiology The Johns Hopkins Hospital, Baltimore, Maryland

Timothy A. Mietzner, PhD Associate Professor Department ofMicrobiology and Molecular Genetics University of Pittsburgh School ofMedicine, Pittsburgh AdjunctAssociate Professor ofMicrobiology Arizona School of Dentistry and Oral Health Mesa, Arizona

Janet S. Butel, PhD Distinguished Service Professor Chair, Department ofMolecular Virology and Microbiology Baylor College ofMedicine, Houston, Texas

* e Jawetz, Me nic 26ª Edição

Versão impressa desta obra: 2014

Me Graw Hill

Education

AMGH

Editora Ltda. 2014

e

erg

Obra originalmente publicada sob o título Jawetz, Melnick & Adelberg's medical microbiology, 26th edition ISBN 0071790314 I 9780071790314 Original edition copyright ©2013, The McGraw-Hill Global Education Holdings, LLC., NewYork, NewYork 10020. Ali rights reserved. Portuguese translation copyright ©2014, AMGH Editora Ltda., a Grupo A Educação S.A. company. Ali rights reserved. Gerente editorial: Letícia Bispo de Lima

Colaboraram nesta edição Editor: Alberto Schwanke Assistente editorial: Mirela Favaretto Preparação de originais: Nádia da Luz Lopes Leitura final: Carla Rosane Romanelli Arte sobre capa original: Estúdio Castellani Editoração eletrônica: Estúdio Castellani

Nota

Assim como a medicina, a microbiologia é uma ciência em constante evolução. A medida que novas pesquisas e a própria experiência clínica ampliam o nosso conhecimento, são necessárias modificações na terapêutica, onde também se insere o uso de medicamentos. Os autores desta obra consultaram as fontes consideradas confiáveis, num esforço para oferecer informações completas e, geralmente, de acordo com os padrões aceitos à época da publicação. Entretanto, tendo em vista a possibilidade de falha humana ou de alterações nas ciências médicas, os leitores devem confirmar estas informações com outras fontes. Por exemplo, e em particular, os leitores são aconselhados a conferir a bula completa de qualquer medicamento que pretendam administrar, para se certificar de que a informação contida neste livro está correta e de que não houve alteração na dose recomendada nem nas precauções e contraindicações para o seu uso. Essa recomendação é particularmente importante em relação a medicamentos introduzidos recentemente no mercado farmacêutico ou raramente utilizados.

Reservados todos os direitos de publicação, em língua portuguesa, à AMGH EDITORA LTDA., uma parceria entre GRUPO A EDUCAÇÃO S.A. e McGRAW-HILL EDUCATION Av. Jerônimo de Ornelas, 670 - Santana 90040-340 Porto Alegre RS Fone: (51) 3027-7000 Fax: (51) 3027-7070

É proibida a duplicação ou reprodução deste volume, no todo ou em parte, sob quaisquer formas ou por quaisquer meios (eletrônico, mecânico, gravação, fotocópia, distribuição na Web e outros), sem permissão expressa da Editora. Unidade São Paulo Av. Embaixador Macedo Soares, 10.735 Pavilhão 5 Vila Anastácio 05095-035 São Paulo SP Fone: (11) 3665-1100 Fax: (l l) 3667-1333 -

SAC 0800 703-3444

-

.grupoa.com.br

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Cond. Espace Center

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.

re ac10

Esta 26ª edição de Microbiologia médica de Jawetz, Melnick e Adelberg permanece fiel aos objetivos da 1ª edição, publicada em 1954, de "oferecer uma apresentação sucinta, precisa e atua lizada dos aspectos da microbiologia médica particularmente relevantes às áreas de infecções clínicas e quimioterapiá'. Todos os capítulos foram atualizados para refletir a abrangência do conhecimento médico proporcionada pelos mecanismos mo leculares, pelos avanços em nossa compreensão sobre a patogê nese microbiana e pela descoberta de novos patógenos. Entre as novidades, destacam-se: * * * *

Conceitos-chave ao longo dos capítulos. Novas questões de revisão. Resumos ao fmal de cada capítulo. Novas fotografias e microfotografias coloridas.

Também é nova nesta edição a contribuição de Barbara Detrick, PhD, Professor, Division of Clinical Immunology, Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine. O conhecimento da Dra. Detrick em imunologia clínica e no papel das citocinas na saúde e na doença será de imenso valor a esta e a futuras edições. Esperamos que as mudanças desta edição sejam úteis aos estudantes de microbiologia. Os autores

1O

Microbiota normal humana

165

11

Bacilos gram-positivos formadores de esporos: espécies Bacillus e

Stephen A. Morse, PhD e Timothy A. Meitzner, PhD

1

A ciência da microbiologia

Bacilos gram-positivos aeróbios não formadores de esporos: Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix, Actinomycetes e

11

2

Estrutura celular

3

Classificação das bactérias

4

Crescimento, sobrevida e morte dos microrganismos

12

1

7 75

Clostridium

43

55

199

13

Estafilococos

14

Estreptococos, enterococos e outros gêneros relacionados

5

Cultura de microrganismos

6

Metabolismo microbiano

7

Genética microbiana

67

15

77

101

16

gram-negativas incomuns

123

Vibriões, Campylobacter, Helicobacter e

19

Yersinia e Pasteurella 279

20

Neissérias

21

Infecções causadas por bactérias

22

Francisella 265

285

295

Legionelas, bartonelas e patógenos bacterianos incomuns

Karen C. Carrol/, MO

149

255

Haemophilus, Bordetel/a, Bruce/la e

anaeróbias

Patogênese da infecção bacteriana

245

18 Barbara Detrick, PhD

9

229

Pseudomonas, Acinetobacter e bactérias

bactérias associadas

Imunologia

209

Bacilos entéricos gram-negativos (Enterobacteriaceae)

17

8

187

patógenos relacionados

23

Micobactérias

313

305

***

VIII

24

Sumário Espiroquetas e outros microrganismos 327

espiralados

25

Coronavírus

42

Raiva, infecções por vírus lentos e doenças causadas por príons

Micoplasmas e bactérias com paredes celulares defeituosas

341

26

Riquétsias e gêneros relacionados

27

Chlamydia spp.

28

Quimioterapia antimicrobiana

613

41

349

619

43

Vírus de cânceres humanos

44

Aids e lentivírus

359

633

653

371

Thomas G. Mitchel/, PhD

45

Micologia médica

671

Jane Butel, PhD

407

29

Propriedades gerais dos vírus

30

Patogênese e controle das doenças virais

31

Parvovírus

451

Judy A. Sakanari, PhD e

457

James H. McKerrow, MO, PhD

32

Adenovírus

33

Herpes-vírus

34

Poxvírus

35

Vírus da hepatite

36

Picornavírus (grupos dos enterovírus e rinovírus)

37 38

431

467

46

715

493 S E Ç Ã O

507

VII

527

Reovírus, rotavírus e calicivírus

543

Doenças virais transmitidas por artrópodes e roedores

Parasitologia médica

Karen C. Carrol/, MO

47

Ortomixovírus (vírus influenza)

40

Paramixovírus e vírus da rubéola

577 591

Princípios de microbiologia médica diagnóstica

553

39

Diagnóstico em microbiologia médica e correlação clínica 753

48

753

Casos e correlações clínicas

Índice

823

785

C A PÍT U L O

A ciência da microbiologia

INTRODUÇÃO A microbiologia é o estudo dos microrganismos. Um grande e diverso grupo de organismos microscópicos que existem em células isoladas ou em aglomerados, o qual também inclui os vírus, que são microscópicos mas não são células. Os microrga nismos causam enorme impacto em toda a vida, bem como na constituição física e química de nosso planeta, e são responsá veis pelo transporte dos elementos químicos essenciais à vida, como o carbono, nitrogênio, enxofre, hidrogênio e oxigênio, além da fotossíntese, realizada por microrganismos diferentes das plantas verdes. Além disso, existem 100 milhões de ve zes mais bactérias nos oceanos (13 x 1028) do que estrelas no universo. A taxa de infecções virais nos oceanos é de cerca de 1 x 1023 por segundo, essas infecções removem entre 20 a 40% de todas as células bacterianas a cada dia. Estima-se que exis tam 5 x 1030 células microbianas na Terra; excluindo-se a ce lulose, essas células constituem cerca de 90% da biomassa da biosfera. Os seres humanos também têm íntima relação com os microrganismos, uma vez que mais de 90% das células do nosso corpo são micróbios. As bactérias presentes no intestino humano médio pesam aproximadamente 1 Kg, sendo que um adulto humano irá excretar o seu próprio peso em bactérias fecais a cada ano. O número de genes presentes na microbiota intestinal supera em 150 vezes o contido dentro do nosso ge noma, até mesmo em nosso próprio genoma, 8% do DNA são derivados de fragmentos de genomas virais.

PRINCÍPIOS BIOLÓGICOS ILUSTRADOS PELA MICROBIOLOGIA Em nenhuma outra forma, a diversidade biológica mostra-se tão notável quanto nos microrganismos, seres não diretamente

observados a olho nu. Quanto à forma e à função, em se tratan do de propriedades bioquímicas ou de mecanismos genéticos, a análise dos microrganismos transporta-nos até os limites da compreensão biológica. Assim, a necessidade de originalidade - uma prova do mérito de uma hipótese científica - pode ser totalmente satisfeita pela microbiologia. Para ser útil, uma hipótese deve fornecer elementos básicos para uma generali zação, e a ampla diversidade microbiana nos fornece um ver dadeiro palco em que esse desafio é constante. A previsão, a consequência prática da ciência, é o produto resultante de uma combinação de técnica e teoria. A bioquími ca, a biologia molecular e a genética fornecem as ferramentas necessárias para a análise dos microrganismos. A microbio logia tem por função ampliar os horizontes dessas disciplinas científicas. Um biólogo pode descrever tal tipo de troca co mo mutualismo, ou seja, que tem a capacidade de favorecer todas as partes contribuintes. Os líquens são um exemplo de mutualismo microbiano; consistem em um fungo e um parcei ro fototrófico, que pode ser uma alga (um eucarioto) ou uma cianobactéria (um procarioto). O componente fototrópico é o produtor primário, e o fungo atua fornecendo ao mesmo uma espécie de âncora de sustentação e proteção ao ambiente. Na biologia, o mutualismo é denominado simbiose, uma associa ção contínua que envolve diferentes organismos. Se a troca fun ciona principalmente em benefício de apenas uma das partes, a associação é descrita como parasitismo - uma relação em que um hospedeiro propicia o benefício primário ao parasito. O isolamento e a caracterização de um parasito, como, por exem plo, uma bactéria patogênica ou um vírus, com frequência exi gem procedimentos laboratoriais que mimetizem o ambiente de crescimento proporcionado pelas células hospedeiras. Exi gência que às vezes é um grande desafio para os pesquisadores. Os termos "mutualismo", "simbiose" e "parasitismo" es tão relacionados com a ciência da ecologia, e os princípios da

2

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

biologia ambiental estão implícitos na microbiologia. Os mi crorganismos são produtos da evolução, a consequência bioló gica da seleção natural que opera sobre uma ampla variedade de organismos geneticamente diversos. Convém não esquecer a complexidade da história natural antes de formular generali zações acerca dos microrganismos, que constituem o conjunto mais heterogêneo de todos os seres vivos. Existe uma importante divisão biológica que distingue os eucariotos, organismos que possuem um núcleo delimitado por membrana, dos procariotos, organismos cujo DNA não está fisi camente separado do citoplasma. Como descrito neste capítulo, bem como no Capítulo 2, outras diferenças importantes podem ser citadas entre os eucariotos e os procariotos. Por exemplo, os eucariotos distinguem-se pelo seu tamanho relativamente gran de, bem como pela presença de organelas especializadas e deli mitadas por membrana, como as mitocôndrias. Conforme descreveremos adiante em mais detalhes, os mi crorganismos eucarióticos - ou, em termos filogenéticos, os Eucarya - são unificados por sua estrutura celular distinta e por sua história filogenética. Entre esses grupos de microrganismos estão as algas, os protozoários, os fungos e os mixomicetos.

VÍRUS As propriedades singulares dos vírus os distinguem das outras formas de vida. Os vírus não possuem muitos dos atributos das células, o que inclui a capacidade de se replicar. Somente quan do infecta uma célula é que um vírus adquire o atributo-chave de um sistema vivo a reprodução. Os vírus são conhecidos por infectarem todas as células, inclusive as células microbianas. Recentemente, foi descoberto que vírus demominados virófa gos têm a capacidade de infectar outros vírus. As interações dos vírus com o hospedeiro tendem a ser altamente específicas, e a variedade biológica dos vírus existentes reflete a diversidade das células hospedeiras potenciais. A maior diversidade dos ví rus é exibida pela ampla variedade de estratégias que eles usam para se replicar e sobreviver. As partículas virais são geralmente pequenas (p. ex., ade novírus possui 90 nm) e consistem em uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, envolta por uma camada de proteína ou capsídeo (às vezes revestido por um invólucro de lipídeos, proteínas e carboidratos). As proteínas - com frequência gli coproteínas - encontradas no capsídeo determinam a espe cificidade da interação entre o vírus e a célula hospedeira. O capsídeo protege o ácido nucleico e facilita a fixação do vírus, bem como sua penetração na célula hospedeira. No interior da célula, o ácido nucleico viral direciona o mecanismo enzi mático do hospedeiro para desempenhar funções associadas à replicação do vírus. Em alguns casos, a informação genética do vírus pode ser incorporada em forma de DNA dentro de um cromossomo do hospedeiro. Em outras circunstâncias, a informação genética viral pode servir de base para a produção celular e liberação de cópias do vírus, processo que requer a re plicação do ácido nucleico viral e produção de proteínas virais específicas. A maturação consiste na organização do ácido nu cleico e das subunidades proteicas recém-sintetizadas em par tículas virais maduras que, em seguida, são liberadas no meio extracelular. Alguns vírus de tamanho muito pequeno neces sitam do auxílio de outro vírus na célula hospedeira para sua

duplicação. O agente delta, também conhecido como vírus da hepatite D, é demasiado pequeno para codificar mesmo uma única proteína do capsídeo, e precisa do auxílio do vírus da hepatite B para sua transmissão. Os vírus são conhecidos por infectarem ampla variedade de hospedeiros vegetais e animais, bem como protistas, fungos e bactérias. Entretanto, a maioria dos vírus é capaz de infectar tipos específicos de célula e so mente uma espécie de hospedeiro. Alguns vírus são grandes e complexos. Por exemplo, o Mi mivirus (um vírus de DNA), que infecta a Acanthamoeba (uma ameba de vida livre encontrada no solo) apresenta um diâmetro de 400 a 500 nm e um genoma que codifica 979 proteínas, in cluindo as aminoacil tRNA sintetases (aaTRS), nunca encon tradas fora de organismos celulares, como também enzimas que participam na biossíntese de polissacarídeos. Um vírus marinho ainda maior foi recentemente descoberto (megaví rus); seu genoma ( 1.259,197-pb) codifica para 1.120 proteínas putativas, sendo assim maior do que os presentes em algumas bactérias (Quadro 7.1). Devido ao seu grande tamanho, esses vírus podem assemelhar-se a bactérias quando observados em preparações de coloração para microscopia óptica. Entretanto, não realizam divisão celular ou possuem ribossomos. Diversas doenças transmissíveis em plantas são causadas por viroides - pequenas moléculas de RNA circular de filamento único e covalentemente fechadas que se apresentam como estruturas semelhantes a bastonetes. Esses viroides não possuem capsí deos. Seu tamanho varia de 246 a 375 nucleotídeos de extensão. A forma extracelular de um viroide é RNA nu - não existe capsídeo de nenhum tipo. A molécula de RNA não contém ge nes que codificam proteínas, e, portanto, o viroide é totalmente dependente das funções do hospedeiro para sua replicação. O RNA viroide é replicado pela RNA polimerase dependente do DNA da planta hospedeira; a preferência por essa enzima pode contribuir para a patogenicidade dos viroides. Constatou-se que as moléculas de RNA dos viroides contêm sequências de bases repetidas, invertidas em suas extremidades terminais 3' e 5', uma característica dos elementos transponí veis ( Cap. 7) e de retrovírus. Por conseguinte, é provável que tenham evoluído a partir dos elementos transponíveis ou re trovírus por meio da deleção de sequências internas. As propriedades gerais dos vírus de animais patogênicos para os seres humanos são descritas no Capítulo 29. Os vírus bacterianos são descritos no Capítulo 7.

PRÍONS Várias descobertas notáveis, feitas nas últimas três décadas, levaram à caracterização molecular e genética do agente trans missível responsável pelo scrapie (prurido lombar dos car neiros), uma doença degenerativa do sistema nervoso central dos ovinos. Os estudos realizados identificaram uma proteína específica do scrapie em preparações de cérebros de carneiros infectados, que é capaz de reproduzir os sintomas da doença em carneiros anteriormente não infectados (Fig. 1.1). Os esfor ços para identificação de outros componentes, como o ácido nucleico, não tiveram sucesso. Para distinguir esse agente dos vírus e viroides, foi introduzido o termo príon para ressaltar sua natureza proteinácea e infecciosa. A forma celular da pro teína príon (PrPc) é codificada pelo DNA cromossômico do

CAPÍTULO 1

A ciência da microbiologia

3

Tanto a proteína príon normal (PN) quanto a proteína príon anormal (PP) estão presentes. '

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FIGURA 1.1 Príon. Príons isolados do cérebro de um hamster infecta do por scrapie. Esta doença neurodegenerativa é causada por um príon. (Reproduzida, com autorização, de Stanley B. Prusiner.) hospedeiro. A PrPc é uma sialoglicoproteína com massa mole cular (MM) de 33.000 a 35.000 daltons e alto conteúdo de uma estrutura secundária a-helicoidal sensível a proteases e solú vel em detergente. É expressa sobre a superfície dos neurônios por meio de uma âncora de glicosilfosfatidil inositol tanto em cérebros infectados quanto em cérebros não infectados. Uma mudança conformacional ocorre na proteína príon, alterando sua forma PrPc normal ou celular para a conformação associa da à doença, PrP5c (Fig. 1.2). Quando a PrP5c está presente em um indivíduo (devido à conversão conformacional espontânea ou infecção), é capaz de recrutar PrPc e convertê-lo à isofor ma associada à doença. Assim, os príons replicam utilizando o próprio substrato PrPc que está presente no hospedeiro. Existem outras doenças importantes causadas por príons (Quadro 1.1 e Cap. 42). O kuru, a doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ), a doença de Gerstmann-Strãussler-Scheinker e a insônia familiar fatal acometem os seres humanos. A encefalopatia es pongiforme bovina, acredita-se que seja causada pela ingestão de rações e farinhas de ossos preparadas com sobras de carneiros abatidos, foi a responsável pela morte de mais de 184.000 cabeças de gado bovino na Grã-Bretanha desde sua descoberta em 1985. Uma nova variante da DCJ (vDCJ) foi associada à ingestão de carne bovina infectada por príon no Reino Unido e na França. Uma característica comum a todas essas doenças é a conversão de uma sialoproteína codificada pelo hospedeiro em uma forma resistente a protease como consequência da infecção. As doenças humanas causadas por príons são singulares, uma vez que se manifestam em forma de doenças esporádicas, genéticas e infecciosas. O estudo da biologia dos príons constitui uma área importante da investigação biomédica em desenvolvi mento, e ainda há muito conhecimento a ser adquirido. As características que distinguem os vírus e príons do mun do microbiano estão apresentadas no Quadro 1.2.

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1 1 I , 1 1 I 1 1 1 1 1 I 1

- Neurônio

anormais continuam a interagir com as proteínas príon normais até que elas convertam todas as proteínas normais em proteínas anormais.

�

PN convertida

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

,.

Proteínas príon anormais

FIGURA 1.2 Mecanismo proposto pelo qual os príons se replicam. As proteínas príon normais e anormais diferem entre si por sua estrutura terciária. (Reproduzida, com autorização, de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT (editors): Microbiology: A Human Perspective, 6th ed. McGraw-Hill, 2009, p. 342.)

PROCARIOTOS As principais características que diferenciam os procariotos consistem em seu tamanho relativamente pequeno, em geral da ordem de 1 µm de diâmetro, e na ausência de membrana nu clear. O DNA de quase todas as bactérias é um círculo de cerca de 1 mm de extensão, representando o cromossomo procario to. A maioria dos procariotos possui um único cromossomo. O DNA cromossômico tem de se dobrar mais de 1.000 vezes para ficar contido dentro da membrana da célula procariótica. Evidências substanciais sugerem a possibilidade de tais dobras serem ordenadas, permitindo uma proximidade de regiões es pecíficas do DNA. A região especializada da célula que con tém DNA é denominada nucleoide, podendo ser visualizada

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SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

QUADRO 1.1

Doenças causadas por príon comuns a seres humanos e a animais

Tipo

Nome

Etiologia

Doenças por príon no homem

Aquisição

Doença variante de Creutzfeldt-Jakobª

Associada à ingestão ou inoculação de material infectado por príon

Kuru Doença iatrogênica de Creutzfeldt-Jakobb Esporádica

Doença de Creutzfeldt-Jakob

Fonte de infecção desconhecida

Familiar

Gerstmann-Straussler-Scheinker

Associada a mutações específicas dentro do gene que codifica a PrP

Insônia familiar fatal Doença de Creutzfeldt-Jakob Doenças por príon em animais

Gado

Encefalopatia espongiforme bovina

Exposição a carnes e ossos (ração) contaminados por príon

Carneiro

Scrapie

Ingestão de material contaminado por scrapie

Veado, alce

Doença degenerativa crônica

Ingestão de material contaminado por príon

Marta

Encefalopatia transmissível das martas

Fonte de infecção desconhecida

Gatos

Encefalite espongiforme felinaª

Exposição a carnes e ossos (ração) contaminados por príon

ªAssociadas à exposição a materiais contaminados por encefalopatia espongiforme bovina (EEB). bAssociada a materiais biológicos contaminados por príon, tais como enxertos de dura-máter, transplante de córnea, hormônio do crescimento humano obtido de cadáveres ou instrumentos cirúrgicos contaminados por príon. PrP, proteína priónica. Reproduzido, com autorização, da American Society for Microbiology. Priola SA: How animal prions cause disease in humans. Microbe 2008; 3(12): 568.

QUADRO 1.2

Características diferenciadoras para vírus, viroides e príons Vírus

Viroides

Príons

Agentes intracelulares obrigatórios

Agentes intracelulares obrigatórios

Proteína celular anormal

Apresentam ou DNA ou RNA revestido por uma camada de proteína

Consiste somente de RNA sem camada de proteína

Consiste somente de proteína, sem DNA ou RNA

Reproduzido, com autorização, de Nester EW, Andreson DG, Roberts CE, Nester MT (editors): Microbio/ogy: A Human Perspective, 6th ed. McGraw-Hill, 2009, p.

por microscopia eletrônica, bem como por microscopia óptica após o tratamento da célula para tornar o nucleoide visível. Por conseguinte, seria um erro concluir que a diferenciação subce lular, nitidamente demarcada por membranas nos eucariotos, está ausente nos procariotos. Na verdade, alguns procariotos formam estruturas subcelulares delimitadas por membrana, com funções especializadas, como os cromatóforos das bacté rias fotossintéticas (Cap. 2).

Diversidade dos procariotos O pequeno tamanho do cromossomo procariótico limita a quan tidade de informação genética que ele pode conter. Dados recen tes, baseados na determinação da sequência do genoma, indicam que o número de genes dentro de um procarioto pode variar de 468 no Mycoplasma genitalium a 7.825 no Streptomyces coeli color, e que muitos desses genes devem ter funções essenciais, como a produção de energia, a síntese das macromoléculas e a replicação celular. Qualquer procarioto transporta relativamen te poucos genes que possibilitam a acomodação fisiológica do organismo a seu ambiente. A variedade de ambientes potenciais

13.)

dos procariotos é extraordinariamente ampla, podendo-se de duzir que o grupo dos procariotos abrange uma variedade heterogênea de especialistas, cada qual adaptado a um nicho es treitamente circunscrito. A variedade de nichos procarióticos é ilustrada ao conside rarmos as estratégias empregadas na produção de energia me tabólica. A luz solar constitui a principal fonte de energia para a vida. Alguns procariotos, como as bactérias de cor púrpura, con vertem a energia luminosa em energia metabólica sem produzir oxigênio. Outros procariotos - como, por exemplo, as bacté rias azul-esverdeadas (Cianobactérias) - produzem oxigênio capaz de fornecer energia por meio da respiração, na ausência de luz. Os microrganismos aeróbios dependem da respiração com oxigênio para obterem energia. Alguns microrganismos anaeróbios podem utilizar aceptores de elétrons diferentes do oxigênio na respiração. Muitos anaeróbios realizam fermenta ções, em que a energia é obtida mediante o rearranjo metabólico dos substratos químicos de crescimento. A extraordinária varie dade química dos substratos de crescimento potenciais para o crescimento aeróbio ou anaeróbio reflete-se na diversidade dos procariotos que se adaptaram à sua utilização.

CAPÍTULO 1

Comunidades dos procariotos Uma estratégia útil à sobrevida dos especialistas consiste em formar consórcios, isto é, grupamentos em que as caracterís ticas fisiológicas dos diferentes organismos contribuem para a sobrevivência do grupo como um todo. Se os organismos existentes no interior de uma comunidade fisicamente inter conectada provêm diretamente de uma única célula, a comu nidade consiste em um clone que pode conter até 108 células. A biologia dessa comunidade difere substancialmente daquela representada por uma única célula. Por exemplo, o elevado nú mero de células praticamente assegura a presença, no interior do clone, de pelo menos uma célula portadora de uma variante de qualquer gene no cromossomo. Assim, a variabilidade ge nética - a fonte do processo evolutivo denominado seleção natural - é garantida no interior do clone. O elevado número de células no interior dos clones também tende a proporcionar uma proteção fisiológica para pelo menos alguns membros do grupo. Por exemplo, os polissacarídeos extracelulares podem fornecer proteção contra agentes potencialmente letais, como os antibióticos ou íons de metais pesados. As grandes quanti dades de polissacarídeos produzidas pelo elevado número de células dentro de um clone podem possibilitar que as células em seu interior sobrevivam à exposição a determinado agente letal em uma concentração capaz de matar células isoladas. Muitas bactérias usam um mecanismo de comunicação in tercelular denominado quorum sensing para regular a transcri ção dos genes envolvidos em diversos processos fisiológicos, como a bioluminescência, a transferência por conjugação de plasmídeos e a produção de determinantes de virulência. O dispositivo do quorum sensing depende da produção de uma ou mais moléculas sinalizadoras difusíveis denominadas au toindutores ou feromônios, que permitem à bactéria monito rar a densidade da sua própria população celular. Trata-se de um exemplo de comportamento multicelular nos procariotos. Uma característica marcante dos procariotos é a sua capa cidade de trocar pequenos fragmentos de informação genética. Esta informação pode ser transportada em plasmídeos, peque nos elementos genéticos especializados com capacidade de sofrer replicação dentro de pelo menos uma linhagem celular procarió tica. Em alguns casos, os plasmídeos podem ser transferidos de uma célula para outra, sendo capazes de transportar conjuntos de informação genética especializada por meio de uma popula ção. Alguns plasmídeos exibem ampla variedade de hospedeiros, que possibilita a transferência de conjuntos de genes a diversos microrganismos. Os plasmídeos de resistência a fármacos, que podem tornar diversas bactérias resistentes ao tratamento com antibióticos, são objeto de preocupação especial. A estratégia de sobrevida de uma única linhagem de células procarióticas pode levar a uma variedade de interações com outros organismos. Entre essas interações, podem-se incluir relações simbióticas ilustradas por complexas trocas nutricio nais entre microrganismos no intestino humano. Tais trocas beneficiam tanto os microrganismos quanto o hospedeiro hu mano. As interações que envolvem parasitas podem ser dele térias para o hospedeiro. A simbiose avançada, ou parasitismo, pode levar à perda de funções que não permitem o crescimen to do simbionte ou do parasito, independentemente de seu hospedeiro.

A ciência da microbiologia

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Os micoplasmas, por exemplo, são parasitas procario tos que perderam a capacidade de formar parede celular. A adaptação desses microrganismos a seu ambiente parasitado resultou na incorporação de uma quantidade significativa de colesterol no interior de suas membranas celulares. O coleste rol, não encontrado em outros procariotos, é assimilado a par tir do ambiente metabólico fornecido pelo hospedeiro. A perda de função também é exemplificada pelos parasitas intracelu lares obrigatórios, como as clamídias e riquétsias, bactérias extremamente pequenas (com 0,2 a 0,5 µm de diâmetro) e que dependem da célula hospedeira para obter muitos metabólitos e coenzimas essenciais. Essa perda de função reflete-se na pre sença de um genoma menor, com menos genes (Quadro 7.1). Os exemplos mais amplamente distribuídos de simbion tes bacterianos parecem os cloroplastos e as mitocôndrias, as organelas produtoras de energia dos eucariotos. Existem consideráveis evidências que levam à conclusão de que os an cestrais dessas organelas eram endossimbiontes, procariotos que estabeleceram simbiose no interior da membrana celular do hospedeiro eucariótico ancestral. A presença de inúmeras cópias das organelas pode ter contribuído para o tamanho re lativamente grande das células eucarióticas e sua capacidade de especialização, característica que se reflete na evolução dos organismos multicelulares diferenciados.

Classificação dos procariotos Para a compreensão de qualquer grupo de microrganismos, é necessário conhecer sua classificação. Um sistema de clas sificação apropriado possibilita ao cientista selecionar as ca racterísticas que irão tornar possível uma rápida e acurada categorização de um organismo recém-descoberto. A catego rização possibilita a previsão de muitos outros traços compar tilhados por outros membros da categoria. Em um ambiente hospitalar, a classificação bem-sucedida de determinado mi crorganismo patogênico pode fornecer a rota mais direta pa ra sua eliminação. A classificação também pode proporcionar uma compreensão abrangente das relações entre diferentes or ganismos, informação capaz de assumir grande valor prático. Por exemplo, a eliminação de um microrganismo patogênico será relativamente prolongada se o seu habitat estiver ocupado por uma variante não patogênica. Os princípios de classificação dos procariotos são discuti dos no Capítulo 3. No início, é preciso reconhecer que qual quer característica de um procarioto pode servir como um possível critério de classificação. Entretanto, nem todos os critérios são igualmente eficazes no agrupamento dos organis mos. Possuir DNA, por exemplo, não é um critério útil para se distinguirem os organismos, visto que todas as células contêm DNA. A presença de um plasmídeo com ampla variedade de hospedeiros não constitui um critério útil, uma vez que esses plasmídeos podem ser encontrados em diversos hospedeiros e não estar presentes o tempo todo. Para serem úteis, os critérios devem ser estruturais, fisiológicos, bioquímicos ou genéticos. Os esporos - estruturas celulares especializadas que podem permitir a sobrevida do organismo em ambientes extremos constituem critérios estruturais úteis para a classificação, visto que existem subgrupos bem caracterizados de bactérias que formam esporos. Alguns grupos de bactérias podem ser efetiva mente subdivididos com base na sua capacidade de fermentar

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SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

carboidratos específicos, critérios que podem ser ineficazes quando aplicados a outros grupos de bactérias que não tenham qualquer capacidade fermentativa. Um teste bioquímico, a co loração de Gram, constitui um critério eficaz de classificação, já que a resposta ao corante reflete diferenças fundamentais e complexas na superfície celular bacteriana, dividindo a maior parte das bactérias em dois grupos principais. Os critérios genéticos vêm sendo cada vez mais usados para a classificação das bactérias, e muitos deles tornaram-se possíveis em virtude do desenvolvimento de tecnologias baseadas na de tecção do DNA. Na atualidade, é possível construir sondas gené ticas ou realizar ensaios de amplificação de DNA (p. ex., testes de reação em cadeia da polimerase - PCR) capazes de identificar rapidamente os organismos que transportam regiões genéticas específicas com ancestral comum. A comparação de sequências de DNA para alguns genes levou à elucidação das relações :fi logenéticas entre os procariotos. Pode-se determinar a origem de linhagens celulares ancestrais, e os microrganismos podem ser agrupados com base nas suas afinidades evolutivas. Essas in vestigações levaram a algumas conclusões notáveis. Assim, por exemplo, a comparação de sequências do citocromo C sugere que todos os eucariotos, inclusive seres humanos, provêm de um de três diferentes grupos de bactérias fotossintéticas de cor púrpura. Tal conclusão explica em parte a origem evolutiva dos eucariotos, mas não leva totalmente em conta o ponto de vista geralmente aceito de que a célula eucariótica originou-se da fusão evolutiva de diferentes linhagens de células procarióticas.

Bactérias e arqueobactérias: as principais subdivisões dentro de procariotos Um grande sucesso na filogenia molecular consistiu na demons tração de que os procariotos são classificados em dois prin cipais grupos. A maioria das pesquisas foi dirigida para um grupo, o das bactérias. O outro grupo, constituído pelas ar queobactérias, tem recebido relativamente pouca atenção até o momento, em parte pelo fato de ser difícil estudar muitos de seus representantes em laboratório. Por exemplo, algumas arqueobactérias morrem ao entrar em contato com o oxigê nio, enquanto outras crescem a temperaturas superiores à da ebulição da água. Antes mesmo de se obterem evidências mo leculares, os principais subgrupos de arqueobactérias pareciam distintos. Os metanógenos efetuam uma respiração anaeróbia que dá origem ao metano; os halófilos exigem concentrações de sal extremamente altas para o seu crescimento; e os ter moacidófilos necessitam de temperaturas altas e acidez. Na atualidade, sabe-se que esses procariotos compartilham carac terísticas bioquímicas, tais como componentes da parede ce lular ou da membrana, que distinguem totalmente o grupo de todos os outros organismos vivos. Uma característica curiosa, compartilhada por arqueobactérias e eucariotos, é a presença de íntrons no interior dos genes. A função dos íntrons - seg mentos de DNA que interrompem o DNA informativo no in terior dos genes - ainda não foi estabelecida. O que sabemos é que os íntrons representam uma característica fundamental compartilhada pelo DNA das arqueobactérias e dos eucariotos. Esse traço comum sugere que - assim como as mitocôndrias e os cloroplastos parecem representar derivados evolutivos das bactérias - o núcleo dos eucariotos teria se originado de um ancestral arqueobacteriano.

PROTISTAS O "núcleo verdadeiro" dos eucariotos (do grego karyon, "nú cleo") representa apenas uma de suas características diferenciais. As organelas delimitadas por membrana, os microtúbulos e os microfilamentos dos eucariotos formam uma estrutura intrace lular complexa diferente daquela encontrada nos procariotos. Os agentes responsáveis pela motilidade das células eucarióti cas são os flagelos ou cílios - estruturas complexas constituídas de inúmeros filamentos que não se assemelham aos flagelos dos procariotos. A expressão gênica nos eucariotos ocorre por meio de uma série de eventos que levam à integração fisiológica do núcleo com o retículo endoplasmático, estrutura sem equivalên cia nos procariotos. Os eucariotos diferem pela organização de seu DNA celular em cromossomos separados por um aparelho mitótico distinto durante a divisão celular. Em geral, a transferência genética entre os eucariotos de pende da fusão dos gametas haploides para formar uma célula diploide que contém um conjunto completo de genes derivados de cada gameta. O ciclo de vida de muitos eucariotos encontra se quase totalmente no estado diploide, forma não encontrada nos procariotos. A fusão dos gametas para formar uma progênie reprodutiva é um evento altamente específico que estabelece a base para a espécie eucariótica. Esse termo só pode ser aplica do metaforicamente aos procariotos, que trocam fragmentos de DNA no processo de recombinação. Os agrupamentos taxonô micos dos eucariotos baseiam-se frequentemente em proprie dades morfológicas compartilhadas, e é digno de nota o fato de muitos determinantes taxonomicamente úteis serem os as sociados à reprodução. Quase todas as espécies bem-sucedidas de eucariotos são aquelas cujas células estão estreitamente rela cionadas, membros da mesma espécie, podendo recombinar-se para formar descendentes viáveis. As estruturas que contribuem direta ou indiretamente para o evento reprodutivo tendem a ser altamente desenvolvidas e com modificações menores entre es pécies estreitamente relacionadas extensamente conservadas. Os eucariotos microbianos - protistas - são membros dos quatro grupos principais: algas, protozoários, fungos e mi xomicetos. É preciso ressaltar que esses agrupamentos não são necessariamente filogenéticos. Os microrganismos estreita mente relacionados podem ser categorizados separadamente, visto que certas semelhanças bioquímicas e genéticas subjacen tes podem não ter sido reconhecidas.

Algas O termo "algas" foi utilizado durante muito tempo para des crever todos os organismos que geram 02 como produto da fotossíntese. Um importante subgrupo desses organismos - as bactérias azul-esverdeadas, ou cianobactérias - consiste em pro cariotos, de modo que esses microrganismos não são mais deno minados algas. Tal classificação é reservada exclusivamente aos organismos eucarióticos fotossintéticos. Todas as algas contêm clorofila na membrana fotossintética de seus cloroplastos subce lulares. Muitas espécies de algas são microrganismos unicelulares. Outras algas podem formar estruturas multicelulares extrema mente grandes. Os kelps* de algas pardas possuem, às vezes, * N. de RT. Kelps são algas grandes pertencentes à classe Phaeophyta. Algumas espécies podem ser muito longas e formar "florestas de kelps".

CAPÍTULO 1

A ciência da microbiologia

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Fungos

FIGURA 1.3 Microscopia eletrônica de varredura (ampliada 4.000 vezes) do dinoflagelado Gymnodinium. (Reproduzida, com autorização, de David M. Phillips/Visuals Unlimited.)

várias centenas de metros de extensão. Muitas algas produzem toxinas que são venenosas para o homem e outros animais. Os dinoflagelados, algas unicelulares, causam proliferação de algas, ou a maré vermelha, nos oceanos (Fig. 1.3). As marés vermelhas causadas pelas espécies de dinoflagelados Gonyaulax são preo cupantes, pois este organismo produz neurotoxinas, tais como a saxitoxina e a goniautoxina, que se acumula em mariscos (p. ex.: moluscos, mexilhões, vieiras e ostras) que se alimentam deste organismo. A ingestão desses mariscos pelo ser humano resulta em sintomas de paralisia por envenenamento, que pode levar à morte.

Protozoários Os protozoários são protistas unicelulares incapazes de reali zar fotossíntese. Os protozoários mais primitivos parecem for mas flageladas que, em muitos aspectos, assemelham-se aos representantes das algas. Aparentemente, os ancestrais desses protozoários eram algas que se tornaram heterótrofos as necessidades nutricionais desses organismos são supridas por compostos orgânicos. A adaptação a um modo heterotrófico de vida foi às vezes acompanhada da perda dos cloroplastos, e, assim, as algas deram origem aos protozoários estreitamente re lacionados. Foram observados eventos semelhantes em labora tório como resultado de mutações ou adaptações fisiológicas. Os protozoários flagelados parecem ter evoluído para os ti pos ameboides e ciliados. Formas intermediárias são conhecidas e podem apresentar flagelos em um estágio do seu ciclo de vida e pseudópodes (característicos das amebas) em outro estágio. Um quarto grupo importante de protozoários, os esporozoários, é constituído por parasitos estritos, em geral imóveis; a maior par te desses grupos reproduz-se sexuada ou assexuadamente, alter nando gerações por meio de esporos. Os protozoários parasitos de seres humanos são discutidos no Capítulo 46. -

Os fungos são protistas não fotossintéticos que crescem co mo uma massa de filamentos ramificados e entrelaçados ("hi fas"), conhecida como micélio. O maior micélio em extensão contínua produzido por um fungo foi encontrado no leste do 2 Ogegon (EUA) abrangendo uma área de 2.400 acres (9,7 km ). Embora as hifas exibam paredes transversais, tais paredes são perfuradas, permitindo a livre passagem dos núcleos e do ci toplasma. Por conseguinte, o microrganismo como um todo é um cenócito (massa multinucleada de citoplasma contínuo) confinado dentro de uma série de tubos ramificados. Esses tubos, constituídos de polissacarídeos, como a quitina, são homólogos às paredes celulares. As formas miceliais são de nominadas bolores; alguns tipos, conhecidos como leveduras, não formam micélio, mas são facilmente reconhecidos como fungos pela natureza de seus processos de reprodução sexuada e pela presença de formas de transição. Os fungos provavelmente representam um ramo evolutivo dos protozoários. Não têm qualquer relação com os actinomi cetos, que consistem em bactérias miceliais com as quais se as semelham superficialmente. As principais subdivisões (phyla) dos fungos são: Chytridiomycota, Zygomycota (os zigomicetos), Ascomycota (os ascomicetos), Basidiomycota (os basidiomice tos) e os "deuteromicetos" (ou fungos imperfeitos). A evolução dos ascomicetos a partir dos ficomicetos é ob servada em um grupo de transição cujos membros formam um zigoto, que, em seguida, se transforma diretamente em asco. Acredita-se que os basidiomicetos tenham evoluído a partir dos ascomicetos. A classificação dos fungos e seu significado clínico são discutidos em detalhes no Capítulo 45.

Mixomicetos São microrganismos que se caracterizam pela presença, em um estágio do seu ciclo de vida, de uma massa de citoplasma mul tinucleada e ameboide denominada plasmódio. O plasmódio de um mixomiceto é uma estrutura análoga ao micélio de um fungo verdadeiro. Ambos são cenocíticos. No micélio, o fluxo citoplasmático limita-se à rede ramificada de tubos de quitina, ao passo que, no plasmódio, o citoplasma pode fluir em todas as direções. Esse fluxo faz que o plasmódio migre na direção de sua fonte alimentar, que frequentemente consiste em bactérias. Em resposta a um sinal químico (p. ex.: o AMP cíclico 3' 5' [Cap. 7]), o plasmódio, que atinge um tamanho macroscópico, diferencia se em um corpo pedunculado capaz de produzir células móveis, flageladas ou ameboides. Essas células iniciam uma nova etapa no ciclo de vida do mixomiceto (Fig. 1.4). Com frequência, o ciclo é iniciado por fusão sexual de células individuais. O ciclo de vida dos mixomicetos ilustra um tema central deste capítulo: a interdependência das formas vivas. O cresci mento dos mixomicetos depende de nutrientes fornecidos por células bacterianas ou, em alguns casos, por células vegetais. A reprodução dos mixomicetos via plasmódios pode depen der do reconhecimento intercelular e da fusão entre células da mesma espécie. Para uma compreensão mais completa de um microrganismo, é necessário não apenas o conhecimento dos outros organismos com os quais ele coevoluiu como também uma apreciação sobre a variedade de respostas fisiológicas ca pazes de contribuir para a sua sobrevivência.

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

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Esporos Corpos de frutificação liberando esporos

Germinação

Mixamoeba

Corpo de frutificação

�

�---".... " _ ._ __

Plasmódio

A

B

FIGURA 1.4 Mixomicetos. (A) Ciclo de vida de um mixomiceto acelular. (8) Corpo de frutificação de um mixomiceto acelular. (Reproduzida, com autorização, de Carolina Biological Supply/Phototake, lnc.)

RESUMO DO CAPÍTULO *

*

*

* * *

*

Os microrganismos são um grupo grande e diversificado que abrangem seres uni e pluricelulares; eles também in cluem vírus, que são microscópios, porém não celulares. Um vírus consiste em uma molécula de ácido nuclei co (DNA ou RNA) envolvida por proteínas, que formam o capsídeo. Alguns vírus podem apresentar um envelope composto por lipídeos, proteínas e carboidratos. Um príon é uma proteína infectante capaz de causar doenças neurológicas crônicas. Procariotos são divididos em bactérias e arqueobactérias. Procariotos são haploides. Eucariotos inferiores, ou protistas, estão representados em quatro grupos principais: algas, protozoários, fungos e mi xomicetos. Eucariotos possuem membrana nuclear e são diploides.

QUESTÕES DE REVISÃO 1. Qual dos seguintes termos caracteriza a interação entre um fungo e uma alga em um líquen? (A) (B) (C) (D) (E)

Parasitismo Simbiose Endossimbiose Endoparasitismo Consórcio

2. Qual dos seguintes agentes não possui ácido nucleico? (A) (B) (C) (D) (E)

Bactéria Vírus Viroide Príon Protozoário

3. Qual dos seguintes organismos não é um protista? (A) (B) (C) (D) (E)

Bactéria Alga Protozoário Fungo Mixomiceto

4. Qual dos seguintes agentes contém simultaneamente DNA e RNA? (A) (B) (C) (D) (E)

Bactéria Vírus Viroide Príon Plasmídeo

5. Um homem de 65 anos de idade desenvolveu demência progres siva no decorrer de alguns meses, com ataxia e sonolência. O perfil eletroencefalográfico mostrou paroxismos com altas vol tagens e ondas lentas, sugestivos de doença de Creutzfeldt-Jakob. Esta doença é causada por qual dos seguintes agentes? (A) (B) (C) (D) (E)

Bactéria Vírus Viroide Príon Plasmídeo

6. Qual dos seguintes microrganismos não é infectado por vírus? (A) (B) (C) (D) (E)

Bactéria Protozoário Células humanas Vírus Nenhuma das opções acima

7. Vírus, bactérias e protozoários são caracterizados unicamente por seus respectivos tamanhos. Verdadeiro ou falso? (A) Verdadeiro (B) Falso

CAPÍTULO 1 8. Qual dos seguintes microrganismos é um procarioto? (A) (B) (C) (D) (E)

Arqueobacteria Protozoário Vírus Príon Fungo

9. Quorum sensing em procariotos envolve: (A) (B) (C) (D)

Comunicação intercelular Produção de feromônios Um exemplo de comportamento multicelular Regulação de genes envolvidos em diversos processos fisio lógicos (E) Todas as respostas acima

10. Vinte minutos após a ingestão de mariscos crus, um homem de 35 anos de idade apresentou parestesia facial e nas extremidades, cefaleia e ataxia. Esses sintomas são resultados de uma neuroto xina produzida por algas chamadas: (A) (B) (C) (D) (E)

Ameba Cianobactéria Dinoflagelado Kelp Nenhuma das respostas acima

Respostas 1. B

4. A

7. B

2. D

5. D

8. A

3. A

6. E

9. E

10. e

A ciência da microbiologia

9

REFERÊNCIAS Arslan D, Legendre M, Seltzer V. et al.: Distant Mimivirus relative with a larger genome highlights the fundamental features of Megaviri dae. Proe Natl Aead Sei U S A 2011;108:17486. Belay ED: Transmissible spongiform encephalopathies in humans. Annu Rev Mierobiol 1999;53:283. Colby DW, Prusiner SB: De novo generation of prion strains. Nature Rev Mierobiol 201 1;9:771. Diener TO: Viroids and the nature of viroid diseases. Areh Virol 1999;15(Suppl):203. Fournier PE, Raoult D: Prospects for the future using genomics and proteomics in clinicai microbiology. Annu Rev Mierobiol 2011;65:169. Lederberg J (editor): Eneyelopedia of Mierobiology, 4 vols. Academic Press, 1992. Olsen GJ, Woese CR: The winds of (evolutionary) change: Breathing new life into microbiology. J Baeteriol 1994;176:1. Pelczar MJ Jr, Chan ECS, Krieg NR: Mierobiology: Coneepts and Appli eations. McGraw-Hill, 1993. Priola SA: How animal prions cause disease in humans. Mierobe 2008; 3:568. Prusiner SB: Biology and genetics of prion diseases. Annu Rev Miero biol l 994;48:655. Reisser W (editor): Algae and Symbiosis: Plants, Animais, Pungi, Viruses, Interaetions Explored. Biopress, 1992. Schloss PD, Handlesman J: Status of the microbial census. Mierobiol Mol Biol Rev 2004;68:686. Sleigh MA: Protozoa and Other Protists. Chapman & Hall, 1990. Whitman WB, Coleman DC, Wiebe WJ: Prokaryotes: The unseen majority. Proe Natl Aead Sei U S A l998;95:6578.

C A PÍT U L O

Estrutura celular

INTRODUÇÃO Neste capítulo, discutimos a estrutura básica e a função dos componentes que constituem as células eucarióticas e as pro carióticas. O capítulo inicia-se com uma discussão sobre o microscópio. Historicamente, foi o microscópio que primeira mente revelou a presença das bactérias e, mais tarde, os segre dos da estrutura celular. Hoje, continua sendo uma poderosa ferramenta em biologia celular.

MÉTODOS ÓPTICOS O microscópio óptico O poder de resolução do microscópio óptico, em condições ide ais, corresponde aproximadamente a metade do comprimento de onda da luz utilizada. (O poder de resolução refere-se a dis tância que deve separar dois pontos de luz para que sejam vis tos como duas imagens distintas.) No caso da luz amarela, cujo comprimento de onda é de 0,4 µm, o menor diâmetro separá vel é, portanto, de cerca de 0,2 µm, ou seja, um terço da largura de uma célula procariótica típica. A ampliação útil no micros cópio é a que possibilita a visualização das menores partículas passíveis de resolução. Em geral, vários tipos de microscópio óptico são empregados em microbiologia.

A. Microscópio de campo luminoso (microscópio óptico comum) O microscópio de campo luminoso é o mais empregado em microbiologia de rotina, e consiste em duas séries de lentes (objetiva e ocular), que funcionam em conjunto na resolução de imagens. Estes microscópios geralmente empregam uma objetiva com poder de aumento de 100 vezes, com uma ocular de aumento de 10 vezes, aumentando a amostra 1.000 vezes. Por conseguinte, as partículas com 0,2 µm de diâmetro são am pliadas até cerca de 0,2 mm, tornando-se nitidamente visíveis. A ampliação adicional não proporciona maior resolução dos detalhes, e pode reduzir a área visível (campo). Com esse microscópio, as amostras são visualizadas devido a diferenças de contraste entre elas e o meio ao redor. Muitas bactérias são difíceis de visualizar devido à perda de contraste com o meio. Corantes podem ser usados para corar células ou suas organelas e aumentar seu contraste de modo a tornar mais fácil a visualização em microscopia de campo luminoso.

B. Microscópio de contraste de fase O microscópio de contraste de fase foi desenvolvido para au mentar as diferenças de contraste entre as células e o meio ao redor, tornando possível que as células vivas sejam vistas sem que precisem ser coradas; com microscópios de campo lumi noso, é preciso empregar preparações que coram e matam a célula. O microscópio de contraste de fase tem como vantagem o fato de que as ondas de luz passam através de objetos trans parentes, tais como as células, aparecendo em diferentes fases, dependendo das propriedades dos materiais através dos quais elas passam. Esse efeito é ampliado por um anel especial nas lentes da objetiva do microscópio de contraste de fase, o que leva à formação de imagem escura em forma de luz de fundo.

C. Microscópio de campo escuro O microscópio de campo escuro é um microscópio óptico no qual o sistema de iluminação foi modificado para atingir somente os lados da amostra. Isso é obtido pelo uso de um condensador especial que bloqueia tanto os raios da luz dire ta quanto a luz refletida para o exterior através de um espe lho posicionado ao lado do condensador em ângulo oblíquo. Cria-se assim um "campo escuro" que contrasta com a borda sombreada das amostras, surgindo quando os raios oblíquos são refletidos a partir das bordas da amostra em direção ascen dente à objetiva do microscópio. A resolução obtida por um microscópio de campo escuro é bastante elevada. Assim, essa técnica foi particularmente valiosa na observação de certos or ganismos, como o Treponema pallidum, um espiroqueta com menos de 0,2 µm de diâmetro e que não pode ser observado com um microscópio óptico convencional ou de contraste de fase (Fig. 2.lA).

D. Microscópio de fl uorescência O microscópio de fluorescência é utilizado para visualização de amostras que fluorescem, que é a faculdade de absorver a luz em comprimentos de onda curtos (ultravioleta) e não brilhar em comprimentos de onda mais longos (luz visível). Alguns organismos fluorescem naturalmente devido à presen ça de substâncias fluorescentes naturais presentes no interior das células, tais como a clorofila. Aqueles que não apresentam fluorescência natural podem ser corados com um grupo de co rantes fluorescentes, chamados fluorocromos. O microscópio de fluorescência é amplamente utilizado em diagnósticos de microbiologia clínica. Por exemplo, o fluorocromo auramina O,

12

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia que dá um brilho amarelo quando exposto à luz ultravioleta, é fortemente absorvido pelo Mycobacterium tuberculosis, a bacté ria que causa a tuberculose. Quando o corante é aplicado a uma amostra sob suspeita de conter o M. tuberculosis e exposta à luz ultravioleta, a bactéria pode ser detectada pela aparência dos or ganismos com um brilho amarelo contra um fundo escuro. O principal uso da microscopia de fluorescência é na técni ca de diagnóstico chamada técnica do anticorpo fluorescente (FA, fluorescent-antibody) ou imunofluorescência. Por essa técnica, anticorpos específicos (p. ex., anticorpos contra a Le gionella pneumophila) são marcados quimicamente com um fluorocromo, como o isotiocianato de fluoresceína (FITC, fluorescein isothiocyanate). Em seguida, tais anticorpos fluo rescentes são adicionados a uma lâmina de microscópio que contém a amostra clínica. Se a amostra contiver L. pneumophi la, o anticorpo fluorescente se liga aos antígenos de superfície da bactéria, produzindo fluorescência quando exposto à luz ultravioleta (Fig. 2.lB). E. Microscópio de interferência diferencial

A

B

de contraste Os microscópios de interferência diferencial de contraste (DIC, differential interference contrast) utilizam um polarizador para produzir luz polarizada. Os feixes de luz polarizada passam atra vés de um prisma que vai gerar dois tipos distintos de feixes, os quais passam através da amostra e entram nas lentes da objetiva, onde são recombinados em um feixe simples. Devido às ligeiras diferenças do índice de refração das substâncias para cada feixe que passa por elas, os feixes combinados não ficam totalmente na mesma fase; em vez disso, criam um efeito de interferência que intensifica as sutis diferenças na estrutura celular. Estrutu ras, como esporos, vacúolos e grânulos, aparecem em forma tri dimensional. A microscopia de DIC é particularmente útil para a observação de células não coradas devido à sua capacidade de gerar imagens que revelam estruturas celulares internas, menos aparentes pelas técnicas de microscopia óptica.

O microscópio eletrônico

e

FIGURA 2.1 (A) Exame positivo de microscopia de campo escuro. Os treponemas são reconhecíveis pela sua forma espiralada característica e os movimentos deliberados para a frente e para trás com rotação em torno do eixo longitudinal. (Reproduzida, com autorização, de Charles Stratton/Visuals Unlimited.) (8) Fotomicrografia de fluorescência. Bas tonetes marcados com corante fluorescente. (© Evans Roberts) (C) Mi croscopia eletrônica de varredura da bactéria - Staphylococcus aureus (ampliada 32.000 vezes). Reproduzida, com autorização, de David M. Phillips/Photo Researchers, lnc.)

O alto poder de resolução dos microscópios eletrônicos pos sibilitou aos cientistas observar em detalhes as estruturas das células procarióticas e das eucarióticas. A resolução superior do microscópio eletrônico deve-se ao fato de os elétrons terem um comprimento de onda muito mais curto do que o dos fó tons de luz branca. Existem dois tipos de microscópio eletrônico de uso geral: o microscópio eletrônico de transmissão (MET), que tem muitas características em comum com o microscópio óptico, e o microscópio eletrônico de varredura (MEV). O MET foi o primeiro a ser desenvolvido, e utiliza um feixe de elétrons emi tido de um canhão, que é direcionado ou focalizado por um condensador eletromagnético sobre uma amostra delgada. À medida que os elétrons incidem na amostra, são dispersos dife rencialmente de acordo com o número e a massa de átomos na amostra; alguns elétrons atravessam a amostra, sendo reunidos e focalizados por uma lente objetiva eletromagnética que for nece uma imagem da amostra ao sistema de lentes projetoras para maior ampliação. A imagem é visualizada ao incidir em uma tela que fluoresce com a incidência dos elétrons, e pode

CAPÍTULO 2 Estrutura celular ser registrada em filme fotográfico. O MET tem uma capaci dade de resolução de 0,001 µm para as partículas distantes. Os vírus, com diâmetros de 0,01 a 0,2 µm, podem ser facilmente observados. Em geral, o MEV tem menor poder de resolução do que o MET, mas é particularmente útil ao fornecer imagens tridi mensionais da superfície dos materiais microscópicos. Os elé trons são focados através de lentes em um ponto muito fino. A interação dos elétrons com a amostra resulta na liberação de diferentes formas de radiação (p. ex., elétrons secundários) da superfície do material, que podem ser capturadas por um detector apropriado, ampliadas e, em seguida, apresentadas em forma de imagem na tela de uma televisão (Fig. 2.lC). Uma técnica importante em microscopia eletrônica consis te no uso de "sombreamento". Esta técnica envolve a deposição de uma fina camada de metal pesado (p. ex.: platina) sobre a amostra, colocando-a no trajeto de um feixe de íons metálicos no vácuo. O feixe é direcionado obliquamente até a amostra, de modo que esta adquire uma "sombra" na forma de uma área não revestida no lado oposto. Quando um feixe de elétrons atravessa a preparação recoberta no microscópio eletrônico e forma-se uma cópia positiva da imagem "negativa", obtém-se um efeito tridimensional (p. ex., Fig. 2.22). Outras técnicas importantes de microscopia eletrônica consistem no uso de cortes ultrafinos de material embebido; um método de congelamento-ressecamento de amostras que impede a deformação causada pelos procedimentos conven cionais de ressecamento; e a utilização de coloração negativa com material de alta densidade de elétrons, como o ácido fos fotúngstico ou sais de uranil (Fig. 42.1). Na ausência desses sais de metais pesados, não haveria contraste suficiente para detec tar os detalhes da amostra.

Microscópio de varredura confocal a laser O microscópio de varredura confocal a laser (MVCL) acopla uma fonte de raio laser à luz do microscópio. Na microsco pia de varredura confocal a laser, um feixe de laser é espalhado contra um espelho que o direciona através de um orifício que ajusta precisamente o plano de foco do feixe a uma camada vertical no interior da amostra. Pela iluminação precisa de um único plano da amostra, a intensidade de iluminação cai rapi damente acima e abaixo do plano de foco, e a luz se perde para outros planos de focos, minimizados. Assim, em uma amos tra relativamente espessa, podem-se observar várias camadas ajustando-se o plano de foco da luz a laser. Certas células são frequentemente coradas com corantes fluorescentes para que se tornem mais visíveis. Como alterna tiva, imagens com falsas cores podem ser geradas pelo ajuste do microscópio de modo que diferentes camadas apresentem dife rentes colorações. Os MVCL são equipados com um programa de computador para agrupar imagens digitais e processá-las posteriormente. Assim, as imagens obtidas de diferentes cama das podem ser armazenadas e superpostas digitalmente para se reconstruir uma imagem tridimensional da amostra inteira.

Microscópios de varredura por sonda Uma nova classe de microscópios, chamados microscópios de varredura por sonda, medem as características da superfície

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pelo movimento de uma sonda pontiaguda sobre a superfí cie do objeto. A microscopia de varredura por tunelamento e o microscópio de força atômica são exemplos dessa nova classe de microscópios, que possibilitam aos cientistas visua lizar átomos ou moléculas na superfície de uma amostra. Por exemplo, as interações entre as proteínas de uma bactéria Es cherichia coli podem ser estudadas com um microscópio de força atômica.

ESTRUTURA DA CÉLULA EUCARIÓTICA O núcleo O núcleo contém o genoma da célula, e é delimitado por uma membrana que consiste em um par de membranas separadas por um espaço de espessura variável. A membrana interna é geralmente um saco simples, mas a membrana externa é, em muitos casos, contínua ao retículo endoplasmático (RE). A membrana nuclear exibe permeabilidade seletiva devido à presença de poros que consistem em um complexo de diver sas proteínas cuja função é importar e exportar substâncias de/para dentro ou de/para fora do núcleo. Os cromossomos das células eucarióticas contêm macromoléculas de DNA lineares, dispostas em dupla hélice, visíveis ao microscópio óptico apenas quando a célula sofre divisão, e o DNA encon tra-se em uma forma altamente condensada; nas outras fases do ciclo, os cromossomos não estão condensados e apresen tam o aspecto mostrado na Figura 2.2. As macromoléculas de DNA da célula eucariótica estão associadas a proteínas básicas, denominadas histonas, que se ligam ao DNA por in terações iônicas. Uma estrutura frequentemente visível no interior do nú cleo é o nucléolo, uma área rica em RNA, o local da síntese do RNA ribossômico (Fig. 2.2). As proteínas ribossômicas sinte tizadas no citoplasma são transportadas ao nucléolo e combi nam-se com o RNA ribossômico para formar as subunidades (grande e pequena) do ribossomo eucariótico. Em seguida, são exportadas para o citoplasma, onde se associam para for mar um ribossomo intacto que pode funcionar na síntese das prote1nas. ,

Estruturas citoplasmáticas O citoplasma das células eucarióticas caracteriza-se pela pre sença do RE, vacúolos, plastídeos autorreprodutivos e um citoesqueleto elaborado, constituído de microtúbulos, micro ftlamentos e filamentos intermediários. O retículo endoplasmático (RE) é uma rede de membra nas ligadas por canais contínuos à membrana nuclear. São re conhecidos dois tipos de RE: o rugoso, que contém ribossomos SOS ligados, e o liso, que não os possui (Fig. 2.2). O RE rugoso é o principal produtor de glicoproteínas e produz o material da nova membrana, transportada através da célula. O RE liso participa da síntese dos lipídeos e, em alguns aspectos, do me tabolismo dos carboidratos. O aparelho de Golgi consiste em vesículas de membranas que funcionam em conjunto com o RE para modificar quimicamente e transformar os produtos do RE destinados a serem secretados e que atuam em outras estruturas da membrana da célula.

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SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

FIGURA 2.2 Micrografia eletrônica de um corte fino de um núcleo

eucariótico típico mostrando um nucléolo proeminente e grandes agregações de heterocromatina contra a membrana nuclear, atravessa da por poros (setas). Quadro superior à esquerda. Dois poros nucle ares com seus diafragmas. Quadro inferior à direita. Lâmina fibrosa presente na face interna do envelope nuclear. O retículo endoplasmáti co e várias mitocôndrias são visíveis no citoplasma. (Reproduzida, com autorização, de Fawcett DW: Bloom and Fawcett. A Textbook ofHistology, 12th ed. Copyright © 1994. Com autorização de Chapman & Hall, New York, NY, EUA.)

Os plastídeos consistem nas mitocôndrias e nos cloro plastos. Diversas linhas de evidência sugerem que as mitocôn drias e cloroplastos eram descendentes de antigos organismos procarióticos, tendo surgido do engolfamento de uma célula procariótica por uma célula maior (endossimbiose). As mito côndrias apresentam o tamanho de procariotos, e sua membra na, que perdeu esteróis, é muito menos rígida que a membrana citoplasmática das células eucarióticas, que contêm esteróis. A mitocôndria possui dois grupos de membranas. A membrana externa é semipermeável e possui inúmeros pequenos canais que permitem a passagem de íons e pequenas moléculas (p. ex., adenosina trifosfato [ATP] ). A invaginação da membrana ex terna forma um sistema de membranas externas dobradas, de nominadas cristas, locais das enzimas envolvidas na respiração e na produção de ATP. As cristas também contêm proteínas de transporte específicas que regulam a passagem dos metabólitos para dentro e para fora da matriz mitocondrial. Esta contém

várias enzimas, em particular as ligadas ao ciclo do ácido cí trico. Os cloroplastos são organelas de células fotossintéticas capazes de converter a energia da luz solar em energia quími ca através da fotossíntese. A clorofila e os outros componen tes necessários à fotossíntese estão localizados em uma série de membranas de discos flutuantes que se chamam tilacoides. A forma, o tamanho e o número dos cloroplastos por célula variam bastante. Diferentemente da mitocôndria, os cloro plastos são, em geral, muito maiores do que os procariotos. As mitocôndrias e os cloroplastos contêm seu próprio DNA, que existe em uma forma covalente circular fechada e codifica para algumas (não todas) das proteínas que o compõem e RNA de transferência. As mitocôndrias e os cloroplastos também con têm ribossomos 70S, da mesma maneira que os procariotos. Alguns microrganismos eucarióticos (p. ex., Trichomonas vaginalis) não possuem mitocôndria e em seu lugar apresen tam uma membrana próxima a uma organela respiratória, chamada hidrogenossomo. Os hidrogenossomos podem ter surgido por endossimbiose, e foram identificados alguns que contêm DNA e ribossomos. O hidrogenossomo, de tamanho quase similar ao da mitocôndria, não possui cristas e nem as enzimas do ciclo do ácido tricarboxílico. O piruvato é retira do pelo hidrogenossomo, e são produzidos H 2, C02, acetato e ATP. Os lisossomos são sacos ligados à membrana que contêm várias enzimas digestivas utilizadas pela célula para digerir as macromoléculas, tais como proteínas, ácidos graxos e po lissacarídeos. O lisossomo permite que essas enzimas sejam separadas do citoplasma, pois elas podem destruir as macro moléculas celulares se não forem controladas. Após a hidrólise das macromoléculas nos lisossomos, os monômeros resultan tes passam através do lisossomo para o citoplasma, onde ser vem como nutrientes. O peroxissomo é uma estrutura ligada à membrana cuja fun ção é produzir H202 pela redução de 02 a partir de vários doa dores de hidrogênio. O H202 produzido no peroxissomo é sub sequentemente degradado em H20 e 02 pela enzima catalase. O citoesqueleto é uma estrutura tridimensional que preen che o citoplasma. Os tipos primários de fibra, compreendendo o citoesqueleto, são os microfilamentos, os filamentos inter mediários e os microtúbulos. Os microftlamentos, que pos suem cerca de 3 a 6 nm de diâmetro, são polímeros compostos de subunidades da proteína actina. Estas fibras formam enve lope em torno da célula, definindo e mantendo a forma da cé lula. Os microfilamentos também podem ser responsáveis por movimentos celulares, como os de deslizamento, contração e citocinese. Os microtúbulos são tubos cilíndricos, de 22 a 25 nm de diâmetro, compostos por subunidades da proteína tubulina. Essas estruturas auxiliam os microftlamentos na manutenção da estrutura celular, na formação de fibras finas para a sepa ração dos cromossomos durante a mitose, e desempenham importante papel na motilidade celular. Os filamentos inter mediários possuem cerca de 10 nm de diâmetro e fornecem força tensional à célula.

Camadas superficiais O citoplasma é limitado por uma membrana plasmática, com posta de proteínas e fosfolipídeos, semelhante à membrana da

CAPÍTULO 2

Estrutura celular

15

(p. ex., Paramecium), que exibem movimento semelhante a uma onda para impulsionar a célula através da água. Os fla gelos das células eucarióticas originam-se da região polar da célula, enquanto os cílios, mais curtos que os flagelos, cir cundam a célula (Fig. 2.3). Tanto os flagelos quanto os cílios das células eucarióticas possuem a mesma estrutura básica e composição bioquímica idêntica. Ambos consistem em uma série de microtúbulos, cilindros proteicos ocos constituídos de uma proteína denominada tubulina, circundados por uma membrana. A disposição dos microtúbulos é denominada "sistema 9 + 2", visto que consiste em nove pares periféri cos de microtúbulos circundando dois microtúbulos centrais (Fig. 2.4).

20µm

FIGURA 2.3 Um paramécio se movimentando com o auxílio de cí lios presentes na superfície celular. (© Manfred Kage).

célula procariótica ilustrada adiante (Fig. 2.10). A maioria das células animais não tem outras camadas superficiais; entretan to, as células vegetais apresentam uma parede celular externa composta de celulose. Muitos microrganismos eucarióticos também possuem uma parede celular externa, que pode ser constituída de um polissacarídeo, como a celulose ou a quitina, ou de material inorgânico, como, por exemplo, a parede de sí lica das diatomáceas.

Organelas de motilidade Muitos microrganismos eucarióticos possuem organelas de nominadas flagelos (p. ex., Trichomonas vaginalis) ou cílios

ESTRUTURA DA CÉLULA PROCARIÓTICA A célula procariótica é mais simples que a eucariótica em todos os níveis, com uma única exceção: seu envelope celular é mais complexo.

O nucleoide Os procariotos não possuem um núcleo verdadeiro; em vez disso, o DNA é empacotado em uma estrutura conhecida como nucleoide, o qual pode ser visualizado ao microscópio óptico em material corado (Fig. 2.5). É Feulgen-positivo, indicando a presença de DNA. O DNA de carga negativa é pelo menos em parte neutralizado por pequenas poliaminas e íons magnésio; entretanto, existem proteínas semelhantes à histona nas bacté rias que, presumivelmente, desempenham papel semelhante ao das histonas na cromatina eucariótica. As micrografias eletrônicas de uma típica célula procari ótica, como a que se vê na Figura 2.5, revelam a ausência de

Braço de -----. dineína externo Braço de --...,,_ dineína interno

Microtúbulo central

Raio da cabeça Raio radial

Microtúbulo duplo

Ligação ---+ de nexina

Bainha central Subtúbulo B A

B

FIGURA 2.4 Estrutura ciliar e flagelar. (A) Microscopia eletrônica de uma seção transversal de um cílio. Notar os dois microtúbulos centrais cir

cundados por nove microtúbulos duplos (ampliada 160.000 vezes). (Reproduzida, com autorização, de KG Murti/Visuals Unlimited.) (8) Diagrama da estrutura de um cílio e de um flagelo. (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ (editors): Prescott, Harleyand Klein's Microbiology, 7th ed., New York: McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

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SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

*

A

0,5 µm

FIGURA 2.5 Nucleoides do Bacil/us cereus (ampliada 2.500 vezes).

(Reproduzida, com autorização, de Robinow C:The chromatin bodies of bacteria. Bacteriol Rev 1956; 20:207.) Fibras de DNA membrana nuclear e aparelho mitótico. A exceção a esta re gra é constituída pelos planctomicetos, um grupo divergente de bactérias aquáticas que possuem um nucleoide circundado por um envelope nuclear que consiste em duas membranas. A distinção entre procariotos e eucariotos ainda é baseada no fato de que os procariotos não possuem um aparato mitótico como os eucariotos. A região nuclear (Fig. 2.6) é preenchida com fibrilas de DNA. O nucleoide da maioria das células bac terianas consiste em uma única molécula circular contínua, cujo tamanho vai de 0,58 a quase 10 milhões de pares de bases. Entretanto, algumas (poucas) bactérias podem ter dois, três ou mesmo quatro cromossomos. Por exemplo, o Vibrio cholerae e a Brucella melitensis têm dois cromossomos desiguais. Exis tem exceções à regra da circularidade, pois alguns procariotos (p. ex., Borrelia burgdorferi e Streptomyces coelicolor) possuem um cromossomo linear. Nas bactérias, o número de nucleoides e, consequentemen te, o de cromossomos depende das condições de crescimento (Fig. 2.5). As bactérias de crescimento rápido têm mais nu cleoides por célula do que as de crescimento lento; entretanto, quando inúmeras cópias estão presentes, são todas iguais (i. e., as células procarióticas são haploides).

Estruturas citoplasmáticas As células procarióticas carecem de plastídeos autônomos, co mo as mitocôndrias e os cloroplastos; as enzimas de transpor te de elétrons localizam-se na membrana citoplasmática. Os pigmentos fotossintéticos (carotenoides, bacterioclorofila) das bactérias que efetuam a fotossíntese estão contidos na mem brana intracitoplasmática, de morfologia variada. Vesículas de membrana (cromatóforos) ou lamelas costumam ser ob servadas em tipos de membrana. Algumas bactérias fotossin téticas têm estruturas não unitárias, em forma de membranas fechadas, chamadas clorossomos. Em algumas cianobactérias (antigamente conhecidas como algas azul-esverdeadas), as membranas fotossintéticas frequentemente formam estrutu ras em inúmeras camadas, denominadas tilacoides (Fig. 2.7). Os principais pigmentos acessórios utilizados para a captação

Membrana Célula rompida

B FIGURA 2.6 O nucleoide. (A) Micrografia eletrônica de transmissão

ampliada e colorida de uma Escherichia coli com seu DNA observado em vermelho. (© CNRl;SPL;Photo Researchers, lnc.) (8) Cromosso mo liberado de uma célula lisada de E. coli. Notar como o DNA deve estar firmemente enovelado para poder caber dentro da bactéria. (© Dr. Gopal Murti/SPL/Photo Researchers.)

da luz são as ficobilinas encontradas na superfície externa das membranas tilacoides. As bactérias frequentemente armazenam materiais em forma de grânulos insolúveis, que aparecem como corpos re fráteis no citoplasma quando vistos à microscopia de contras te de fase. Esses chamados corpos de inclusão quase sempre funcionam no armazenamento de energia ou como reserva tório dos blocos estruturais de construção. A maioria das in clusões celulares é rodeada por fina membrana composta de lipídeo, que serve para separar adequadamente a inclusão do citoplasma. Um dos corpos de inclusão mais comuns consis te no ácido poli-(J-hidroxibutírico (PHB), um composto se melhante ao lipídeo que consiste em unidades de cadeias de ácido �-hidroxibutírico conectadas através de ligações éster. O PHB é produzido quando uma fonte de nitrogênio, enxofre ou fósforo encontra-se limitada e existe um excesso de carbono no meio (Fig. 2.SA). Outro produto da armazenagem formado por procariotos quando há um excesso de carbono é o glico gênio, um polímero da glicose. O PHB e o glicogênio são usa dos como fontes de carbono quando a síntese das proteínas e

CAPÍTULO 2 Estrutura celular

A

Membrana plasmática Parede celular

/

Ficobilissomos

17

as fontes de enxofre reduzido se tornam limitantes, o enxofre em grânulos é oxidado, geralmente em sulfato, e os grânulos desaparecem lentamente. Muitas bactérias acumulam grandes reservas de fosfato inorgânico em forma de grânulos de poli fosfato (Fig. 2.8B), os quais podem ser degradados e usados como fonte de fosfato para a síntese dos fosfolipídeos e a do ácido nucleico, como suporte de crescimento. Esses grânulos são às vezes denominados grânulos de volutina ou grânulos metacromáticos, uma vez que se coram de vermelho com co rante azul. Esses grânulos são característicos das corinebacté rias (Cap. 13). Certos grupos de bactérias autotróficas que fDCam dióxido de carbono para construir seus blocos bioquímicos contêm cor pos poliédricos circundados por uma concha proteica (carbo xissomos) que contém a enzima-chave para a fixação de co2, a carboxilase de ribulosebisfosfato (Fig. 2.7B). Os magnetosso mos são partículas de cristal do ferro mineral magnetita (Fe3 O4) que permitem a certas bactérias aquáticas exibir magnetotaxia (i. e., migração ou orientação da célula com respeito ao campo magnético da Terra). Os magnetossomos são circundados por uma membrana não unida que contém fosfolipídeos, proteínas e glicoproteínas. Vesículas gasosas são encontradas quase ex clusivamente em microrganismos de habitats aquáticos, pro porcionando-lhes a flutuação. A membrana da vesícula gasosa é uma camada proteica de 2 nm de espessura, impermeável à água e solutos mas permeável a gases; dessa forma, as vesículas gasosas existem como estruturas cheias de gás, circundadas pe los componentes do citoplasma (Fig. 2.9). As bactérias contêm proteínas semelhantes à actina e a proteínas sem actina, ambas do citoesqueleto das células eu carióticas, como proteínas adicionais, que têm uma função de citoesqueleto (Fig. 2.10). Os homólogos da actina (p. ex., MreB, Mbl) realizam uma variedade de funções, ajudando a determinar a forma celular, a segregação dos cromossomos e a localizar proteínas com a célula. Os homólogos sem actina (p. ex., FtsZ) são proteínas únicas no citoesqueleto bacteria no (p. ex., SecY, MinD) e estão envolvidas na determinação da forma celular, na regulação da divisão da célula e na segregação cromossom1ca. A

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Tilacoides

O envelope celular 1µm

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Carboxissomo *

Ribossomo 708

B FIGURA 2.7 (A) Corte fino de Synechococcus lividus mostrando um extenso sistema de tilacoide. Os ficobilissomos desses tilacoides são perfeitamente visíveis como grânulos na localização t (ampliada 85.000 vezes). (Reproduzida, com autorização, de Elizabeth Gentt/ Visuais Unlimited.) (8) Seção fina de Synechocystis durante a divisão. Diversas estruturas estão visíveis. (Reproduzida, com autorização, de Carlsberg Research Communications 42:77-98, 1977, com gentil autori zação de Springer Science+Business Media.)

a síntese do ácido nucleico são reiniciadas. Uma variedade de procariotos é capaz de oxidar compostos de enxofre reduzidos, como o sulfito de hidrogênio e o tiossulfato, produzindo grâ nulos intracelulares de enxofre elementar (Fig. 2.SC). Como

As células procarióticas são circundadas por um complexo en velope composto por camadas que diferem em sua composição entre os grupos principais. Estas estruturas protegem os orga nismos de ambientes hostis, como extremos de osmolaridade, substâncias químicas e antibióticos.

A membrana celular A. Estrutura A membrana celular bacteriana, também denominada mem brana citoplasmática, é visível em micrografias eletrônicas de cortes finos (Fig. 2.15). Trata-se de uma típica "unidade de membrana", composta de fosfolipídeos e mais de 200 tipos di ferentes de proteína. As proteínas respondem por cerca de 70% da massa da membrana, proporção consideravelmente eleva da quando comparada com a das membranas das células dos mamíferos. A Figura 2.11 ilustra um modelo de organização

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

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Tilacoides L IV -

0,1µm B FIGURA 2.8 Corpos de inclusão em bactérias. (A) Micrografia eletrônica de Bacillus megaterium (ampliada 30.500 vezes) mostrando corpos de inclusão de ácido. PHB, poli-�-hidroxibutírico; PC, parede celular; N, nucleoide; MP, membrana plasmática; M, "mesossomo"; R, ribossomos. (Repro duzida, com autorização, de Ralph A. Slepecky/Visuals Unlimited.) (8) Ultraestrutura da cianobactéria Anacystis nidulans. A bactéria está se dividindo e um septo está parcialmente formado, LI e Lll. Diversas características estruturais podem ser vistas, inclusive as camadas da parede celular, Llll e LIV; gp, grânulos de polifosfato; cp, um corpo poliédrico; c, grânulos de cianoficina; mp, membrana plasmática. (Reproduzida, com autorização, do National Research Council of Canada.) (C) Cromatium vinosum, uma sulfobactéria púrpura, com grânulos intracelulares de enxofre, microscopia de campo luminoso (ampliada 2.000 vezes). (Reproduzida, com autorização, de John Holt (editor): The Shorter Bergey's Manual ofDeterminative Bacterio logy, 8th ed., 1977. Copyright © Bergey's Manual Trust. Published por Williams & Wilkins.)

da membrana. As membranas dos procariotos diferenciam-se daquelas das células eucarióticas pela ausência de esteróis, e a única exceção é representada pelos micoplasmas que incorpo ram esteróis, como o colesterol, em suas membranas quando crescem em meios que contenham esterol. A membrana celular das arqueobactérias (Cap. 1) difere das demais bactérias. Algumas membranas de arqueobactérias contêm lipídeos únicos, os isoprenoides, em vez de ácidos gra xos, unidos ao glicerol por uma ligação éter em vez de éster. Alguns destes lipídeos não possuem grupamentos fosfato e, as sim, não são fosfolipídeos. Em outras espécies, a membrana ce lular é feita por monocamada lipídica, que consiste em lipídeos longos (com cerca de duas vezes a extensão de um fosfolipídeo) com glicerol-éteres em ambas as extremidades (tetraéteres de

diglicerol). As moléculas se orientam com os grupos glicerol polares nas superfícies e a cadeia de hidrocarbonetos apola res no interior. Esses lipídeos não usuais contribuem para a faculdade de muitas arqueobactérias de crescer em condições ambientes como altas concentrações de sal, baixo pH ou tem peraturas muito elevadas.

B. Função As principais funções da membrana citoplasmática são ( 1) a permeabilidade seletiva e o transporte de solutos; (2) transpor te de elétrons e fosforilação oxidativa em espécies aeróbias; (3) excreção das exoenzimas hidrolíticas; (4) localização das en zimas e moléculas transportadoras que atuam na biossíntese

CAPÍTULO 2

Estrutura celular

19

FIGURA 2.9 Corte transversal de uma célula em divisão de cianobactéria da espécie Microcystis, mostrando a distribuição hexagonal das vesí culas gasosas cilíndricas (ampliada 31.500 vezes). (Micrografia obtida por HS Pankratz. Reproduzida, com autorização, de Walsby AE: Gas vesicles. Microbial Rev 1994;58:94.)

do DNA, dos polímeros da parede celular e dos lipídeos da membrana; e (5) localização dos receptores e outras proteínas do sistema quimiotático dos outros sistemas de transdução sensorial. Pelo menos 50% da membrana citoplasmática deve en contrar-se no estado semilíquido para que ocorra o cresci mento celular. A temperaturas baixas, tal estado é obtido mediante o aumento acentuado na síntese e na incorporação dos ácidos graxos insaturados em fosfolipídeos da membrana celular. a membrana citoplasmá 1 . Permeabilidade e transporte tica forma uma barreira hidrofóbica impermeável à maioria das moléculas hidrofílicas. Entretanto, existem vários mecanismos (sistemas de transporte) que capacitam a célula a transportar os nutrientes para o seu interior e produtos de degradação para fora. Esses sistemas de transporte atuam contra um gradiente de concentração para aumentar a concentração dos nutrientes no interior da célula, função que requer alguma forma de ener gia. Há três mecanismos gerais de transporte envolvidos no transporte da membrana: o transporte passivo, o transporte ativo e a translocação de grupos. -

A

B

FIGURA 2.10 Citoesqueleto procariótico. Visualização da proteína de citoesqueleto MreB-/ike (Mbl) de Bacillus subtilis. A proteína Mbl foi fusionada com proteína verde fluorescente (PVF) e as células vivas fo ram examinadas por microscopia de fluorescência. (A) Setas indicando os cabos helicoidais do citoesqueleto que se estendem ao longo das células. (8) Três das células de (A) são mostradas com maior aumento. (Cortesia de Rut Carballido-Lopez e Jeff Errington.)

20

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

Proteína integral -----li

Hélice a.-hidrofóbica

Glicolipídeo

Hopanoide

�� Proteína periférica

tJDJ'

Fosfolipídeo

FIGURA 2.11 Estrutura celular da membrana plasmática. Este diagrama do modelo de mosaico fluido da estrutura da membrana bacteriana mostra as proteínas integrais (verde e vermelha) inseridas na bicamada lipídica. Proteínas periféricas (amarela) estão frouxamente associadas à membrana de superfície interna. As pequenas esferas representam as extremidades hidrofílicas da membrana fosfolipídica, e as caudas duplas, as cadeias de ácidos graxos hidrofóbicos. Outros lipídeos de membrana, tais como os hopanoides (púrpura), podem estar presentes. Por razões de clareza, os fosfolipídeos são mostrados proporcionalmente em tamanho muito maior do que o tamanho real nas membranas. (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ (editors): Prescott, Harley, and Klein's Microbiology, 7th ed, N: McGraw-Hill; 2008.© McGraw Hill Companies, lnc.)

a. Transporte passivo - este mecanismo depende de difusão,

não emprega energia e opera somente quando o soluto se en contra em alta concentração no lado exterior da célula. A difu são simples responde pela entrada de poucos nutrientes, como o oxigênio dissolvido, dióxido de carbono e a própria água. A difusão simples não proporciona velocidade nem seletivida de. A difusão facilitada também não requer energia, de modo que o soluto nunca alcança uma concentração interna maior que a do lado externo da célula. Entretanto, a difusão facilita da é seletiva. As proteínas de canal formam canais seletivos que facilitam a passagem de moléculas específicas. A difusão facilitada é comum nos microrganismos eucarióticos (p. ex., leveduras), mas rara nos procariotos. O glicerol é um dos poucos compostos que entram nas células procarióticas por difusão facilitada.

b. Transporte ativo - muitos nutrientes encontram-se em

uma concentração superior a 1.000 vezes como resultado do transporte ativo. Dependendo da fonte de energia empregada, existem dois tipos de mecanismo de transporte ativo: o trans porte acoplado a íons e o sistema de cassete de ligação ao ATP (transportador tipo ABC).

1) Transporte acoplado a íons - estes sistemas movimentam uma molécula através da membrana celular a expensas de um gradiente de íons previamente estabelecido, como a força mo triz de próton ou força motriz de sódio. Existem três tipos bá sicos: uniporte, simporte e antiporte (Fig. 2.12). O transporte acoplado a íons é particularmente comum nos organismos ae róbios, que possuem um tempo de geração e uma forma motriz de íons mais fáceis do que nos anaeróbios. Os uniportadores catalisam o transporte de um substrato independente de qual quer íon acoplado. Os simportadores catalisam o transporte

simultâneo de dois substratos na mesma direção por um único transportador; por exemplo, um gradiente de H+ pode permi tir o simporte de um íon de carga oposta (p. ex., glicina) ou de uma molécula neutra (p. ex., galactose). Os antiportadores catalisam o transporte simultâneo de dois compostos de carga semelhante em direções opostas por um transportador comum (p. ex., H+:Na+). Aproximadamente 40% dos substratos trans portados por E. coli utilizam este mecanismo.

2) Transporte tipo ABC - este mecanismo emprega ATP di retamente para transportar os solutos para a célula. Nas bac térias gram-negativas, o transporte de muitos nutrientes é facilitado por proteínas de ligação específicas localizadas no espaço periplasmático; nas células gram-positivas, as proteínas de ligação estão presas junto à superfície externa da membra na celular. Tais proteínas funcionam transferindo o substrato ligado a um complexo de proteína ligada à membrana. Em se guida, a hidrólise do ATP é desencadeada, e a energia é usada para abrir os poros da membrana e permitir um movimento unidirecional do substrato para a célula. Aproximadamen te 40% dos substratos transportados por E. coli utilizam este mecanismo. *

e.

Translocação de grupos - além do transporte verdadeiro,

em que um soluto é movido através da membrana sem alte ração da estrutura, as bactérias utilizam um processo deno minado translocação de grupos (metabolismo vetorial) para efetuar a captação de determinados açúcares (p. ex., glicose e manose) com a fosforilação do substrato durante o processo de transporte. Em sentido estrito, a translocação de grupos não é um transporte ativo, pois não há gradiente de concen tração envolvido. Esse processo possibilita que as bactérias uti lizem de maneira eficiente suas fontes de energia ao acoplar o

CAPÍTULO 2

Uniportador

b b

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-

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b

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b

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b b

I nterior

A Simportador

B

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Antiportador

b

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b b

b b

e FIGURA 2.12 Três tipos de transportadores: (A) Uniportadores; (8) Simportadores; e (C) Antiportadores. Os uniportadores catalisam o transporte de uma única molécula independentemente de qualquer outra; os simportadores catalisam o transporte concomitante de duas moléculas distintas (em geral, um soluto e um íon de carga positiva, H+) na mesma direção, enquanto os antiportadores catalisam o transporte pela troca de dois solutos similares em direções opostas. Uma única proteína de transporte pode catalisar apenas um, dois ou mesmo to dos os três processos, dependendo das condições. Foi observado que uniportadores, simportadores e antiportadores são estruturalmen te semelhantes e relacionados do ponto de vista evolutivo, e atuam por mecanismos semelhantes. (Reproduzida, com autorização, de Saier MH Jr: Peter Mitchell and his chemiosmotic theories. ASM News 1997; 63:13.)

transporte com o metabolismo. Nesse processo, uma proteína transportadora da membrana é inicialmente fosforilada no ci toplasma à custa do fosfoenolpiruvato; em seguida, a proteína fosforilada liga-se ao açúcar livre na face externa da membra na e o transporta para o citoplasma, liberando-o em forma de açúcar-fosfato. Os referidos sistemas de transporte de açúcar são denominados sistemas de fosfotransferase. Esses sistemas também estão envolvidos no movimento direcionado para es sas fontes de carbono (quimiotaxia) e na regulação de várias outras vias metabólicas (repressão dos catabólitos).

21

o ferro (Fe) é um nu triente essencial para o crescimento de quase todas as bactérias. Em condições anaeróbias, geralmente encontra-se em estado de oxidação +2 e solúvel. Entretanto, em condições aeróbias, mostra-se geralmente em estado de oxidação +3 e insolúvel. Os compartimentos internos dos animais praticamente não con têm ferro livre, sequestrado em complexos proteicos, como a transferrina e a lactoferrina. Algumas bactérias solucionam este problema secretando sideróforos - compostos quelan tes do Fe e que promovem seu transporte como um complexo solúvel. Um grupo principal de sideróforos consiste em deriva dos do ácido hidroxâmico (-CONH20H), o qual quela o Fe3+ fortemente. O complexo ferro-hidroxamato é transportado ativamente para a célula por ação cooperativa de um grupo de proteínas que se estende pela membrana externa, o periplas ma e a membrana interna. O ferro é liberado, e o hidroxamato pode sair da célula e ser usado novamente no transporte de ferro. Algumas bactérias patogênicas usam um mecanismo fun damentalmente diferente, que envolve receptores específicos que se ligam à transferrina e à lactoferrina do hospedeiro (bem como a outras proteínas do hospedeiro que contenham ferro). O ferro é removido e transportado para a célula por um proces so dependente de energia.

d. Processos especiais de transporte

-

Estrutura celular -

2. Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa os citocromos, assim como outras enzimas e componentes da ca deia respiratória, inclusive certas desidrogenases, localizam-se na membrana celular. Por conseguinte, a membrana celular bacteriana constitui um análogo funcional da membrana mi tocondrial - relação que tem sido utilizada por muitos biólo gos para confirmar a teoria de que as mitocôndrias evoluíram a partir de bactérias simbióticas. No Capítulo 6, discutimos o mecanismo pelo qual a geração de ATP está acoplada ao trans porte de elétrons. -

3. Excreção das exoenzimas hidrolíticas e proteínas de patogenicidade todos os microrganismos que dependem -

dos polímeros orgânicos macromoleculares como fonte de nu trientes (p. ex., proteínas, polissacarídeos, lipídeos) excretam enzimas hidrolíticas que degradam os polímeros em subuni dades pequenas o suficiente para penetrarem na membrana celular. Os animais superiores secretam essas enzimas no lú men do trato digestório, enquanto as bactérias (gram-positivas e gram-negativas) o fazem diretamente no meio externo ou no espaço periplasmático, entre a camada de peptidoglicano e a membrana externa da parede celular, no caso das bactérias gram-negativas (ver A parede celular). Nas bactérias gram-positivas, as proteínas são secretadas diretamente, porém as proteínas secretadas por bactérias gram negativas precisam atravessar a membrana externa. Foram des critas seis vias de secreção de proteínas em bactérias: sistemas de secreção tipos I, li, Ili, IV, V e VI. Uma visão geral esquemática dos sistemas tipos 1 a V é apresentada na Figura 2.13. Os siste mas de secreção tipos 1 e IV foram descritos em bactérias gram negativas e gram-positivas, enquanto os sistemas de secreção tipos li, Ili, V e VI foram encontrados somente em bactérias gram-negativas. As proteínas secretadas através das vias tipos 1 e III atravessam a membrana interna (MI) e a membrana exter na (ME) em uma etapa, enquanto as proteínas secretadas pelas

22

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

vias tipos II e V atravessam a MI e a ME em etapas distintas. As proteínas secretadas pelas vias tipos II e V são sintetizadas nos ribossomos citoplasmáticos, em forma de pré-proteínas que contêm uma sequência-líder ou sinalizadora adicional de 15 a 40 aminoácidos - mais comumente, cerca de 30 aminoácidos - na extremidade aminoterminal e que exigem a presença do sistema sec para o seu transporte através da MI (citoplasmáti ca). Em E. coli, a via sec compreende diversas proteínas da MI (SecD a SecF, SecY), uma ATPase associada à membrana celu lar (SecA) que fornece energia para exportação, uma proteína chaperona (SecB) que se liga à pré-proteína, e a peptidase sinal periplasmática. Após translocação, a sequência-líder é clivada pela peptidase sinal ligada à membrana, e a proteína madura é liberada no espaço periplasmático. Diferentemente, as proteínas secretadas pelos sistemas tipos 1 e III não possuem sequência líder e são exportadas intactas.

Tipo 1

Tipo Ili

Em bactérias gram-negativas e gram-positivas, outro siste ma de translocação pela membrana plasmática, chamado via tat, pode mover proteínas através da membrana plasmática. Em bactérias gram-negativas, estas proteínas são então libera das para o sistema tipo II (Fig. 2.13). A via tat difere do sistema sec, pois faz a translocação das proteínas em sua conformação final (dobra). Embora as proteínas secretadas pelos sistemas tipos II e V sejam similares no mecanismo utilizado para atravessar a MI, existem diferenças na maneira como atravessam a ME. As pro teínas secretadas pelo sistema tipo II são transportadas pela ME por um complexo multiproteico (Fig. 2.13). Trata-se da prin cipal via para a secreção das enzimas de degradação extracelu lares por bactérias gram-negativas. A elastase, a fosfolipase C e a exotoxina A, são secretadas por este sistema na Pseudomonas aeruginosa. Entretanto, as proteínas secretadas pelo sistema

Tipo li

Tipo IV

Tipo V

Exterior da célula TolC

Membrana externa

Yop

YscJ

Espaço periplasmático

_ Mem brana....__ _ _ --1 plasmática ..,>JI ... J>Jl'-

ADP + Pi ATP

ATP

Chaperona

ADP + Pi

ATP

ADP + Pi

Citoplasma

ATP

ADP + Pi ATP

ATP

ADP + Pi

Chaperona

Proteína FIGURA 2.13 Sistemas de secreção de proteína em bactérias gram-negativas. Cinco sistemas de secreção de bactérias gram-negativas são mos trados. O sistema dependente da sece a via Tattransportam proteínas do citoplasma para o espaço periplasmático. Os sistemas tipos li, Ve, às vezes, do tipo IV completam o processo de secreção inciado pela via dependente da sec. O sistema Tat parece transportar proteínas somente para a via tipo li. Os sistemas tipos e Ili desviam das vias dependente da sece Tat, movendo as proteínas diretamente do citoplasma, através da membrana externa para o espaço extracelular. O sistema de secreção tipo IV pode atuar tanto com a via dependente da secquanto sozinho para transportar proteínas para o espaço extracelular. As proteínas translocadas pela via dependente da sec e pelo tipo Ili são transportadas para esses sistemas por proteínas chaperonas. ADP, adenosina difosfato; ATP, adenosina trifosfato; EFGY, PulS, SecD, TolC, Yop (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ (editors): Prescott, Harley, and Klein's Microbiology, 7th ed., New York: McGraw-Hill; 2008. © McGraw-Hill Companies, lnc.)

1

CAPÍTULO 2 Estrutura celular tipo V autotransportam-se, através da membrana externa, por uma sequência carboxiterminal removida enzimaticamen te sob a liberação da proteína para a ME. Algumas proteínas extracelulares - por exemplo, a IgA protease da Neisseria go norrhoeae e a citotoxina de vacuolização do Helicobacter pylori - são secretadas por este sistema. As vias de secreção tipos I e III são independentes do sec e, por isso, não envolvem o processamento aminoterminal das proteínas secretadas. A secreção das proteínas por essas vias ocorre em um processo contínuo, sem a presença de qualquer intermediário citoplasmático. A secreção tipo I é exemplificada pela a-hemolisina da E. coli e pela adenililciclase da Bordetella pertussis. A secreção tipo I requer três proteínas secretoras: um cassete de ligação ao ATP (transportador tipo ABC), que for nece energia para a secreção proteica; uma proteína da ME; e uma proteína de fusão da membrana, ancorada na membra na interna e que atravessa o espaço periplasmático (Fig. 2.13). Em lugar do peptídeo de sinalização, a informação localiza-se dentro dos 60 aminoácidos carboxiterminais da proteína se cretada. A via de secreção tipo III é um sistema dependente de con tato. Este sistema é ativado pelo contato com a célula hospe deira, e então injeta uma toxina proteica diretamente na célula hospedeira. O aparelho de secreção tipo III é constituído por aproximadamente 20 proteínas, a maioria das quais localiza se na MI. Esses componentes da MI são, em sua maioria, ho mólogos ao aparelho de biossíntese flagelar das bactérias tanto gram-positivas quanto gram-negativas. À semelhança da se creção tipo I, as proteínas secretadas pela via de secreção tipo III não estão sujeitas a processamento aminoterminal durante sua secreção. As vias de secreção tipo IV secretam tanto toxinas poli peptídicas (direcionadas contra as células eucarióticas) quanto complexos proteína-DNA entre duas células bacterianas ou entre uma bactéria e uma célula eucariótica. O tipo IV de se creção é exemplificado pelo complexo proteína-DNA liberado por Agrobacterium tumefaciens em células de plantas. Além desse microrganismo, a B. pertussis e H. pylori possuem sis temas de secreção tipo IV que medeiam a secreção da toxina pertussis e do fator de indução da interleucina-8, respectiva mente. O sistema de secreção tipo VI independente de sec foi recentemente descrito em P. aeruginosa, em que contribui para a patogenicidade em pacientes com fibrose cística. Este sistema de secreção é composto por 15 a 20 proteínas cujas funções bioquímicas ainda não estão bem compreendidas. Entretanto, estudos recentes sugerem que algumas dessas proteínas parti lham homologia com as proteínas da cauda de bacteriófagos. As características dos sistemas de secreção de proteínas de bactérias estão sintetizadas no Quadro 9.6. 4. Funções de biossíntese

a membrana celular constitui o local dos peptídeos transportadores sobre o qual se organizam as subunidades da parede celular (ver discussão sobre a síntese das substâncias da parede celular no Cap. 6), bem como das enzimas de biossíntese da parede celular. As enzimas para a síntese dos fosfolipídeos também se localizam na membrana celular.

23

bacteriana (ver Flagelos). Existem pelo menos 20 quimiorrecep tores diferentes na membrana da E. coli, alguns dos quais tam bém atuam como primeira etapa no processo de transporte.

A parede celular A pressão osmótica interna da maioria das bactérias varia de 5 a 20 atm devido à concentração de solutos obtida através do transporte ativo. Na maioria dos ambientes, esta pressão se ria suficiente para provocar a ruptura da célula, se não fosse a presença de uma parede celular com elevada força de tensão (Fig. 2.14). A parede celular bacteriana deve sua força a uma camada constituída por uma substância conhecida como mu reína, mucopeptídeo ou peptidoglicano (termos sinônimos). A estrutura do peptidoglicano é discutida adiante. A maioria das bactérias é classificada como gram-positiva ou gram-negativa, de acordo com sua resposta à coloração pelo método de Gram. Este procedimento recebeu tal deno minação do histologista Hans Christian Gram, que desenvol veu essa técnica de coloração diferencial na tentativa de corar bactérias em tecidos infectados. A coloração de Gram depende da capacidade de certas bactérias (as bactérias gram-positivas) de reter o complexo cristal de violeta (um corante púrpura) e iodo após breve lavagem com álcool ou acetona. As bactérias gram-negativas não retêm o complexo corante-iodo e tornam se translúcidas, podendo, assim, tomar a coloração de fundo com safranina* (um corante vermelho). Assim, as bactérias . gram-pos1t1vas aparecem na cor purpura ao m1croscop10, e as gram-negativas, em vermelho. A distinção entre esses dois grupos reflete diferenças fundamentais em seus envelopes ce lulares (Fig. 2.15). .

.

,

,

.

* N. de R.T. Pode-se empregar a fucsina como corante de fundo no lugar da safranina.

-

5. Sistemas quimiotáticos as substâncias atrativas e repe lentes ligam-se a receptores específicos existentes na membrana -

FIGURA 2.14 Parede celular de bactéria gram-positiva. Peptidogli cano de Bacil/us megaterium, uma bactéria gram-positiva. As esferas de látex têm um diâmetro de 0,25 µm. (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ [editors]: Prescott, Harley, and Klein's Microbiology, 7th ed. New York: McGraw-Hill; 2008. © McGraw Hill Companies, lnc.)

24

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

Parede celular gram-negativa

MP Parede celular gram-positiva

------ Peptidoglicano 1--- Membrana plasmática

Parede celular r1-, � ..._11-1-1__, - Membrana externa *t-t-t--- Peptidoglicano +---- Membrana plasmática

-

OParede celular

-

LT Espaço periplasmático

FIGURA 2.15 Paredes bacterianas gram-positivas e gram-negativas. Envelope gram-positivo de Bacillus licheniiformis (esquerda) e micrografia eletrônica de Aquaspirillum serpens (direita). M, peptidoglicano ou mureína; ME, membrana externa; MP, membrana plasmática; EP, espaço periplás mático; P, parede (peptidoglicano) de bactéria gram-positiva (Reproduzida, com autorização, de T.J. Beveridge/Biological Photo Service.)

Além de proporcionar uma proteção osmótica, a parede celular desempenha papel essencial na divisão celular e atua como modelo para a sua própria biossíntese. Várias camadas da parede constituem os locais de importantes determinantes antigênicos da superfície celular, em que um componente o lipopolissacarídeo das paredes celulares gram-negativas - é responsável pela atividade de endotoxina inespecífica das bac térias gram-negativas. Em geral, a parede celular não é seleti vamente permeável; entretanto, uma camada da parede celular gram-negativa - a membrana externa - impede a passagem das moléculas relativamente grandes (ver adiante). A biossíntese da parece celular e os antibióticos que interfe rem nesse processo são discutidos no Capítulo 6. A. Camada de peptidoglicano

O peptidoglicano é um polímero complexo constituído, para fins de descrição, de três partes: um arcabouço, composto de N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico alternados; um conjunto de cadeias laterais idênticas de tetrapeptídeos ligadas ao ácido N-acetilmurâmico; e um conjunto de ligações cruza das peptídias idênticas (Fig. 2.16). O arcabouço é o mesmo em todas as espécies bacterianas; as cadeias laterais de tetrapeptí deos e as pontes cruzadas de peptídeos variam de uma espé cie para outra, e as de Staphylococcus aureus são ilustradas na Figura 2.16. Em muitas paredes celulares de bactérias gram negativas, a ponte cruzada consiste em uma ligação peptídica direta entre o grupo amino de uma cadeia lateral do ácido dia minopimélico (DAP) e o grupo carboxila da D-alanina termi nal de uma segunda cadeia lateral. Todavia, as cadeias laterais de tetrapeptídeos de todas as espécies têm certas características importantes em comum. A maioria possui L-alanina na posição 1 (ligada ao ácido N-ace tilmurâmico), D-glutamato ou D-glutamato substituído na po sição 2, e D-alanina na posição 4. A posição 3 é a mais variável:

a maioria das bactérias gram-negativas tem o ácido diaminopimé lico nessa posição, ao qual está ligado o componente lipoproteico da parede celular discutido adiante. As bactérias gram-positivas geralmente possuem L-lisina na posição 3; entretanto, algumas podem ter o ácido diaminopimélico ou outro aminoácido nesta posição. O ácido diaminopimélico é um elemento exclusivo das paredes celulares bacterianas, e não é encontrado na parede celular das arqueobactérias ou dos eucariotos. É o precursor imediato da lisina na biossíntese bacteriana desse aminoácido (Fig. 6.19). Os mutantes bacterianos cuja via de biossíntese é bloqueada antes do ácido diaminopimélico crescem normal mente quando o meio contém esse ácido. Entretanto, quando recebem apenas L-lisina, sofrem lise, visto que continuam a crescer, porém são incapazes de formar especificamente o pep tidoglicano da nova parede celular. O fato de todas as cadeias de peptidoglicano exibirem li gações cruzadas significa que cada camada de peptidoglicano é uma única molécula gigante. Nas bactérias gram-positivas, existem até 40 camadas de peptidoglicano, constituindo até 50% do material da parede celular; nas bactérias gram-negati vas, parece haver apenas uma ou duas camadas, constituindo 5 a 10% do material da parede. As bactérias devem suas formas, que são características de cada espécie, à estrutura de sua pa rede celular.

B. Componentes especiais das paredes celulares das bactérias gram-positivas As paredes celulares da maioria das bactérias gram-positivas contêm consideráveis quantidades dos ácidos teicoico e tei curônico, que podem representar até 50% do peso seco da parede e 10% do peso seco da célula total. Além disso, algu mas paredes gram-positivas podem conter moléculas de po lissacarídeos.

CAPÍTULO 2

A

Estrutura celular

25

Ligação 13-1,4 clivada pela lisozima (N-acetil glicosamina) 6CH20H 5 H

J-

(Peptídeo do ácido N-acetilmurâmico) CH20H

-o

J----o

-

H

H

o

1 CH - CO 1 o CH3

OH 3 H

H 2

H

NH- COCH3

H

H

N H - COCH3

(a-NH) 1 L-Alanina 1 D-lsoglutamina 1 L-Lisina 1 D-Alanina (a-COOH)

(N-acetil glicosamina) CH20H -- 0 J-H

(Peptídeo do ácido N-acetilmurâmico) CH20H

J----o

H

o

H

H

H

N H - COCH3

o"

1 CH-CO 1

O

H

H

N H - COCH3

CH3

OH

H

(a-NH) 1 L-Alanina 1 D-lsoglutamina 1 L-Lisina 1 D-Alanina (a-COOH)

1 [Gli]5

B

H

1 [Gli]5

----< GlcNAc >-----{ MurNAc >------+--< GlcNAc >------< MurNAc >------+--< GlcNAc >---L-Ala 1

D-1-Glu-N 1

L-lis 1

D-Ala

1 D-1-Glu-N 1 L-Lis 1 L-Ala

1

D-Ala

[Gli]5

L-Ala D-1-Glu-N 1

L-Lis D-Ala

[Gli]5

1 D-1-Glu-N 1 L-Lis 1 L-Ala

1

1

1

1

[Gli]5 1

D-Ala

1

[Gli]5 1

FIGURA 2.16 (A) Segmento do peptidoglicano de Staphylococcus aureus. O arcabouço do polímero consiste em subunidades alternadas de N-acetilglicosamina e ácido N-acetilmurâmico unidas por ligações P1�4. Os resíduos do ácido murâmico estão ligados a peptídeos curtos cuja composição varia de uma espécie bacteriana para outra. Em algumas espécies, os resíduos de L-lisina são substituídos por ácido diaminopimélico, um aminoácido encontrado na natureza apenas nas paredes celulares procarióticas. Observe os D-aminoácidos, também componentes caracterís ticos das paredes celulares dos procariotos. As cadeias peptídicas do peptidoglicano apresentam ligações cruzadas entre arcabouços paralelos de polissacarídeos, como mostra a Figura 2.168. (8) Representação esquemática da rede de peptidoglicano formada por ligação cruzada. As pontes compostas de cadeias peptídicas de pentaglicina ligam a a-carboxila do resíduo terminal de D-alanina de uma cadeia ao grupo e-amino do resíduo de L-lisina da cadeia seguinte. A natureza da ligação cruzada varia entre diferentes espécies.

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

26

1 . Acidos teicoico e teicurônico

a expressão ácidos teicoi cos abrange toda a parede, membrana ou polímeros capsulares que contêm resíduos de glicerolfosfato ou ribitol fosfato. Estes polialcoóis são conectados por ligações fosfodiéster e geralmen te possuem outros açúcares e D-alanina ligados (Fig. 2.17A). Por serem relativamente carregados, os ácidos teicoicos são responsáveis, em parte, pela carga negativa da superfície celu lar como um todo. Existem dois tipos de ácido teicoico: o ácido teicoico da parede (wall teichoic acid WTA), que apresen ta ligação covalente com o peptidoglicano; e o ácido teicoico da membrana (ácido lipoteicoico), ligado de modo covalente ao glicolipídeo da membrana. Em virtude de os dois tipos de ácido teicoico da membrana estarem intimamente associados aos lipídeos, são chamados de ácidos lipoteicoicos (lipotei choic acids LTA). Junto com o peptidoglicano, o WTA e o LTA fazem uma rede ou matriz polianiônica que proporciona funções relacionadas com a elasticidade, a porosidade, a força tensional e propriedades eletrostáticas do envelope. Embora nem todas as bactérias possuam WTA e LTA convencionais, as que não têm estes polímeros geralmente têm similares para tais funções. Os ácidos teicoicos contêm, em sua maioria, grandes quan tidades de D-alanina, geralmente ligada à posição 2 ou 3 do gli cerol, ou à posição 3 ou 4 do ribitol. Todavia, em alguns dos ácidos teicoicos mais complexos, a D-alanina liga-se a um dos resíduos de açúcar. Além da D-alanina, outras moléculas podem estar ligadas aos grupos hidroxila livres do glicerol e do ribitol, como, por exemplo, glicose, galactose, N-acetilglicosamina, -

-

-

1 o 1 O= P - o1 o 1 CH2 1 H- C-0-R 1

N-acetilgalactosamina ou succinato. Uma espécie pode exibir mais de um tipo de molécula de açúcar além da D-alanina; nesse caso, não se sabe ao certo se os diferentes açúcares ocorrem nas mesmas moléculas ou em moléculas distintas do ácido teicoi co. A composição do ácido teicoico, formado por determinada espécie bacteriana, pode variar de acordo com a composição do meio de crescimento. Os ácidos teicoicos constituem os principais antígenos de superfície das espécies de bactérias gram-positivas que os possuem, e sua acessibilidade aos anticorpos foi tomada como evidência de que eles ocupam a superfície externa do peptido glicano. Entretanto, sua atividade frequentemente mostra-se aumentada pela digestão parcial do peptidoglicano; sendo as sim, muito do ácido teicoico pode ficar situado entre a membra na citoplasmática e a camada de peptidoglicano, estendendo-se possivelmente através dos poros da última (Fig. 2.17B). Nos pneumococos (Streptococcus pneumoniae), os ácidos teicoicos suportam determinantes antigênicos chamados antígenos de Forssman. No Streptococcus pyogenes, o LTA está associado à proteína M que se projeta da membrana celular através da ca mada do peptidoglicano. As longas moléculas da proteína M juntas com o LTA formam microfibrilas que facilitam a ligação do S. pyogenes às células animais. Os ácidos teicurônicos são polímeros semelhantes, porém as unidades repetidas incluem os ácidos dos açúcares (p. ex., ácidos N-acetilmanosurônico ou D-glicosurônico) em lugar dos ácidos fosfóricos; são sintetizados em lugar dos ácidos tei coicos quando o fosfato constitui um fator limitante.

Ácido teicoico

Ácido lipoteicoico

-

1

o

ã.

�

1

O= P - o1

o 1

CH2 1

H-C-0-R

Espaço periplasmático

1

CH2 1

o 1

O= P - o1

o

A

1

B

FIGURA 2.17 (A) Estrutura do ácido teicoico. O segmento de um ácido teicoico feito de glicerol, fosfato e uma cadeia lateral, R. R pode represen tar o-alanina, glicose ou outras moléculas. (8) Acido teicoico e lipoteicoico da parede celular gram-positiva. (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ (editors): Prescott, Harley, and Klein's Microbiology, 7th ed., New York: McGraw-Hill; 2008.)

CAPÍTULO 2

a hidrólise das paredes das células gram 2. Polissacarídeos positivas produz, em determinadas espécies, açúcares neutros, como a manose, arabinose, ramnose e glicosamina, bem como açúcares ácidos, como os ácidos glicurônico e manurônico. Sugeriu-se que esses açúcares existem como subunidades dos polissacarídeos na parede celular; entretanto, a descoberta de que os ácidos teicoico e teicurônico podem conter uma varie dade de açúcares (Fig. 2.17A) faz que a verdadeira origem des ses açúcares permaneça incerta. -

C. Componentes especiais das paredes celulares dos microrganismos gram-negativos As paredes celulares dos gram-negativos contêm três compo nentes localizados fora da camada de peptidoglicano: lipopro teína, membrana externa e lipopolissacarídeos (Fig. 2.18).

1 . Membrana externa

a membrana externa é quimica mente distinta de todas as outras membranas biológicas. Forma uma estrutura em dupla camada; seu folheto interno asseme lha-se, em sua composição, ao da membrana celular, enquanto -

Estrutura celular

27

os fosfolipídeos do folheto externo contêm um componente distintivo, um lipopolissacarídeo (LPS). Em consequência, os folhetos dessa membrana são assimétricos, e as propriedades dessa dupla camada diferem de modo considerável daquelas de uma membrana biológica simétrica, como a membrana celular. A capacidade da membrana externa de excluir molécu las hidrofóbicas constitui uma característica peculiar entre as membranas biológicas e serve para proteger a célula (no ca so das bactérias entéricas) das substâncias deletérias, como os sais biliares. Em virtude de sua natureza lipídica, seria de se esperar que a membrana externa também excluísse as molécu las hidrofílicas. Entretanto, a membrana externa possui canais especiais, constituídos por moléculas proteicas denominadas porinas, que permitem a difusão passiva dos compostos hi drofílicos de baixo peso molecular, tais como açúcares, ami noácidos e certos íons. As grandes moléculas de antibióticos penetram de modo relativamente lento através da membrana externa, contribuindo para a resistência relativamente alta das bactérias gram-negativas aos antibióticos. A permeabilidade da membrana externa varia bastante de uma espécie bacteriana

_L � ......,.. _ . ___ Antígeno O repetido

--:;:

..

Lipopolissacarídeo

GlcNAc

..

Glicose ..

Galactose

..

Porina

Heptose

..

KOO *

Cerne externo

Cerne interno

Lipídeo A

Membrana externa

y- Peptidoglicano

Lipoproteína Periplasma

_.

MOO

*

Fosfolipídeos

Membrana interna

Citoplasma

*

Proteínas

FIGURA 2.18 Representação molecular da parede de uma bactéria gram-negativa. As formas ovais e os retângulares representam resíduos de açúcar e as circulares indicam os grupos polares dos glicerofosfolipídeos (fosfatidiletanolamina e fosfatidilglicerol). (MOO, oligossacarídeos deriva dos da membrana.) A região do cerne mostrada é a da Escherichia coli K-12, cepa que normalmente não contém um antígeno O repetido, a não ser que seja transformada com um plasmídeo apropriado. (Reproduzida, com autorização, de Raetz CRH: Bacterial endotoxins: Extraordinary lipids that activate eucaryotic signal transduction. J Bacteriol 1993;175:5745.)

SEÇÃO 1

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Fundamentos da Microbiologia

gram-negativa para outra. Assim, por exemplo, em P. aerugi nosa, extremamente resistente aos antibacterianos, a membra na externa é 100 vezes menos permeável do que a da E. coli. As principais proteínas da membrana externa, denomina das de acordo com os genes que as codificam, foram classifica das em diversas categorias funcionais, com base nos mutantes em que estão ausentes, bem como em experimentos nos quais as proteínas purificadas foram reconstituídas em membranas artificiais. As porinas, exemplificadas por OmpC, D e F, assim como PhoE da E. coli e da Salmonella typhimurium*, são proteí nas triméricas que penetram em ambas as faces da membrana externa (Fig. 2.19). Formam poros relativamente inespecíficos que permitem a difusão livre de pequenos solutos hidrofílicos através da membrana. As porinas de espécies diferentes pos suem diferentes limites de exclusão que variam desde pesos moleculares de cerca de 600 na E. coli e na S. typhimurium até mais de 3.000 na P. aeruginosa. Os membros de um segundo grupo de proteínas da mem brana externa, que se assemelham em muitos aspectos às po rinas, são exemplificados por LamB e Tsx. LamB, uma porina induzível que também é o receptor do bacteriófago lambda, responde pela maior parte da difusão transmembrana da mal tose e da maltodextrina; Tsx, o receptor do bacteriófago T6, * N. de RT. A nomenclatura mais atual seria: Salmonella enterica subes pécie enterica sorovar Typhimurium ou Salmonella Typhimurium. O gê nero Salmonella, que apresenta uma taxonomia extremamente complexa, é formada por 3 espécies (S. enterica, S. bongori e S. subterranea). Já a espécie S. enterica apresenta seis subespécies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtanae e indica), além de mais de 2.460 sorovares, que são escritos com letra maiúscula e não em itálico.

A

é responsável pela difusão transmembrana dos nucleosídeos e de alguns aminoácidos. A proteína LamB permite a passagem de outros solutos; entretanto, sua relativa especificidade pode refletir interações fracas de solutos com locais de configuração específica no interior do canal. A OmpA é uma proteína abundante na membrana exter na. Participa na ancoragem da membrana externa à camada de peptidoglicano como receptor de vários bacteriófagos, e atua como receptor do pilus sexual na conjugação bacteriana me diada pelo fator F (Cap. 7). A membrana externa também contém um conjunto de proteínas menos abundantes, envolvidas no transporte de mo léculas específicas, como a vitamina B12 e complexos de ferro sideróforos. Essas proteínas exibem alta afmidade pelos seus substratos, e é provável que atuem como os sistemas clássicos de transporte da membrana interna (citoplasmática). A função adequada dessas proteínas requer energia acoplada através de uma proteína denominada TonB. Outras proteínas de menos importância incluem um número limitado de enzimas, entre elas fosfolipases e proteases. A topologia das principais proteínas da membrana exter na, com base em estudos de ligação cruzada e na análise de relações funcionais, é apresentada na Figura 2.18. A membra na externa está conectada tanto à camada do peptidoglicano quanto à membrana citoplasmática. A conexão com a cama da do peptidoglicano é mediada principalmente pela lipopro teína da membrana externa (ver adiante). Cerca de 33% das moléculas de lipoproteína apresentam ligação covalente com o peptidoglicano, e ajudam a manter as duas estruturas unidas. Uma associação não covalente de algumas das porinas com a

B

FIGURA 2.19 (A) Dobra geral de um monômero de porina (porina OmpF de Escherichia coli). A grande estrutura oca em barril � é formada pelo arranjo antiparalelo de 16 fitas �· As fitas são ligadas por alças curtas ou giros regulares na borda periplasmática (parte inferior), e alças irregulares longas estão voltadas para o exterior da célula (parte superior). A alça interna, que liga os filamentos �5 e 6, estendendo-se no interior do barril, está representada em escuro. As terminações da cadeia estão indicadas. A superfície mais próxima do observador é envolvida em contatos de subuni dades. (8) Representação esquemática do trímero OmpF. Vista do espaço extracelular ao longo do eixo de simetria molecular tripla. (Reproduzida, com autorização, de Schirmer T: General and specific porins from bacterial outer membranes. J Struct Bio/ 1998;121:101 .)

CAPÍTULO 2

camada de peptidoglicano desempenha um papel menor na conexão da membrana externa com essa estrutura. As proteí nas da membrana externa são sintetizadas em ribossomos li gados à superfície citoplasmática da membrana interna; ainda não foi estabelecido como essas proteínas são transferidas para a membrana externa, porém uma hipótese aventada sugere que a transferência ocorre em zonas de adesão entre a membrana citoplasmática e a membrana externa, visíveis à microscopia eletrônica. Infelizmente, as evidências de tais áreas de adesão têm sido difíceis de ser demonstradas. 2. Lipopolissacarídeo (LPS) o LPS das paredes celulares gram-negativas consiste em um glicolipídeo complexo, deno minado lipídeo A, ao qual está ligado um polissacarídeo cons tituído de um cerne e uma série terminal de unidades repetidas (Fig. 2.20A). O componente do lipídeo A encontra-se embebi do no folheto externo da membrana, ancorando o LPS. O LPS é sintetizado sobre a membrana citoplasmática e transportado até sua posição exterior final. A presença do LPS é necessária para a função de muitas proteínas da membrana externa. O lipídeo A consiste em unidades dissacarídicas de glicosa mina fosforilada, às quais estão ligados vários ácidos graxos de cadeia longa (Fig. 2.20). O ácido �-hidroximirístico, um ácido graxo de Cl4, está sempre presente e é exclusivo desse lipídeo. -

Estrutura celular

29

Os outros ácidos graxos, juntamente com grupos substituintes nos fosfatos, variam de acordo com a espécie bacteriana. O cerne do polissacarídeo, mostrado nas Figuras 2.20A e B, é semelhante em todas as espécies de bactérias gram-negativas que possuem LPS e inclui dois açúcares característicos, o ácido cetodesoxioctanoico (KDO) e uma heptose. Todavia, cada es pécie contém uma unidade repetida peculiar, como, por exem plo, o da Salmonella que está ilustrada na Figura 2.20A. Em geral, as unidades de repetição consistem em trissacarídeos li neares ou em tetra ou pentassacarídeos ramificados. A unidade repetida é classificada como antígeno O. As cadeias hidrofílicas de carboidrato do antígeno O cobrem a superfície bacteriana e excluem os componentes hidrofóbicos. As moléculas de LPS de carga negativa são ligadas de modo 2 2 + não covalente por cátions divalentes (i. e., Ca e Mg +), forman do pontes cruzadas; isso estabiliza a membrana e proporciona uma barreira contra as moléculas hidrofóbicas. A remoção dos cátions divalentes com agentes quelantes ou seu deslocamento por antibióticos policatiônicos, como as polimixinas e os ami noglicosídeos, torna a membrana externa permeável as gran des moléculas hidrofóbicas. O LPS, extremamente tóxico para os animais, foi denomi nado endotoxina das bactérias gram-negativas, por estar firme mente ligado à superfície celular, sendo liberado apenas quando as células sofrem lise. Quando o LPS é clivado em lipídeo A e

Man- Abe 1

Rha 1

Gal

n

1

Man- Abe 1

1--- Cadeia lateral O

Rha 1

Gal 1

Glc- NAG 1

Gal 1

Glc- Gal 1

Hep 1

Hep-

-

8

1 KDO 1 KDO- KDO-

GlcN

GlcN

- etanolamina -

etanolamina

-

�- Acido graxo '

A

B

FIGURA 2.20 Estrutura de lipopolissacarídeo (A) Lipopolissacarídeo de Salmonella. Este diagrama levemente simplificado ilustra uma forma de LPS. (Abe, abequose; Gal, galactose; GlcN, glicosamina; Hep, heptulose; KDO, 2 ceto-3-desoxioctonato; Man, manose; NAG, N-acetilglicosamina; P, fosfato; Rha, L-ramnose.) O lipídeo A está inserido na membrana externa. (8) Modelo molecular de um lipopolissacarídeo de Escherichia coli. O lipídeo A e o cerne polissacarídeo estão em linha reta; a cadeia lateral O está dobrada em ângulo neste modelo. (Reproduzida, com autorização, de Willey VM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, and Klein's Microbiology, 7th ed., New York: McGraw-Hill; 2008. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

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SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

polissacarídeo, toda a toxicidade está associada ao lipídeo A. O antígeno O é altamente imunogênico em animais vertebrados. A especificidade antigênica, apresentada pelo antígeno O , é de corrente de sua alta variabilidade entre as espécies e até mesmo amostras dentro de uma mesma espécie bacteriana. O número de tipos antigênicos possíveis é muito grande: cerca de 1.000 fo ram reconhecidos apenas na Salmonella. Nem todas as bactérias gram-negativas possuem o LPS na membrana externa composto de um número variável de uni dades repetidas de oligossacarídeos (Fig. 2.20); os glicolipídeos da membrana externa e bactérias que colonizam as mucosas (p. ex., Neisseria meningitidis, N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae e Haemophilus ducreyi) possuem glicanos multian tenares (i. e., ramificados) relativamente curtos. Esses glicolipí deos menores foram comparados com as estruturas truncadas do " tipo R" do LPS, que não têm antígenos O e são produzidas por mutantes de bactérias entéricas, como a E. coli. Entretanto, suas estruturas assemelham-se mais estreitamente a dos glico esfingolipídeos das membranas celulares dos mamíferos, sen do mais apropriadamente denominadas lipo-oligossacarídeos (LOS). Estas moléculas exibem extensa diversidade antigênica e estrutural mesmo dentro de uma única cepa. O LOS é um importante fator de virulência. Foram identificados epítopos no LOS que imitam estruturas do hospedeiro e podem tornar esses microrganismos capazes de escapar da resposta imunoló gica do hospedeiro. Alguns LOS (p. ex., os da N. gonorrhoeae, da N. meningitidis e da H. ducreyi) possuem um resíduo de N-acetilactosamina terminal (Gal�-1 � 4-GlcNAc) que se as semelha, do ponto de vista imunoquímico, ao precursor do an tígeno i dos eritrócitos humanos. Na presença de uma enzima bacteriana denominada sialiltransferase e de um substrato do hospedeiro ou bacteriano (ácido citidina monofosfo-N-acetil neuramínico, CMP-NANA), o resíduo de N-acetilactosamina sofre sialilação. Essa sialilação, que ocorre in vivo, confere ao microrganismo as vantagens ambientais do mimetismo mole cular de um antígeno do hospedeiro e do mascaramento bioló gico proporcionado provavelmente pelos ácidos siálicos. 3. Lipoproteína as moléculas de uma lipoproteína inco mum entrelaçam-se entre a membrana externa e as camadas do peptidoglicano (Fig. 2.18). A lipoproteína contém 57 ami noácidos, representando repetições de uma sequência de 15 aminoácidos; é um peptídeo ligado aos resíduos do DAP na cadeia lateral tetrapeptídica do peptidoglicano. O componente lipídico consiste em um diglicerídeo de tioéter ligado a uma cisteína terminal, inserido de modo não covalente na membra na externa. A lipoproteína é, numericamente, a proteína mais abundante de células gram-negativas (cerca de 700.000 molé culas por célula). Sua função (baseada no comportamento de mutantes deficientes em lipoproteína) é estabilizar a membra na externa e ancorá-la na camada do peptidoglicano. -

4. O

espaço periplasmático

o espaço entre a membrana interna e a externa, denominado espaço periplasmático, con tém a camada de peptidoglicano e uma solução de proteínas semelhante a um gel. O espaço periplasmático representa cerca de 20 a 40% do volume celular, o que é bastante significativo. As proteínas periplasmáticas incluem proteínas de ligação pa ra substratos específicos (p. ex., aminoácidos, açúcares, vita minas e íons), enzimas hidrolíticas (p. ex., fosfatase alcalina e

5'-nucleotidase) que degradam substratos não transportáveis em formas passíveis de transporte e enzimas de desoxificação (p. ex., betalactamase e aminoglicosídeo fosforilase), que ina tivam determinados antibióticos. O periplasma também con tém altas concentrações de polímeros altamente ramificados de D-glicose com 8 a 10 resíduos de comprimento, variadamente substituídos por resíduos de glicerolfosfato e fosfatidiletanola mina; alguns contêm ésteres de 0-succinil. Esses, denominados oligossacarídeos derivados de membrana, parecem desempe nhar algum papel na osmorregulação, visto que as células cul tivadas em meio de baixa osmolaridade aumentam 16 vezes a síntese desses compostos.

D. Parede de células álcool-acidorresistentes Algumas bactérias, notadamente o bacilo da tuberculose (M. tu berculosis) e bactérias semelhantes, possuem paredes celulares que contêm uma grande quantidade de ceras, hidrocarbonetos complexos ramificados (70 a 90 carbonos de extensão), conhe cidos como ácidos micólicos. A parede celular é composta de peptidoglicano e de uma bicamada lipídica assimétrica; o fo lheto interno contém ácidos micólicos ligados ao arabinogalac tano, e o folheto externo contém outros lipídeos. Esta é uma bicamada lipídica altamente ordenada, na qual proteínas estão embebidas, formando poros que contêm água, através dos quais os nutrientes e certos medicamentos podem passar lentamente. Alguns compostos também podem penetrar o domínio lipídi co da parede celular, embora de maneira lenta. Essa estrutura hidrofóbica torna essas bactérias resistentes a muitos produtos químicos, como detergentes e ácidos fortes. Se um corante for introduzido nessas células por meio de um leve aquecimento ou tratamento com detergentes, não pode ser removido por ácido clorídrico diluído, como em outras bactérias. Dessa forma, tais organismos são chamados de álcool-acidorresistentes. A per meabilidade da parede celular às moléculas hidrofílicas é 100 a 1.000 vezes menor do que para a E. coli e pode ser responsável pela lenta taxa de crescimento observada nas micobactérias.

E. Parede celular das arqueobactérias As arqueobactérias não possuem parede celular como as bac térias. Algumas possuem uma simples camada S (ver adiante) geralmente formada por glicoproteínas. Algumas arqueobac térias possuem uma parede celular rígida, composta por po lissacarídeos ou um peptidoglicano chamado pseudomureína. A pseudomureína difere do peptidoglicano das bactérias por terem L-aminoácidos no lugar de D-aminoácidos e unidades dissacarídicas com uma ligação a.1�3 no lugar de �1�4. As arqueobactérias que possuem pseudomureína na parede celu lar são gram-positivas.

F. Camadas cristalinas de superfície

-

Muitas bactérias, gram-positivas e negativas, bem como arqueo bactérias, possuem uma camada em treliça, bidimensional e cristalina de moléculas de proteínas ou glicoproteínas (camada S) como o mais externo componente do envelope celular. Nas bactérias gram-positivas e negativas, esta estrutura encontra-se, algumas vezes, em densas moléculas; em algumas arqueobacté rias, está somente na camada externa da membrana celular.

CAPÍTULO 2

As camadas S geralmente são compostas de um único tipo de molécula, às vezes com carboidratos ligados. As moléculas isoladas são capazes de se autoagrupar, ou seja, fazem camadas similares ou idênticas àquelas presentes nas células. As proteínas da camada S são resistentes à ação das enzimas proteolíticas e aos agentes desnaturantes. A função da camada S é incerta, mas provavelmente tem ação protetora; em alguns casos, foi demons trado que protege a célula da ação das enzimas de degradação da parede celular, da invasão por Bdellovibrio bacteriovorous (um predador de bactérias) e dos bacteriófagos; também desempenha um papel na manutenção da forma celular em algumas espécies de arqueobactérias, e pode estar envolvida na adesão da célula às superfícies epidérmicas do hospedeiro.

Estrutura celular

31

As próprias bactérias possuem um número de autolisinas, enzimas hidrolíticas que atacam o peptidoglicano, como as muramidases, glicosaminidases, endopeptidases e carboxipep tidases. Estas enzimas catalisam a reciclagem ou a degradação do peptidoglicano na bactéria; presume-se que participem do crescimento da parede celular, da reciclagem e da divisão celu lares, porém sua atividade é mais evidente durante a dissolução das células mortas (autólise). As enzimas que degradam as paredes das células bacteria nas também são encontradas nas células que digerem bactérias (p. ex., os protozoários e as células fagocíticas dos animais su periores). H. Crescimento da parede celular

G. Enzimas que atacam a parede celular A ligação �1 �4 da estrutura do peptidoglicano é hidrolisada pela enzima lisozima (Fig. 2.16), encontrada nas secreções ani mais (na lágrima, na saliva e nas secreções nasais), bem como na clara do ovo. Bactérias gram-positivas tratadas com lisozi ma em meios de baixa força osmótica sofrem lise; se a força os mótica do meio é aumentada para equilibrar-se com a pressão osmótica da célula, são liberados corpos esféricos livres, cha mados protoplastos. A membrana externa da parede celular das bactérias gram-negativas previne o acesso da lisozima, a menos que seja rompida por ação de um agente, como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), um composto quelante de cátions divalentes; em meio osmoticamente protegido, as cé lulas tratadas com EDTA-lisozima formam esferoplastos que ainda possuem remanescentes do complexo da parede gram negativa, inclusive a membrana externa.

A síntese da parede celular é necessária para a divisão celular; entretanto, a incorporação de novo material da parede celular varia de acordo com a forma da bactéria. As bactérias em forma de bastão (p. ex., E. coli, Bacillus subtilis) possuem dois modos de síntese da parede celular; o novo peptidoglicano é inserido ao longo de uma via helicoidal que leva ao alongamento da célula, e é inserido em um anel em volta do futuro local de divisão, le vando à formação de um septo de divisão. As células cocoides, como o S. aureus, parecem não ter um modo de alongamento na síntese da parede celular. Em lugar disso, o novo peptidoglicano é inserido somente no local de divisão. Uma terceira forma de crescimento da parede celular é exemplificada por S. pneumo niae, que não é um coco verdadeiro, pois não são totalmente re dondas, mas tem a forma de uma bola de rúgbi. O S. pneumoniae sintetiza a parede celular não apenas pelo septo, mas também pelos chamados "anéis equatoriais" (Fig. 2.21).

A

B

Bacil/us subtilis ou Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae

Staphy/ococcus aureus

FIGURA 2.21 Incorporação de nova parede celular em bactérias de diferentes formatos. Bastonetes, como o Bacillus subtilis ou Escherichia coli, têm dois modos de síntese da parede celular: o novo peptidoglicano é inserido ao longo de uma via helicoidal (A), levando a uma elongação lateral da parede, e é inserido em um anel em volta do futuro septo de divisão, o que leva à formação de um septo de divisão (8). As células do Streptococcus pneumoniae têm a forma de uma bola de rúgbi e alongam-se pela inserção do novo material na parede celular, nos chamados anéis equatoriais (A), que correspondem a um crescimento extra da parede celular que engloba a célula. Um anel inicial é duplicado, e os dois anéis resultantes são pro gressivamente separados, delimitando os futuros septos da divisão das células-filhas. Em seguida, o septo de divisão é sintetizado no meio da célula (8). As células arredondadas, como o Staphylococcus aureus, parecem não possuir um modo de alongamento durante a síntese da parede celular. Em lugar disso, o novo peptidoglicano é inserido somente no septo de divisão (8). (Reproduzida, com autorização, de Scheffers DJ and Pinho MG: Bacterial cell wall synthesis: new insights from localization studies. Microbiol Mo/ Biol Rev 2005;69:585.)

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SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

1. Protoplastos, esferoplastos e formas L A remoção da parede bacteriana pode ser efetuada por hidró lise �om a lisozima ou por bloqueio da biossíntese do pepti doglicano com um antibiótico, como a penicilina. Em meios osmoticamente protegidos, esses tipos de tratamento liberam os protoplastos das células gram-positivas e esferoplastos (que retêm a membrana externa e o peptidoglicano aprisiona do) das células gram-negativas. Se tais células forem capazes de crescer e sofrer divisão denominam-se formas L. É difícil obter a cultura das formas L que em geral exigem um meio solidificado com ágar bem co mo uma força osmótica adequada. As formas L são produzidas mais facilmente com penicilina do que com lisozima, sugerin do a necessidade de peptidoglicano residual. Algumas formas L podem reverter à sua forma bacilar nor mal após a remoção do estímulo indutor. Por conseguinte, são capazes de reiniciar a síntese normal da parede celular. Outras são estáveis e nunca sofrem reversão. Nesse caso, o fator que determina sua capacidade de reversão pode também consistir na presença de peptidoglicano residual, que normalmente atua como modelo para a sua própria biossíntese. Algumas espécies bacterianas produzem formas L esponta ne��n�e. A formação de formas L, espontânea ou induzida por antibioticos no hospedeiro, pode provocar infecções crônicas, fav�rescend? a persistência desses microrganismos em regiões mais protegidas do corpo. Como as infecções pelas formas L são relativamente resistentes à antibioticoterapia, representam pro blemas especiais em quimioterapia. Sua reversão para a forma bacilar pode resultar em recidivas da infecção manifesta.

:

J. Micoplasmas Os micoplasmas são bactérias que não possuem parede ce lular nem peptidoglicano (Fig. 2.22). Existem também ar queobactérias sem parede, mas estas não têm sido tão bem estudadas. Análises genômicas colocam os micoplasmas próxi mo das bactérias gram-positivas, das quais podem ter derivado.

Os micoplasmas perdem o alvo para os agentes antimicrobianos que atuam na parede celular (p. ex., penicilinas e cefalospori nas) e, por conseguinte, são resistentes a eles. Algumas - como o Mycoplasma pneumoniae, um agente da pneumonia - con têm esteróis em suas membranas. A diferença entre as formas L e os micoplasmas é que, quando é possível a mureína (peptido glicano) ser refeita, somente as formas L revertem à sua forma bacteriana original, enquanto os micoplasmas nunca o fazem.

Cápsula e glicocálice Muitas bactérias sintetizam grandes quantidades de polímeros extracelulares quando crescem em seus ambientes naturais. Com uma exceção conhecida (as cápsulas de ácido poli-n glutâmico do Bacillus anthracis e do Bacillus licheniformis), o material extracelular consiste em polissacarídeo (Quadro 2.1). As denominações cápsula e camada de muco são usadas fre quentemente para descrever as camadas de polissacarídeo; um t�r�o ?1ais clusivo, glicocálice, também é utilizado. O glico calice e definido como um material polissacarídico ligado ao lado exterior da célula. Uma camada condensada e bem defi nida, cir�undan�o estreitamente a célula, que exclui partículas, como a tinta da India,* é denominada cápsula (Fig. 2.23). Se o glicocálice estiver associado, de maneira frouxa, à célula e não excluir partículas é referido como camada de muco. O políme ro extracelular é sintetizado por enzimas localizadas na super fície da célula bacteriana. Por exemplo, o Streptococcus mutans utiliza duas enzimas - a glicosiltransferase e a frutosiltrans fe�ase - para sintetizar os dextranos de cadeia longa (poli-D glicose) e levanos (poli-n-frutose) a partir da sacarose. Estes polímeros são denominados homopolímeros. Os polímeros que contêm mais de um tipo de monossacarídeo denominam se heteropolimeros. A cápsula contribui para a capacidade de invasão das bac térias patogênicas - as células encapsuladas ficam protegidas da fagocitose, a não ser que sejam recobertas por anticorpo an ticapsular. O glicocálice desempenha algum papel na aderência das bactérias às superfícies em seu meio ambiente, inclusive as células dos hospedeiros vegetais e animais. O S. mutans, por exemplo, deve a seu glicocálice a capacidade de aderir firme mente ao esmalte dos dentes. As células bacterianas da mesma e��écie ou de espécies diferentes ficam aprisionadas no glico cálice, que forma a camada conhecida como placa na superfí cie dentária; os produtos ácidos excretados por essas bactérias provocam cáries dentárias (Cap. 11). O papel essencial do gli cocálice em tal processo - e sua formação a partir da sacarose - explica a correlação da cárie dentária com o consumo de sacarose pela população humana. Devido à ligação entre as ca madas de polissacarídeos externas e quantidades significativas de água, a camada do glicocálice também pode desempenhar um papel na resistência à dessecação.

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Flagelos A. Estrutura

1

2

µm

1

FIGURA 2.22 Mycoplasma pneumoniae. As células variam em sua forma em virtude da falta de parede celular. (Cortesia do Dr. Edwin S. Boatman.)

Os flagelos das bactérias são apêndices piliformes compostos totalmente de proteína (com 12 a 30 nm de diâmetro). Trata-se * N. de R.T. Também conhecida como tinta da China ou nanquim.

CAPÍTULO 2

QUADRO 2.1

Estrutura celular

33

Composição química do polímero extracelular em algumas bactérias

Organismo

Polímero

Subunidades químicas

Bacillus anthracis

Polipeptídeo

Acido o-glutâmico

Enterobacter aerogenes

Polissacarídeo complexo

Glicose, fucose, ácido glicurônico

Haemophi/us influenzae

Sorogrupo B

Ribose, ribitol, fosfato

Neisseria meningitidis

Homopolímeros e heteropolímeros, como, p. ex. Sorogrupo A

N-acetilmanosamina fosfato parcialmente 0-acetilado

Sorogrupo B

Acido N-acetilneuramínico (ácido siálico)

Sorogrupo C

Acido siálico acetilado

Sorogrupo 135

Galactose, ácido siálico

Pseudomonas aeruginosa

Alginato

Streptococcus pneumoniae

Polissacarídeo complexo (muitos tipos), como, p. ex.

(pneumococo)

Tipo li

Ramnose, glicose, ácido glicurônico

Tipo Ili

Glicose, ácido glicurônico

Tipo VI

Galactose, glicose, ramnose

Tipo XIV

Galactose, glicose, N-acetilglicosamina

Tipo XVIII

Ramnose, glicose

Streptococcus pyogenes (grupo A)

Acido hialurônico

Acido glicurônico, N-acetilglicosamina

Streptococcus sa/ivarius

Levano

Frutose

A

Acido o-manurônico, ácido L-glicurônico

B

FIGURA 2.23 Cápsulas bacterianas. (A) Bacil/us anthracis, coloração de cápsula M'Faydean, crescimento a 35º( em sangue de cavalo desfibrina do. (8) Demonstração da presença de cápsula no Bacillus anthracis por coloração negativa com tinta da fndia. Este método é útil para melhorar a visualização das bactérias encapsuladas em amostras clínicas, tais como sangue, garrafas de cultura de sangue (hemoculturas) ou líquido cere brospinal. (CDC, cortesia de Larry Stauffer, Oregon State Public Health Laboratory.)

dos órgãos de locomoção das formas que os possuem. São co nhecidos três tipos de disposição: monotríquio (flagelo polar único), lofotríquio (inúmeros flagelos polares) e peritríquio (flagelos distribuídos por toda a superfície da célula). Os três tipos estão ilustrados na Figura 2.24. O flagelo bacteriano é constituído de vários milhares de moléculas de uma subunidade proteica, denominada flagelina. Em alguns microrganismos (p. ex., Caulobacter), os flagelos são

constituídos de dois tipos de flagelina; entretanto, na maioria dos casos observa-se apenas um tipo. O flagelo é formado pela agregação de subunidades, formando uma estrutura helicoidal. Se os flagelos são removidos pela agitação mecânica de uma suspensão de bactérias, verifica-se a rápida formação de novos flagelos mediante a síntese, agregação e extrusão de subunida des de flagelina; a motilidade é restaurada em 3 a 6 min. As flagelinas de diferentes espécies bacterianas presumivelmente

34

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

FIGURA 2.24 Tipos de flagelo bacteriano. (A) Vibrio metchnikovii, uma bactéria monotríquia (ampliada 7.500 vezes). (Reproduzida, com autoriza ção, de van lterson W: Biochim Biophys Acta 1947;1:527.) (8) Micrografia eletrônica de Spirillum serpens, mostrando a flagelação lofotríquia (ampliada 9.000 vezes). (Reproduzida, com autorização, de van lterson W: Biochim Biophys Acta 1947;1:527.) (C) Micrografia eletrônica de Proteus vulgaris, mos trando a flagelação peritríquia (ampliada 9.000 vezes). Observe os grânulos basais. (Reproduzida, com autorização, de Houwink A, van lterson W: Electron microscopical observations on bacterial cytology; a study on flagellation Biochim Biophys Acta 1950;5:1 O.)

diferem umas das outras na sua estrutura primária; são alta mente antigênicas (antígenos H), e algumas das respostas imunológicas à infecção são dirigidas contra essas proteínas. O flagelo está fixado ao corpo celular da bactéria por uma estrutura complexa constituída de um gancho e um corpúsculo basal. O gancho consiste em uma estrutura curta e recurvada,

A

que parece atuar como articulação universal entre o motor na estrutura basal e o flagelo. O corpúsculo basal sustenta um conjunto de anéis, um par nas bactérias gram-positivas e dois pares nas gram-negativas. A Figura 2.25 mostra um dia grama representativo da estrutura gram-negativa; os anéis de signados por L e P estão ausentes nas células gram-positivas.

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B

Filamento cap (FliD)

Filamento (FliC) Filamento Hélice

20 nm

Gancho (Fig E)

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Membrana externa Espaço periplásmico

Corpo basal

/ \

Interruptor

_

Aparato de exportação

Interruptor (FliG, FliM, FliN) Exportação

[)

D

Q�1 CJ: :CJ

---

(FlhA, FliH, Flil)?

Anel P (Flgl)

Casquilho

_

----

Membrana celular

\ Motor

Anel L (FlgH)

1 )

Bastonete distal (Flgl) Bastonete proximal (FliE,FlgB, FlgC, FlgF) Anel MS (FliF)

Eixo de transmissão

} Placa de

montagem

Motor (MotA, MotB)

FIGURA 2.25 (A) Estrutura geral do flagelo de uma bactéria gram-negativa, como Escherichia coli ou Salmonella Typhimurium. O complexo fila mento-gancho-corpúsculo basal foi isolado e extensamente caracterizado. A localização do aparelho de exportação não foi ainda demonstrada. (8) Diagrama fragmentado do flagelo, mostrando as subestruturas e proteínas que o compõem. A proteína FliF é responsável pela característica dos anéis M e S, bem como do colar da subestrutura mostrada, denominada em conjunto anel MS. A localização de FliE com relação ao anel MS e a do bastonete, bem como a ordem das proteínas FlgB, FlgC e FlgF dentro do bastonete proximal, não são conhecidas. (Extraída de Macnab RM: Genetics and biogenesis of bacterial flagella. Annu Rev Genet 1992;26:131. Reproduzida, com autorização, de Annual Review ofGenetics, Volume. 26. © 1992 by Annual Reviews.)

CAPÍTULO 2

A complexidade do flagelo bacteriano é revelada por estudos genéticos, mostrando que mais de 40 produtos gênicos estão envolvidos em sua organização e sua função. Os flagelos são produzidos em etapas (Fig. 2.25). Primeira mente, o corpo basal é montado e inserido no envelope celular. Em seguida, o gancho é adicionado e, por fim, o filamento é progressivamente produzido pela adição de subunidades de flagelina na extremidade nascente. As subunidades de flagelina são expelidas através de um canal central oco no flagelo; quan do alcança a extremidade, ele se condensa com os predecesso res, e dessa forma o filamento se alonga.

B. Motilidade Os flagelos bacterianos são rotores helicoidais semirrígidos que conferem à célula um movimento de rotação, impulsionada pe lo fluxo de prótons no interior da célula ao longo do gradiente produzido pela bomba de prótons primária (ver anteriormen te); na ausência de uma fonte de energia metabólica, a rota ção pode ser impulsionada por uma força motriz de prótons gerada por ionóforos. As bactérias que vivem em ambientes alcalinos (alcalófilas) utilizam a energia do gradiente de íons sódio - em lugar do gradiente de prótons - para impulsionar o motor flagelar (Fig. 2.26). Todos os componentes do motor flagelar localizam-se no envelope celular. Os flagelos fDCados a envelopes celulares

Estrutura celular

35

isolados e fechados sofrem rotação normal quando o meio contém um substrato apropriado à respiração, ou quando se estabelece artificialmente um gradiente de prótons. Quando uma bactéria peritríquia se locomove, seus flage los associam-se para formar um feixe posterior que impulsiona a célula para a frente, em linha reta, por rotação anti-horária. A determinados intervalos, os flagelos invertem seu sentido de rotação e sofrem dissociação momentânea, fazendo com que a célula pare até que o movimento seja retomado e uma nova direção seja determinada aleatoriamente. Esse comportamen to propicia a propriedade da quimiotaxia: uma célula que está se afastando da fonte de um agente químico atraente para e se reorienta mais frequentemente que uma célula que está se des locando em direção ao agente de atração, resultando no movi mento final da célula em direção à fonte. A presença de uma substância química atraente (p. ex., açúcar ou um aminoácido) é percebida por receptores específicos localizados na membrana celular (em muitos casos, o mesmo receptor também participa no transporte de membrana dessa molécula). A célula bacteria na é muito pequena para ser capaz de detectar a existência de um gradiente químico espacial ( i. e., um gradiente entre seus dois polos); em vez disso, experimentos mostram que a célula detecta gradientes temporais, isto é, concentrações que dimi nuem com o decorrer do tempo, quando a célula está se afas tando da fonte de atração, e que aumentam com o decorrer do tempo, quando a célula está se movendo em sua direção.

Filamento

Gancho ----

Membrana externa Mureína

Corpo basal

Espaço periplasmático

Membrana celular e e e e

e Interruptor

Motor

FIGURA 2.26 Componentes estruturais no interior do corpúsculo basal do flagelo que permitem a rotação da porção interna dessa estrutura, dos bastonetes do corpúsculo basal e do complexo gancho-filamento fixado. Os anéis externos permanecem estáticos em contato com as membra nas celulares interna e externa, e com a parede celular {mureína), ancorando o complexo do flagelo ao envelope da célula bacteriana. A rotação é impulsionada pelo fluxo de prótons, através do motor, a partir do espaço periplasmático, fora da membrana celular, para o citoplasma em resposta ao campo elétrico e ao gradiente de prótons através da membrana, que juntos constituem a força motriz de prótons. Uma "chave" determina a direção da rotação, a qual estabelece se a bactéria irá se movimentar para a frente {devido à rotação anti-horário do flagelo) ou de modo inverso {devido à rotação do flagelo no sentido horário.) {Reproduzida, com autorização, de Saier MH Jr: Peter Mitchell and his chemiosmotic theories.ASM News 1997;63:13.)

SEÇÃO 1

36

Fundamentos da Microbiologia

Alguns compostos atuam mais como repelentes do que co mo atraentes. Um mecanismo pelo qual as células respondem a substâncias atraentes e repelentes envolve metilação e desme tilação mediadas por cGMP de proteínas específicas na mem brana. Enquanto as substâncias atraentes provocam a inibição transitória da desmetilação dessas proteínas, as repelentes esti mulam sua desmetilação. O mecanismo pelo qual uma alteração do comportamento da célula é desencadeada em resposta a alguma mudança no meio ambiente denomina-se transdução sensorial. A transdu ção sensorial é responsável não apenas pela quiomiotaxia, mas também pela aerotaxia (movimento em direção à concentra ção ideal de oxigênio), pela fototaxia (movimento das bactérias fotossintéticas em direção ao lúmen) e pela taxia dos aceptores de elétrons (movimento das bactérias respiratórias em dire ção aos aceptores de elétrons alternativos, como o nitrato e o fumarato). Nessas três respostas, bem como na quimiotaxia, o movimento final é determinado pela regulação da resposta de inversão do movimento.

Pili (fímbrias) Muitas bactérias gram-negativas são dotadas de apêndices su perficiais rígidos, denominados pili (latim; significa "pelos") ou fímbrias (do latim, "franjas"), mais curtos e mais finos que os flagelos; similar aos flagelos, são compostos de subunidades proteicas estruturais denominadas pilinas. Alguns pili contêm um tipo de pilina, enquanto os outros apresentam mais de um tipo. As proteínas menores, chamadas adesinas, estão localiza das nas pontas dos pili e são responsáveis pelas propriedades de fixação. É possível distinguir duas classes: os pili comuns, que desempenham um papel na aderência das bactérias sim bióticas e patogênicas às células hospedeiras, e os pili sexuais, responsáveis pela fixação das células doadoras e receptoras no processo de conjugação bacteriana (Cap. 7). Os pili estão ilus trados na Figura 2.27, em que os pili sexuais foram recobertos por partículas de fagos para os quais atuam como receptores específicos.

A motilidade via pili é completamente diferente da motilida de por flagelos. As moléculas de pilina exibem disposição heli coidal, formando um cilindro que não sofre rotação nem possui corpúsculo basal completo. Suas extremidades aderem forte mente às superfícies distantes das células. Em seguida, os pili se despolimerizam de sua extremidade terminal, retraindo-se para dentro da célula. O resultado de tal manobra é que a bactéria move-se na direção da ponta aderente. Esse tipo de motilidade de superfície é chamado de contração, sendo amplamente em pregado pelas bactérias que possuem pili. Diferentemente dos flagelos, os pili crescem do interior para o exterior da célula. A virulência de certas bactérias patogênicas depende da pro dução não apenas de toxinas como também de "antígenos de colonização", reconhecidos como pili comuns, que conferem às células suas propriedades de aderência. Nas cepas enteropato gênicas de E. coli, tanto as enterotoxinas quanto os antígenos de colonização (pili) são geneticamente determinados por plasmí deos transmissíveis, conforme discutido no Capítulo 7. Em um grupo de cocos gram-positivos, os estreptococos, as fímbrias constituem o local do principal antígeno de superfície, a proteína M. O ácido lipoteicoico, associado a essas fímbrias, é responsável pela aderência dos estreptococos do grupo A às células epiteliais de seus hospedeiros. Os pili de diferentes bactérias são antigenicamente distin tos e desencadeiam a formação de anticorpos pelo hospedeiro. Os anticorpos contra os pili de uma espécie bacteriana não im pedem a fixação de outra espécie. Algumas bactérias (Cap. 21), como a N. gonorrhoeae, são capazes de formar pili de diferen tes tipos antigênicos (variação antigênica), e, por conseguinte, são ainda capazes de aderir células na presença de anticorpos contra o seu tipo original de pili. Assim como as cápsulas, os pili inibem a habilidade fagocítica dos leucócitos.

Endósporos Os membros de vários gêneros de bactérias são capazes de for mar endósporos (Fig. 2.28). Os dois mais comuns são bastone tes gram-positivos: o gênero Bacillus, aeróbio obrigatório, e o gênero Clostridium, anaeróbio obrigatório. As outras bactérias conhecidas por formar endósporos são a Thermoactinomyces,

Sporolactobacillus, Sporosarcina, Sporotomaculum, Sporomu sa e Sporohalobacter spp. Esses microrganismos sofrem um Pilus sexual

Pili

Flagelo

comuns

ciclo de diferenciação em resposta a condições ambientais. O processo, esporulação, é desencadeado próximo da depleção de algum dos diversos nutrientes (carbono, nitrogênio ou fós foro). Cada célula forma um único esporo interno, liberado quando a célula-mãe sofre autólise. O esporo é uma célula em repouso, altamente resistente à dessecação, ao calor e a agentes químicos; quando reencontra condições nutricionais favorá veis e é ativado (ver adiante), o esporo germina, produzindo uma única célula vegetativa. A. Esporulação

1 µm

FIGURA 2.27 Pili. Uma Eschericha coli expressando pili em sua superfície. Os pili curtos (fímbrias medeiam a aderência; e o pilus se xual está envolvido na transferência do DNA. (Cortesia do Dr. Charles Brinton Jr.)

O processo de esporulação começa quando as condições nutri cionais se tornam desfavoráveis, sendo a proximidade da de pleção da fonte de nitrogênio ou de carbono (ou de ambos) o fator mais significativo. A esporulação ocorre maciçamente em culturas no final de crescimento exponencial, em consequência dessa proximidade da depleção.

CAPÍTULO 2

Estrutura celular

37

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FIGURA 2.28 Células de Bacillus em esporulação. (A) Bacillus não identificado do solo. (8) Bacillus cereus. (C) Bacillus megaterium. (Reproduzida, com autorização, de Robinow CF: Structure, ln Gunsalus IC, Stanier RY [editors]. The Bacteria: A Treatise on Structure and Function, Vol 1. Academic Press, 1960.)

A esporulação envolve a produção de muitas estruturas, enzimas e metabólitos novos, juntamente com o desapareci mento de vários componentes celulares vegetativos. Essas alte rações representam um verdadeiro processo de diferenciação: uma série de genes, cujos produtos determinam a formação e a composição final do esporo, é ativada. Tais alterações en volvem modificações na especificidade de transcrição da RNA polimerase, determinada pela associação da proteína central da polimerase com uma ou outra proteína específica promotora, denominada fator sigma. São produzidos diferentes fatores sigma durante o crescimento vegetativo e a esporulação. Du rante o crescimento vegetativo, um fator sigma, denominado crA, predomina. Em seguida, no decorrer da esporulação, cinco outros fatores sigma são formados, o que causa a expressão de vários genes de esporos em tempos diversos, em localizações específicas. A sequência de eventos na esporulação é altamente com plexa: a diferenciação de uma célula vegetativa de B. subtilis em endósporo requer cerca de 7 h em condições laboratoriais. São observados diferentes eventos morfológicos e químicos nos es tágios sequenciais do processo. Sete estágios diferentes foram identificados. Em termos morfológicos, a esporulação começa com a formação de um filamento axial (Fig. 2.29). O processo pros segue com a invaginação da membrana, de modo a produzir uma estrutura de membrana dupla cujas superfícies corres pondem à superfície de síntese da parede celular do envelo pe. Os locais de crescimento movem-se progressivamente em direção ao polo da célula, de modo a envolver o esporo em desenvolvimento. As duas membranas do esporo passam a atuar na síntese ativa de camadas especiais que irão formar o envelope celular: a parede do esporo e o córtex, situados fora das membranas. No citoplasma recém-isolado ou cerne, ocorre a degradação de muitas enzimas da célula vegetativa, substituídas por um con junto de componentes próprios do esporo.

B. Propriedades dos endósporos

-

1 . Cerne o cerne é o protoplasto do esporo; contém um núcleo completo (cromossomo), todos os componentes do aparelho de síntese das proteínas e um sistema gerador de energia baseado na glicólise. Os citocromos estão ausentes até mesmo nas espécies aeróbias, cujos esporos dependem de uma via curta de transporte de elétrons que envolve as flavo proteínas. Diversas enzimas da célula vegetativa são encon tradas em maiores concentrações (p. ex., alanina racemase), e verifica-se a formação de várias enzimas peculiares (p. ex., ácido dipicolínico sintetase). Os esporos contêm nucleotídeos piridina não reduzidos ou ATP. A energia para germinação é armazenada mais em forma de 3-fosfoglicerato do que em forma de ATP. A resistência dos esporos ao calor deve-se, em parte, a seu estado desidratado e, em parte, à presença, no cerne, de gran des quantidades (5 a 15% do peso seco do esporo) de dipicoli nato de cálcio, formado a partir de um intermediário da via de biossíntese da lisina (Fig. 6.19). De alguma maneira ainda não totalmente elucidada, essas propriedades resultam em estabili zação das enzimas do esporo, cuja maioria exibe termolabilida de normal quando isolada na forma solúvel.

-

2. Parede do esporo a camada mais interna que circunda a membrana interna do esporo é denominada parede do espo ro; contém peptidoglicano normal e transforma-se na parede celular da célula vegetativa em germinação.

3. Córtex - o córtex é a camada mais espessa do envelope

do esporo; contém um tipo incomum de peptidoglicano, com um número muito menor de ligações cruzadas em compara ção com as encontradas no peptidoglicano da parede celular. O peptidoglicano do córtex é extremamente sensível à lisozi ma, e sua autólise desempenha um papel na germinação do esporo.

38

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

G)

Parede celular

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Formação do filamento axial DNA

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Formação do septo do pré-esporo

Captação do pré-esporo -

Célula mãe do

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Síntese do córtex

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Deposição da capa

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Córtex

Parede celular germinativa

Maturação

Capas do esporo

(j) Lise da célula mãe

Esporo FIGURA 2.29 Estágios de formação do endósporo. (Reproduzida, com autorização, de Merrick MJ: Streptomyces. ln: Parish JH [editor]. Develop mental Biology ofProcaryotes. Univ California Press, 1979.)

4. Capa

a capa é constituída de uma proteína semelhante à ceratina, contendo muitas ligações de dissulfeto intramolecu lares. A impermeabilidade dessa camada confere aos esporos sua relativa resistência aos agentes químicos antibacterianos. -

C. Germinação O processo de germinação ocorre em três estágios: ativação, iniciação e crescimento. 1 . Ativação a maioria dos endósporos é incapaz de ger minar imediatamente após a sua formação. Entretanto, podem germinar depois de permanecer em repouso por vários dias ou ser inicialmente ativados, em meio nutricionalmente rico, por um ou outro agente capaz de lesionar a capa do esporo. Entre os agentes que podem vencer o estado de dormência do esporo, destacam-se o calor, a abrasão, a acidez e os compostos que contêm grupos sulfidrila livres. -

5. Exósporo o exósporo é composto por proteínas, lipí deos e carboidratos. Consiste em uma camada basal paracris talina e uma região externa semelhante ao cabelo. Não se sabe qual é a função do exósporo. Os esporos de algumas espécies de Bacillus (p. ex., B. anthracis e B. cereus) possuem exósporo, porém outras espécies (p. ex., B. atrophaeus) possuem esporos sem essa estrutura. -

CAPÍTULO 2

2. Iniciação Após ativação, o esporo irá iniciar o processo de germinação se as condições ambientais forem favoráveis. Diferentes espécies desenvolveram receptores que reconhe cem efetores distintos como sinalização de um meio propício. Assim, a iniciação é deflagrada pela L-alanina em uma espécie e pela adenosina em outra. A ligação do efetor ativa uma au tolisina que degrada rapidamente o peptidoglicano do córtex. Ocorre a captação de água, o dipicolinato de cálcio é liberado, e verifica-se a degradação de uma variedade de componentes do esporo por enzimas hidrolíticas. -

3. Crescimento a degradação do córtex e das camadas ex ternas resulta no aparecimento de uma nova célula vegetativa, constituída pelo protoplasto do esporo com sua parede circun dante. Segue-se um período de biossíntese ativa; esse período, que termina na divisão celular, é denominado brotamento. O brotamento exige o suprimento de todos os nutrientes essen ciais para o crescimento da célula. -

COLORAÇÃO Os corantes combinam-se quimicamente com o protoplasma bacteriano; se a célula ainda não estiver morta, o próprio pro cesso de coloração irá destruí-la. Por conseguinte, trata-se de um processo drástico, passível de produzir artefatos. Os corantes comumente utilizados são os sais. Os corantes básicos consistem em um cátion dotado de cor com um ânion incolor (p. ex., azul de metileno+ cloreto- ); os corantes ácidos comportam-se de modo inverso (p. ex., sódio+ eosinato-). As células bacterianas são ricas em ácido nucleico, apresentando cargas negativas em forma de grupos fosfato que se combinam com os corantes básicos de carga positiva. Os corantes ácidos não coram as células bacterianas e, por conseguinte, podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor con trastante (ver Coloração negativa). Os corantes básicos coram uniformemente as células bac terianas, a não ser que o RNA citoplasmático seja inicialmente destruído. Entretanto, podem-se utilizar técnicas especiais de coloração para diferenciar os flagelos, cápsulas, paredes celula res, membranas celulares, grânulos, nucleoides e esporos.

Estrutura celular

39

células gram-negativas descoradas adquirem uma cor contras tante; nessa etapa, as células gram-positivas exibem uma cor purpura. A base da reação diferencial de Gram é a estrutura da pare de celular, conforme discutimos anteriormente neste capítulo. ,

Coloração álcool-acidorresistente As bactérias álcool-acidorresistentes são as que retêm carbol fucsina (fucsina básica dissolvida em uma mistura de fenol álcool-água) mesmo quando descoradas com ácido clorídrico em álcool. Um esfregaço de células em lâmina é banhado com carbolfucsina e aquecido ao vapor. Após esta etapa, procede-se à descoloração com ácido-álcool e por fim aplica-se um con tracorante contrastante (azul ou verde) (Cap. 47). As bactérias álcool-acidorresistentes (micobactérias e alguns dos actinomi cetos relacionados) adquirem cor vermelha, enquanto as ou tras apresentam a cor do contracorante.

Coloração negativa É um procedimento que envolve a coloração do material de fundo com um corante ácido, deixando as células incolores. O corante negro nigrosina é comumente utilizado. Esse método é empregado para as células ou estruturas que são difíceis de serem coradas diretamente (Fig. 2.23B).

Coloração dos flagelos Os flagelos são demasiado finos (12 a 30 nm de diâmetro) para serem visíveis ao microscópio óptico. Entretanto, sua presença e sua distribuição podem ser demonstradas ao se tratarem as células com uma suspensão coloidal instável de sais de ácido tâ nico, provocando a formação de um precipitado maciço sobre

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A coloração de Gram

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Uma importante característica taxonômica das bactérias con siste na sua resposta à coloração de Gram. A propriedade de coloração de Gram parece fundamental, visto que a reação está correlacionada com muitas outras propriedades morfológicas em formas filogeneticamente correlatas (Cap. 3). Um micror ganismo potencialmente gram-positivo pode aparecer dessa maneira apenas em determinado conjunto de condições am bientais e em uma cultura jovem. A coloração de Gram (Cap. 47) começa com a aplicação de um corante básico, o cristal violeta. Em seguida, aplica-se uma solução de iodo; todas as bactérias coram-se em azul nessa eta pa do processo. Depois, as células são tratadas com álcool. As células gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo, permanecendo azuis; as células gram-negativas são totalmente descoradas pelo álcool. Como etapa final, aplica-se um contra corante (como o corante vermelho safranina*), de modo que as

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* N. de R.T. A fucsina também pode ser utilizada como contracorante no lugar da safranina.

FIGURA 2.30 Coloração para flagelos de espécies Pseudomonas. (Reproduzida, com autorização, de Leifson E: J Bacterio/ 1951;62:377.)

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40

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

as paredes celulares e os flagelos. Dessa maneira, o diâmetro aparente dos flagelos aumenta, de modo que a coloração subse quente com fucsina básica irá torná-los visíveis ao microscópio óptico. A Figura 2.30 mostra células coradas por esse método. Nas bactérias peritríquias, os flagelos formam feixes duran te o movimento, podendo ser espessos o suficiente para serem observados em células vivas à microscopia de campo escuro ou de contraste de fase.

Coloração da cápsula Em geral, as cápsulas são evidenciadas pelo processo de colo ração negativa ou por uma modificação desta (Fig. 2.23). Um desses "corantes de cápsula" (método de Welch) envolve o tra tamento com solução quente de cristal violeta, seguido de la vagem com solução de sulfato de cobre, utilizada para remover o excesso do corante, pois a lavagem convencional com água dissolveria a cápsula. O sal de cobre também cora o fundo, re sultando em uma célula e fundo de cor azul-escura, enquanto a cápsula aparece em azul bem mais claro.

Coloração dos nucleoides Os nucleoides podem ser corados pelo corante de Feulgen, es pecífico do DNA (Fig. 2.5).

ALTERAÇÕESMORFOLÓGICASDURANTEO CRESCIMENTO Divisão celular A maior parte das bactérias se divide, por fissão binária, em duas novas células-filhas idênticas. Em uma cultura em cres cimento de um bacilo, como E. coli, as células elongam-se, formando uma partição que por fim separa a célula em duas células-filhas. A partição é referida como um septo, e é o re sultado do crescimento interno da membrana citoplasmática e da parede celular em direções opostas até que as duas células filhas sejam separadas. Os cromossomos, cujo número dupli cou antes da divisão, distribuem-se igualmente para as duas células-filhas. Embora as bactérias não tenham fuso mitótico, o septo é formado de modo a separar os dois cromossomos-filhos for mados por replicação dos cromossomos, processo efetuado pela fixação do cromossomo à membrana celular. De acordo com o modelo, o término de um ciclo de replicação do DNA deflagra a síntese ativa da membrana entre os locais de fixa ção dos dois cromossomos-filhos. Os cromossomos são então separados pelo crescimento interno do septo, indo uma cópia para cada célula-filha.

Agrupamentos celulares

Coloração dos esporos Os esporos são observados mais simplesmente em forma de corpúsculos intracelulares refráteis (Fig. 2.28) em suspensões de células não coradas ou como áreas incolores em células co radas por métodos convencionais. A parede do esporo é relati vamente impermeável, porém os corantes podem atravessá-la mediante o aquecimento da preparação. Em seguida, a mesma impermeabilidade serve para evitar a descoloração do esporo pelo tratamento com álcool, suficiente para descorar as células vegetativas, que podem ser finalmente contracoradas. Comu mente, os esporos são corados com verde de malaquita ou car bolfucsina (Fig. 2.31).

Se as células permanecerem temporariamente ligadas após a di visão, verificar-se-á o aparecimento de certos grupamentos ca racterísticos. Dependendo do plano de divisão e do número de divisões durante as quais as células permanecem ligadas, pode ocorrer a seguinte disposição em forma de cocos: cadeias (estrep tococos), pares (diplococos), feixes cúbicos (sarcinas) ou placas achatadas. Os bastonetes podem formar pares ou cadeias. Após a divisão de algumas bactérias, são observados mo vimentos pós-fissão característicos. Assim, por exemplo, um movimento "em chicote" pode colocar as células em posições paralelas; a divisão repetida e o movimento em chicote resul tam no arranjo em "paliçada" típico dos bacilos diftéricos.

RESUMO DO CAPÍTULO *

*

*

'

'

1

10 µm

1

FIGURA 2.31 Coloração para endósporo. Os endósporos retêm o corante primário, verde de malaquita. Contracoloração com safranina confere uma coloração avermelhada a outras células. (© Jack M. Bostra ck/Visuals Unlimited.)

A microscopia tem desempenhado um papel importante na nossa compreensão sobre as estruturas celulares. As células eucarióticas são caracterizadas pela presença de membrana nuclear, retículo endoplasmático, ribossomos SOS e plastídeos (mitocôndrias e cloroplastos). A membrana plasmática é caracterizada pela presença de esteroides (co lesterol). Enquanto as células procarióticas não apresentam membrana nuclear e são haploides. Seu citoplasma contém ribossomos 70S e não possuem mitocôndria e cloroplastos. As principais funções da membrana citoplasmática das cé lulas procarióticas são (1) permeabilidade seletiva e trans porte de solutos (2) em espécies aeróbias, atua no transporte de elétrons e na fosforilação oxidativa (3) excreção de en zimas hidrolíticas e de outras proteínas (4) atua como lo cal das enzimas e moléculas carregadoras que participam na biossíntese do DNA, de polímeros da parede celular e de lipídeos de membrana; e (5) local dos receptores e de

CAPÍTULO 2

*

*

*

*

*

proteínas quimiotáticos além de outros sistemas de trans dução sensorial. A maioria das bactérias é classificada em gram-positiva ou gram-negativa baseado na resposta à coloração de Gram. A classificação dos dois grupos reflete diferenças fundamen tais na composição de suas paredes celulares. A parede das bactérias gram-positivas consiste em uma membrana plasmática e uma espessa camada de peptido glicano; a parede celular das bactérias gram-negativas é composta de membrana plasmática, de uma delgada cama da de peptidoglicano e uma membrana externa contendo lipopolissacarídeo (entotoxina). O espaço entre a membra na plasmática e a membrana externa é denominado espaço periplásmico. Muitas bactérias sintetizam uma grande quantidade de po límeros extracelulares. Quando este polímero forma uma camada condensada e bem defmida ao redor da célula bac teriana, que exclui partículas como a tinta da Índia, é de nominado cápsula. As cápsulas são importantes fatores de virulência protegendo a célula bacteriana da fagocitose. As estruturas de superfície celular como pili e flagelos são importantes para a aderência e motilidade, respectivamente. A formação de endósporo é uma característica dos gêne ros Bacillus e Clostridium, sendo desencadeada pela falta de nutrientes no ambiente. O endósporo (esporos) são células quiescentes, extremamente resistentes à dessecação, ao ca lor e a agentes químicos. Quando as condições nutricionais favoráveis retornam, os esporos germinam e produzem a célula vegetativa.

(A) (B) (C) (D) (E)

É transparente

(A) (B) (C) (D) (E)

(A) (B) (C) (D) (E)

Mitocôndria Complexo de Golgi Microtúbulos Retículo endoplasmático Membrana nuclear

3. Qual das seguintes estruturas não é parte do envelope celular bacteriano? (A) (B) (C) (D) (E)

Peptidoglicano Lipopolissacarídeo Cápsula Vacúolo gasoso Camada s

Ligação dependente de proteína Translocação de grupo Simporte Uniporte Difusão facilitada

5. Qual dos seguintes componentes está presente nas bactérias gram-negativas mas não nas gram-positivas? (A) (B) (C) (D) (E)

Peptidoglicano Lipídeo A Cápsula Flagelos

Pili

6. Qual dos seguintes componentes está presente em bactérias gram-positivas mas não nas gram-negativas? (A) (B) (C) (D) (E)

Peptidoglicano Cápsula Flagelos Acido teicoico Acido diaminopimélico

7. No outono de 2001, uma série de cartas que continham esporos do Bacillus anthracis foram postadas para membros da mídia e do Senado dos EUA. O resultado foram 22 casos de antraz, com cinco mortes. A resistência ao aquecimento dos esporos bacterianos, tais como os do B. anthracis, deve-se, em parte, ao seu estado de desi dratação e, em parte, à presença de grandes quantidades de: (A) (B) (C) (D) (E)

Acido diaminopimélico Acido d-glutâmico Dipicolinato de cálcio Proteínas que contêm sulfidrila Lipídeo A

8. Qual dos seguintes termos não descreve o cromossomo bacte riano? (A) (B) (C) (D) (E)

Haploide Diploide Circular Nucleoide Feulgen positivo

9. A lisozima cliva as ligações Pl�4 entre:

Não pode ser corado por corantes comuns Possui um diâmetro menor que 0,2 µm O comprimento de onda da luz branca é muito longo O rápido movimento do organismo impede a visualização

2. O cloranfenicol, um antibiótico que inibe a síntese proteica bacte riana, também afeta qual das seguintes organelas eucarióticas?

41

4. Qual dos seguintes mecanismos de transporte funciona sem ne cessidade de energia?

QUESTÕES DE REVISÃO 1. Um homem de 22 anos apresenta-se com úlcera indolor de 1 cm no corpo do pênis. Observa-se a presença de linfadenopatia in guinal. O paciente admite negociar drogas por sexo e que teve diversas parceiras sexuais. O teste RPR deu positivo e suspeita-se de sífilis; entretanto, a coloração de Gram de uma amostra reti rada da úlcera não mostrou a presença de bactérias. O Treponema pallidum, o agente causador da sífilis, não pode ser visualizado por microscopia óptica, pois

Estrutura celular

(A) (B) (C) (D) (E)

D-alanina e ponte pentaglicídica Acido N-acetilmurâmico e D-alanina Lipídeo A e KDO Acido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina D-alanina e D-alanina

10. As espécies de Mycoplasma não apresentam os seguintes com ponentes: (A) (B) (C) (D) (E)

Ribossomos Membrana plasmática DNA e RNA Lipídeos Peptideoglicano

Respostas c

4. E

7. c

2. A

5. B

8. B

3. D

6. D

9. D

1.

10. E

42

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

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C A P Í T U L O

TAXONOMIA O VOCABULÁRIO DA MICROBIOLOGIA MÉDICA Uma olhada no sumário deste livro é suficiente para apreciar mos a diversidade dos patógenos clínicos que estão associa dos às doenças infecciosas. Estima-se que atualmente temos capacidade para identificar menos de 10% dos patógenos res ponsáveis por causarem doenças no homem, devido à nossa incapacidade de cultivar ou identificar esses microrganismos utilizando sondas moleculares. No entanto, a diversidade dos patógenos identificáveis é tão grande que é importante conhe cermos as sutis diferenças associadas a esses agentes infeccio sos. A explicação para a importância de se compreender essas sutilezas é que cada agente infeccioso é especificamente adap tado a um ou mais modos de transmissão, mecanismos para infectar hospedeiros humanos (colonização) e mecanismos para causar doença (patologia). Como tal, um vocabulário que comunique de modo consistente as características únicas dos agentes infecciosos para estudantes, microbiologistas e agentes de saúde é crucial para evitar o caos que poderia ocorrer sem as restrições organizacionais da taxonomia bacteriana (do Grego taxon arrumação, organização; por exemplo, a classificação de microrganismos em um sistema ordenado, indicando uma relação natural). A classificação, a nomenclatura e a identificação consti tuem três áreas distintas, porém inter-relacionadas da taxono mia. A classificação pode ser definida como a categorização de microrganismos em grupos taxonômicos. A classificação de bactérias exige um conhecimento adquirido por meio de técnicas experimentais e de observação, devido à frequente necessidade de se recorrer a propriedades bioquímicas, fisio lógicas, genéticas e morfológicas para efetuar uma descrição adequada de um táxon. Nomenclatura refere-se à designação de um organismo segundo regras internacionais (estabeleci das por um grupo de profissionais clínicos reconhecidos), de acordo com suas características. A identificação é o uso práti co de um esquema de classificação para: ( 1) isolar e distinguir microrganismos desejáveis de outros indesejáveis; (2) verificar a autenticidade ou as propriedades especiais de determinada cultura, (3) isolar e identificar o agente etiológico de determi nada doença. A última função pode levar à seleção de um trata mento farmacológico orientado para a erradicação do agente, de uma vacina que atenue sua patologia, ou de uma medida de saúde pública (p. ex., lavagem de mãos ou uso de preservativo) que previna sua transmissão. =

Os esquemas de identificação não são esquemas de classifi cação, embora possam ter alguma semelhança superficial. Um esquema de identificação para um grupo de microrganismos só é possível após a classificação inicial desse grupo, isto é, o reconhecimento de que tais microrganismos são diferentes de outros microrganismos. Por exemplo, a literatura popular tem relatado que Escherichia coli é a causa da síndrome urêmico hemolítica (SHU) em crianças. Existem centenas de diferentes cepas que são classificadas como E. coli, mas poucas delas estão associadas a SHU. Estas cepas podem ser diferenciadas de mui tas outras cepas de E. coli pela reatividade com anticorpos de seus antígenos O e H, como foi descrito no Capítulo 2 (p. ex., E. coli 0157:H7). A taxonomia, e a nomenclatura que a acom panha, é uma ciência imprecisa e em evolução. Assim como nosso vocabulário social evolui, o mesmo ocorre com o voca bulário da microbiologia clínica. Qualquer profissional identi ficado com doenças infecciosas deve estar ciente da taxonomia evolutiva dos microrganismos infecciosos. As categorias formam a base da organização das bactérias. A taxonomia de Lineu é o sistema mais conhecido dos biolo gistas. Ela emprega as categorias taxonômicas formais de reino, filo, classe, ordem, família, gênero e espécie. As menores cate gorias são aprovadas por um consenso de especialistas na co munidade científica (Quadro 3.1). Dessas categorias, a família, o genero e a espec1e sao os mais ute1s. A

,

QUADRO 3.1

.

-

*

,

*

Categorias taxonômicas

Categoria formal

Exemplo

Reino

Prokaryotae (Eubacteria)

Divisão

Gracilicutes

Classe

Escotobacteria

Ordem

Eubacteriales

Família

Enterobacteriaceae

Gênero

Escherichia

Espécie

coli

Subtipo

Escherichia coli 01 57:H7

44

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS Crescimento em meio de cultura Os critérios apropriados à classificação das bactérias incluem muitas das propriedades descritas no capítulo anterior. Um desses critérios é o crescimento em meios bacteriológicos. Ao contrário de vírus e de parasitos, muitos patógenos bacterianos podem ser isolados em meios sólidos que contenham ágar. O cultivo geral da maior parte das bactérias requer meio enriqueci do em nutrientes metabólicos. Esses meios geralmente incluem ágar, uma fonte de carbono e um ácido hidrolisado ou enzima ticamente degradado de uma fonte de material biológico (p. ex., caseína). Devido à composição indefinida deste último, esses ti pos de meio são conhecidos como meios complexos. Amostras clínicas de locais normalmente não estéreis (p. ex., a garganta ou o colo) contêm múltiplas espécies de mi crorganismos, inclusive potenciais patógenos da microbiota residente. Os meios podem ser não seletivos ou seletivos e são usados para a distinção entre várias bactérias em uma amostra clínica que contenha muitos microrganismos diferentes.

A. Meios não seletivos O ágar-sangue e o ágar-chocolate são exemplos de meios com plexos, não seletivos, que sustentam o crescimento de diferentes bactérias. Esses meios são destinados ao isolamento de diferen tes espécies tantas quanto possíveis, produzindo inúmeras colô nias bacterianas.

B. Meios seletivos Devido à diversidade de microrganismos que residem em alguns locais de obtenção de amostras (p. ex., a pele, e os tratos intestinal, respiratório e vaginal), os meios seletivos são empregados para eliminar (ou reduzir) um grande número de bactérias contami nantes nessas amostras. A base para um meio seletivo é a incor poração de um agente que iniba especificamente o crescimento de bactérias contaminantes. Exemplos desses agentes são: *

*

*

Azida sódica - seleciona bactérias gram-positivas sobre gram-negativas Sais biliares (desoxicolato de sódio) - seleciona bactérias gram-negativas entéricas e inibe bactérias gram-negativas de mucosas e a maioria das bactérias gram-positivas Colistina e ácido nalidíxico - inibem o crescimento de muitas bactérias gram-negativas

Exemplos de meios seletivos são o ágar de MacConkey (contém bile), que seleciona enterobactérias, e o ágar-sangue CNA (contém colistina e ácido nalidíxico), que seleciona esta filococos e estreptococos.

C. Meios diferenciais Em cultura, algumas bactérias produzem pigmentos caracte rísticos e outros que podem ser diferenciados com base na ex pressão de enzimas extracelulares. A atividade dessas enzimas pode ser detectada como zonas claras circundando colônias crescidas na presença de substratos insolúveis (p. ex., zonas de hemólise em ágar que contenha hemácias). Muitas enterobac térias podem ser diferenciadas com base em sua capacidade de

metabolizar a lactose. Por exemplo, enquanto salmonelas e Shi gelas patogênicas não fermentam lactose, em placas de ágar de MacConkey, formam colônias transparentes, enquanto outras espécies de enterobactérias fermentadoras de lactose (p. ex., E. coli) formam colônias rosas ou vermelhas. O número de meios diferenciais empregados atualmente em laboratórios clínicos está fora do escopo deste capítulo. No entanto, deve-se notar que a identificação bioquímica é uma importante maneira de classificar patógenos microbianos.

Microscopia bacteriana Historicamente, a coloração de Gram, junto com a visualização em microscopia óptica, está entre os métodos mais informativos para a classificação das eubactérias. Essa técnica de coloração amplamente divide as bactérias com base em suas diferenças fundamentais na estrutura de suas paredes celulares (Cap. 2). Em geral, é a primeira etapa na identificação individual de um espécime bacteriano (p. ex., eles são gram-negativos ou gram positivos?) crescido em um meio de cultura ou até diretamente de um material clínico do paciente (p. ex., urina)

Testes bioquímicos

Provas como o teste da oxidase, que usa um aceptor de elétrons artificial, podem ser usadas para distinção de organismos com base na presença ou ausência de uma enzima respiratória, o ci tocromo C, cuja falta diferencia as enterobactérias de outros ba cilos gram-negativos. De modo similar, a atividade da catalase pode ser usada, por exemplo, para a diferenciação entre cocos gram-positivos, as espécies de estaftlococos são catalase positivas enquanto as espécies de estreptococcos são catalase negativas. Se o microrganismo for identificado como catalase positivo (Sta phylococcus spp.), o teste da coagulase pode identificá-lo como Stapylococcus aureus (coagulase positivo) ou Staphylococcus epidermidis (coagulase negativo)*, como demonstrado na Fi gura 3.1. Em última análise, existem muitos exemplos de testes bioquímicos que podem determinar a presença de funções me tabólicas características e ser empregados para agrupar bactérias em um táxon específico. Uma pequena lista dos testes bioquími cos mais comuns está descrita no Quadro 3.2.

Testes imunológicos sorotipos, sorogrupos e sorovares A designação "sero/soro" simplesmente indica o uso de an ticorpos (policlonais ou monoclonais) que reagem com uma estrutura específica da superfície bacteriana, como lipopolis sacarídeos (LPS), flagelos ou antígenos capsulares. Os termos "sorotipo", "sorogrupos" e "sorovares" são, para finalidades práticas, idênticos - todos utilizam a especificidade desses anticorpos para subdividir cepas de uma determinada espécie bacteriana. Como descrito anteriormente, na correlação entre E. coli 0157:H7 e a SHU.

* N. de R.T. Na realidade a prova da coagulase somente diferencia S. au reus (coagulase positivo) de um grupo heterogênio de estaftlococos de nominados de coagulase negativos - CoNS, que inclui, entre outros: S. epidermidis, S. saprophyticus e S. lugdunensis. Para identificação correta de S. epidermidis é necessária uma complexa bateria de testes bioquími cos incluindo, por exemplo, produção de fosfatase, produção de acetoína, produção de urease, entre outros.

CAPÍTULO 3 Classificação das bactérias

QUADRO 3.2

Testes bioquímicos mais comuns usados na diferenciação de bactérias

Cocos gram-positivos Teste da catalase Catalase positiva

1

1

Catalase negativa

Staphy/ococcus

Streptococcus

Teste da coagulase

1

+

S. aureus

45

1

-

Staphylococcus epidermidis

FIGURA 3.1 Diagrama simplificado para diferenciação de cocos gram-positivos.

lnstabil idade genética O valor de um critério taxonômico depende do grupo bioló gico que está sendo comparado. Traços compartilhados por todos ou por nenhum dos membros de um grupo não podem ser usados para distinguir seus membros, mas podem definir um grupo (p. ex., todos os estaftlococos produzem a enzima catalase). Os avanços em biologia molecular hoje possibilitam a investigação do parentesco de genes ou genomas por compa ração de sequências entre diferentes bactérias (Cap. 7). Nesses casos, a instabilidade genética pode fazer com que alguns tra ços sejam altamente variáveis dentro de um grupo biológico ou mesmo dentro de um grupo taxonômico específico. Assim, por exemplo, os genes de resistência a antibióticos ou os genes que codificam enzimas (p. ex., utilização da lactose) podem ser transportados em plasmídeos ou bacteriófagos (Cap. 7), ele mentos genéticos extracromossômicos que podem ser trans feridos entre bactérias não relacionadas ou que podem ser perdidos de um subgrupo de cepas bacterianas idênticas em todos os outros aspectos. Muitos microrganismos são de difí cil cultivo e, nessas instâncias, técnicas que revelam o paren tesco pela análise de hibridização de ácidos nucleicos ou pela sequência de DNA podem ser de especial valor.

SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO Chaves As chaves organizam os traços bacterianos de um modo que possibilita a identificação eficiente dos microrganismos. O sistema ideal deve conter o número mínimo de características necessárias para se estabelecer uma categorização correta. Os grupos são divididos em subgrupos menores baseados na pre sença (+) ou ausência (-) de determinada característica diag nóstica. A continuação desse processo, utilizando-se diferentes características, orienta o pesquisador para o menor subgrupo definido que contém o microrganismo analisado. Nas etapas iniciais desse processo, os microrganismos podem ser dividi dos em subgrupos com base em características que não refle tem qualquer relação genética. Seria perfeitamente razoável, por exemplo, que uma chave para bactérias incluísse um gru po de "bactérias formadoras de pigmentos vermelhos quando

1 . Quebra de carboidratos. A capacidade de produzir metabólitos

ácidos por via fermentativa ou oxidativa, a partir de uma variedade de carboidratos (p. ex., glicose, sacarose e lactose) é usada na identificação da maioria dos grupos bacterianos. Tais testes, embora imperfeitos, têm sido úteis para fins taxonômicos. A identificação por cromatografia gasosa na identificação de ácidos graxos de cadeia curta, produzido na fermentação da glicose também tem sido útil na classificação de diferentes bactérias anaeróbias. 2. Produção de catalase. A enzima catalase catalisa a conversão do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. Quando uma colônia bacteriana é misturada com o peróxido de hidrogênio, a liberação do oxigênio pode ser observada pelo aparecimento de bolhas de gás. O teste é particularmente útil na diferenciação dos estafilococos (positivos) dos estreptococos (negativos), porém também tem aplicação taxonômica para bactérias gram-negativas. 3. Utilização do citrato. Um meio que contenha citrato de sódio como única fonte de carbono, pode ser usado para determinar a capacidade de metabolizar o citrato. As bactérias que crescem nesse meio são classificadas como citrato positivo. 4. Coagulase. A enzima coagulase atua como um fator plasmático, convertendo o fibrinogênio em fibrina. É usado na diferenciação do Staphylococcus aureus de outros estafilococos*. s. Descarboxilases e deaminases. A descarboxilação e a desaminação dos aminoácidos lisina, ornitina e arginina são detectadas pela presença de aminas alcalinas que modificam o pH. Tal modificação pode ser observada pela alteração na cor do meio. Esses testes são utilizados primariamente para identificação de bastonetes g ram-negativos. 6. Sulfeto de hidrogênio. A habilidade de algumas bactérias de produzir H25 a partir de aminoácidos e compostos sufurosos é útil na classificação taxonômica. A coloração negra formada pela interação dos sais de sulfeto com metais pesados tais como o ferro, é utilizada na detecção do H25. 7. lndol. A reação do indol testa a capacidade de um organismo em produzir o indol (benzopirrol) a partir da metabolização do aminoáci do triptofano. O indol é detectado pela formação de uma coloração vermelha após a adição do p-dimetilaminobenzaldeído. O teste de spot pode ser realizado em segundos usando colônias isoladas. 8. Redução do nitrato. Bactérias podem reduzir nitratos por diferentes mecanismos. Essa habilidade é demonstrada pela detecção de nitrito e/ou gás nitrogênio formados nesse processo. 9. Quebra do 0-ortonitrofenil-�o-galactopiranosídeo (ONPG).

O teste de ONPG está relacionado com a fermentação da lactose. As bactérias que possuem a enzima �-galactosidase necessária para fementação da lactose, mas que não apresentam a enzima galactosídeo permease importante para o transporte da lactose para o citoplasma bacteriano, são ONPG positivas e geralmente lactose negativas ou lactose tardias. 1 O. Produção de oxidase. Os testes de oxidase detectam o componente cdo complexo citocromo-oxidase. O reagente utilizado muda de transparente para colorido, quando convertido de sua forma reduzida para o estado oxidado. A reação de oxidase é comumente demonstrada em teste de spot utilizando colônias isoladas. 1 1 . Produção de proteinase. A atividade proteolítica é detectada pelo crescimento do microrganismo na presença de substratos, tais como gelatina e gema de ovo. 12. Produção de urease. A urease hidrolisa a urea em duas moléculas de amônia e C02* Essa reação pode ser detectada pelo aumento do pH no meio causado pela produção de amônia. Espécies urease positivas variam a concentração da enzima produzida. Bactérias podem ser assim classificadas como positivas, fraca-positivas e negativas. 13. Test de Voges-Proskauer. O teste de Voges-Proskauer detecta o acetilmetilcarbinol (acetoína), um produto intermediário da fermentação da glicose pela via butilenoglicol. * N. de R.T. Amostras de Staphylococcus sch/eiferi subespécie sch/eiferi, têm sido isoladas

de diferentes infecções humanas e se mostram positivas tanto para o fator de agre gação quanto para a coagulase em tubo. Essas amostras podem ser diferenciadas de S. aureus pela ausência de produção de ácido a partir de maltose, manitol e sacarose. Copyright © The McGraw-Hill Companies. {Reproduzido, com autorização, de Ryan KJ, Ray CG {editors): Sherris Medical Microbio/ogy, Sth ed. McGraw-Hill, 2010.)

46

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

propagadas em um meio definido", embora tal procedimento fosse incluir formas não relacionadas, como a Serratia marces cens (Cap. 15) e bactérias fotossintéticas purpúreas (Cap. 6). Esses dois agrupamentos de bactérias desiguais ocupam nichos distintos e dependem de formas totalmente diferentes de meta bolismo energético. Não obstante, o agrupamento preliminar dos referidos conjuntos seria útil, pois poderia possibilitar ao pesquisador a imediata identificação de uma cultura com pig mentação vermelha, limitando a margem de possibilidades a um número relativamente pequeno de grupos.

Taxonomia numérica A taxonomia numérica (também definida como fenética ou ta xometria) passou a ser amplamente utilizada na década de 1970. Esses esquemas de classificação numérica utilizam um número (frequentemente maior que 100) de características não pondera das e taxonomicamente úteis. O Índice de Perfil Analítico (IPA/ API™) é um método geralmente usado para identificar uma ampla variedade de microrganismos. Esses testes (API) consis tem em um número de tiras plásticas, cada qual com cerca de 20 compartimentos em miniatura, contendo reagentes bioquí micos. Quase todos os grupos bacterianos cultiváveis e mais de 550 diferentes espécies podem ser identificados com a utilização dos resultados desses testes API. Estes sistemas de identificação possuem um grande banco de dados de reações bioquímicas mi crobianas. Os agrupamentos numéricos derivados desses testes identificam diferentes cepas de um nível de seleção a partir da similaridade total (geralmente > 80% ao nível de espécie) com base na frequência com que esses traços são partilhados. Além disso, a classificação numérica fornece percentuais de frequência de caracteres positivos para todas as cepas dentro de cada agrupa mento. A limitação desta estratégia é que se trata de um sistema estático, que não permite a avaliação da evolução bacteriana e a descoberta regular de novos patógenos bacterianos (Fig. 3.2).

Classificações filogenéticas: em busca de uma compreensão das relações evolutivas entre as bactérias As classificações filogenéticas constituem medidas entre dois microrganismos e implicam que ambos tenham o mesmo an cestral. O registro de fósseis possibilitou que a formulação dessas deduções se tornasse relativamente fácil para muitos dos repre sentantes dos reinos vegetal e animal. Entretanto, tal tipo de re gistro não existe para as bactérias e, na ausência de evidências moleculares, pode ser difícil estabelecer uma distinção entre a evolução convergente e a divergente para traços bacterianos.

As propriedades genéticas das bactérias possibilitam a tro ca de genes entre microrganismos remotamente relacionados. Além disso, a multiplicação das bactérias é quase totalmente ve getativa, e seus mecanismos de troca genética raras vezes envol vem uma recombinação entre grandes porções de seus genomas (Cap. 7). Por conseguinte, o conceito de espécie - a unidade fundamental da filogenia dos eucariotos - tem um significado totalmente diferente quando aplicado às bactérias. Uma espécie eucariótica refere-se a um grupo biológico capaz de se repro duzir, com a intenção de produzir uma prole variável. Como as bactérias replicam-se de maneira clonal por fissão binária, elas não necessitam de um grupo complementar de cromossomos para se reproduzir. Por conseguinte, a definição de uma espécie bacteriana é necessariamente pragmática e operacionalmente definida. Para as finalidades de categorização de bactérias, uma espécie é uma categoria que circunscreve um grupo genomica mente coerente de indivíduos isolados ou cepas que compar tilhem um alto grau de similaridade em muitas características independentes, quando testadas de modo comparável e em condições altamente padronizadas. A decisão de reunir grupos de microrganismos como determinada espécie bacteriana é do taxonomista, que pode escolher subdividir o grupo em biotipos e reunir espécies dentro de gêneros. Também é possível pro por agrupamentos mais amplos, como as famílias. No Qua dro 3.1 fornecemos as categorias formais usadas na taxonomia de bactérias. Para fins práticos, apenas as divisões de família, gênero e espécie são comumente utilizadas. Existe considerável diversidade genética entre as bactérias. A caracterização química do DNA genômico bacteriano reve la ampla variedade de composições de bases de nucleotídeos entre diferentes cepas bacterianas. O conteúdo de guanina + citosina (G + C) em bactérias próximas é similar, indicando que é possível empregar o parentesco genético do DNA de or ganismos semelhantes para medir a relação taxonômica. O pa râmetro de similaridade DNA-DNA baseado na diferença do ponto de desnaturação térmica tem sido um método impreciso empregado para o delineamento de espécies. Um método mais preciso é o sequenciamento do DNA. Este método tornou-se um procedimento de rotina e a com paração das sequências do DNA de genes divergentes pode fornecer uma medida de sua relação. Os genes para diversas funções, tais como os que codificam antígenos de superfície para evasão do sistema imunológico, divergem a diferentes taxas em relação a genes constitutivos (housekeeping), como os que codificam citocromos. Assim, as diferenças na sequên cia do DNA entre genes rapidamente divergentes podem ser utilizadas para se estabelecer a distância genética de grupos de bactérias estreitamente relacionados, enquanto as diferenças

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FIGURA 3.2 O teste API™ demonstrando como as bactérias podem ser diferenciadas usando uma série de testes bioquímicos. Cada comparti mento pequeno contém um pó desidratado de um teste bioquímico, em que uma cultura bacteriana é inoculada. Após incubação, as mudanças colorimétricas podem ser pontuadas numericamente, produzindo um número que corresponde a uma espécie bacteriana específica e ao gênero. (Cortesia da bioMerieux, lnc.)

CAPÍTULO 3 Classificação das bactérias

QUADRO 3.3

Principais categorias e grupos de bactérias que causam doenças em seres humanos segundo o esquema de identificação do Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9ª edição Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology

1. Eubactérias gram-negativas que possuem parede celular Grupo 1 : Espiroquetas

Grupo 2: Bactérias gram-negativas aeróbias/microaerofílicas, móveis, helicoidais/vibrioides Grupo 3: Bactérias curvas, imóveis (ou raramente móveis) Grupo 4: Cocos e bastonetes gram-negativos aeróbios/microaerofílicos

Grupo 5: Bastonetes gram-negativos anaeróbios facultativos

Grupo 6: Bastonetes gram-negativos anaeróbios, retos, curvos e helicoidais Grupo 7: Bactérias dissimuladoras redutoras de enxofre ou sulfato Grupo 8: Cocos gram-negativos anaeróbios Grupo 9: Riquétsias e clamídias Grupo 1 O: Bactérias fototróficas anoxigênicas Grupo 1 1 : Bactérias fototróficas oxigênicas Grupo 12: Bactérias aeróbias quimiolitotróficas e organismos variados Grupo 13: Bactérias com apêndices ou brotamentos Grupo 14: Bactérias com bainha Grupo 15: Bactérias não fotossintéticas, não frutificadas, deslizantes Grupo 16: Bactérias frutificadas deslizantes: mixobactérias li. Bactérias gram-positivas que possuem parede celular Grupo 17: Cocos gram-positivos

Grupo 18: Bastonetes e cocos gram-positivos formadores de endósporos Grupo 19: Bastonetes gram-positivos regulares, não formadores de esporos Grupo 20: Bastonetes gram-positivos irregulares, não formadores de esporos Grupo 21: Micobactérias Grupos 22 a 29: Actinomicetos

Ili. Eubactérias desprovidas de parede celular: micoplasmas ou Mollicutes Grupo 30: Micoplasmas IV. Arqueobactérias Grupo 31: Metanógenos Grupo 32: Arqueobactérias redutoras de sulfato Grupo 33: Arqueobactérias halofílicas extremófilas Grupo 34: Arqueobactérias desprovidas de parede celular Grupo 35: Bactérias termofílicas extremas e hipertermofílicas metabolizadoras de enxofre

Treponema Borre/ia Leptospira Campylobacter Helicobacter Spirillum

Nenhuma Alcaligenes Bordetella Bruce/la Francisella Legionella Moraxella Neisseria Pseudomonas Rochalimaea Bacteroides (algumas espécies) Escherichia (e bactérias coliformes relacionadas) Klebsiella Proteus Providencia Salmonella Shigella Yersinia Vibrio Haemophilus Pasteurella Bacteroides Fusobacterium Prevotel/a Nenhuma Nenhuma Rickettsia Coxiella Chlamydia Nenhuma Nenhuma Nenhuma Nenhuma Nenhuma Capnocytophaga Nenhuma Enterococcus Peptostreptococcus Staphy/ococcus Streptococcus Bacillus Clostridium Erysipelothrix Listeria Actinomyces Corynebacterium Mobiluncus Mycobacterium Nocardia Streptomyces Rhodococcus Mycoplasma Ureaplasma

Nenhuma Nenhuma Nenhuma Nenhuma Nenhuma

47

48

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

Bactéria

Archaea

Espiroquetas

Bactérias verdes filamentosas

Methanobacterium

-

positivas

Bacteroides Cytophaga Thermotoga Aquifex

Halófilos

Animais Fungos

�-- Plantas

Methanococcus

Cianobactérias Planctomyces

Entamoebae

Mixomicetos

Methanosarcina

g ram

Proteobactérias

Eucarya

T. celer

Ciliados Flagelados

Thermoproteus Pyrodicticum

Tricomônades Microsporídeos

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Diplomônades

FIGURA 3.3 Arvore filogenética baseada em dados do rRNA, mostrando a separação das famílias das bactérias, das arqueas e dos eucariotos. Os grupos das principais bactérias patogênicas conhecidas são indicados na área em cinza. O único grupo de bactérias patogênicas que não está agrupado nessa área sombreada é o grupo Bacteroides.

de sequência entre genes constitutivos (housekeeping) podem ser utilizadas para medir a relação de grupos amplamente di vergentes de bactérias.

RNA ribossômico Os ribossomos desempenham papel essencial na síntese pro teica para todos os organismos. Sequências genéticas que codificam tanto o RNA ribossômico (rRNA) quanto as proteí nas (ambos são necessários para a inclusão de um ribossomo funcional) foram altamente conservadas em toda a evolução e divergiram mais lentamente do que outros genes cromossô micos. A comparação da sequência de nucleotídeos do RNA ribossômico 16S de uma variedade de fontes procarióticas re velou a existência de relações evolutivas entre microrganismos amplamente divergentes e levou à elucidação de um novo rei no, o das Arqueobactérias. A árvore filogenética baseada nos dados do RNA ribossômico (rRNA), mostrando a separação entre bactéria, arquea e famílias eucariotas, está representada na Figura 3.3, que mostra os três principais domínios da vida biológica tal como os conhecemos atualmente. A partir desse diagrama, dois Reinos - as Eubactérias (bactérias verdadeiras) e as Arqueobactérias - são distintos do ramo dos Eucariotos.

of Determinative Bacteriology, serve para auxiliar na identifica ção das bactérias descritas e cultivadas. As principais bactérias que causam doenças infecciosas, tal como são classificadas no Bergey's Manual, estão listadas no Quadro 3.3. Devido à proba bilidade de surgirem informações sobre relações filogenéticas que irão resultar em modificações adicionais na organização dos grupos bacterianos no Bergey's Manual, suas designações devem ser consideradas um trabalho em andamento. Conforme discutido no Capítulo 2, existem dois grupos diferentes de procariotos, as eubactérias e as arqueobactérias. Ambas são pequenos organismos unicelulares que se replicam sexualmente. Eubactérias referem-se às bactérias clássicas tal como a ciência as conhece historicamente. Não possuem um núcleo verdadeiro, possuem lipídeos característicos que cons tituem suas membranas, são dotadas de parede celular com posta por peptidoglicano e dispõem de um mecanismo para síntese de proteínas e ácidos nucleicos que podem ser inibidos seletivamente por agentes antimicrobianos. Em contraste, as arqueobactérias não possuem uma parede celular clássica, com peptidoglicano, e apresentam muitas características (p. ex., me canismo de síntese proteica e de replicação de ácido nucleico ), que são similares às das células eucarióticas (Quadro 3.4).

Eu bactérias DESCRIÇÃO DAS PRINCIPAIS CATEGORIAS E GRUPOS DE BACTÉRIAS Manual de bacteriologia sistemática de Bergey O trabalho definitivo em termos de organização taxonômica de bactérias é a última edição do Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Publicado pela primeira vez em 1923. Esta publica ção classifica, usando chaves taxonômicas, bactérias conhecidas, cultiváveis ou não. Um volume suplementar, o Bergey's Manual

A. Eubactérias gram-negativas

Trata-se de um grupo heterogêneo de bactérias que possuem um complexo envelope celular (do tipo gram-negativo) cons tituído de membrana externa, espaço periplasmático contendo uma camada interna delgada de peptidoglicano (que contém ácido murâmico) e membrana citoplasmática. A forma da cé lula (Fig. 3.4) pode ser esférica, oval, em bastonete reto ou cur vo, helicoidal ou filamentosa; algumas dessas formas podem apresentar bainha ou ser encapsuladas. A reprodução é feita por divisão binária, porém alguns grupos se reproduzem por

CAPÍTULO 3 Classificação das bactérias

QUADRO 3.4

49

Principais características partilhadas por arqueobactérias e células eucarióticas que estão ausentes

em eubadérias Característica

Eubactérias

Arqueobactérias, Eucariotos

Fator de elongação 2 (EF-2) contém o aminoácido diftamina e é, portanto, ADP-ribosilável pela toxina diftérica

Não

Sim

O iniciador metionil tRNA não é formilado

Não

Sim

Alguns genes tRNA contêm íntrons

Não

Sim, em eucariotos

A síntese proteica é inibida por anisomicina, mas não por cloranfenicol

Não

Sim

RNA polimerases dependentes de DNA são enzimas multicomponentes insensíveis aos antimicrobianos rifampicina e estreptomicina

Não

Sim

RNA polimerases dependentes de DNA são enzimas multicomponentes e são insensíveis aos antibióticos rifampicina e estreptolidigina

Não

Sim

brotamento. As mixobactérias podem formar corpos frutífe ros e mixósporos. A motilidade, quando presente, é realizada por meio de flagelos ou por deslizamento. Os membros dessa categoria podem ser bactérias fototróficas ou não fototróficas (Cap. 5) e incluir espécies aeróbias, anaeróbias, anaeróbias facultativas e microaerofilicas.

e esporogêneas simples, bem como actinomicetos estrutural mente complexos e formas correlatas.

C. Eubactérias desprovidas de parede celular Trata-se de microrganismos que carecem de parede celular (comumente denominados micoplasmas, compreendendo a classe Mollicutes) e que não sintetizam os precursores do pep tidoglicano. Delimitados por uma membrana, a membrana plasmática (Fig. 3.5). Assemelham-se às formas L, que podem ser produzidas por muitas espécies de bactérias (notadamen te as eubactérias gram-positivas); todavia, diferentemente das formas L, os micoplasmas nunca sofrem reversão para o estado dotado de parede celular, e não existe relação antigênica entre os micoplasmas e as formas L eubacterianas. Seis gêneros foram classificados como micoplasmas com base no seu habitat; entretanto, apenas dois contêm patógenos de animais. Os micoplasmas são microrganismos altamente pleomórficos cujo tamanho varia de formas vesiculares a for mas filtráveis muito pequenas (0,2 µm) (são muito pequenos para serem capturados em filtros que rotineiramente retêm a maior parte das bactérias). A reprodução pode ocorrer por brotamento, fragmentação ou divisão binária, isoladamente ou em combinação. A maio ria das espécies necessita de um meio de cultura complexo para

B. Eubactérias gram-positivas Essas bactérias possuem uma parede celular do tipo gram-po sitiva; em geral, mas nem sempre, as células exibem coloração Gram-positiva. O envelope dos organismos gram-positivos consiste em uma espessa parede celular que determina a forma celular e uma membrana citoplasmática. Essas células podem ser encapsuladas e podem exibir motilidade mediada por flage los. As células podem ser esféricas, em forma de bastonete ou filamentos. Os bastonetes e filamentos podem não ser ramifi cados ou exibir uma verdadeira ramificação. Em geral, a repro dução é feita por divisão binária. Algumas bactérias incluídas nessa categoria produzem esporos (p. ex., Bacillus e espécies Clostridium) como formas de latência que são altamente resis tentes a desinfecção. Em geral, as eubactérias gram-positivas são heterótrofas quimiossintéticas (Cap. 5) e incluem espé cies aeróbias, anaeróbias e anaeróbias facultativas. Os grupos que compõem essa categoria incluem bactérias asporogêneas 11.

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FIGURA 3.4 As formas celulares que ocorrem entre bactérias unicelulares verdadeiras. (A) Coco. (8) Bastonete. (C) Espiroqueta. (Contraste de fase, ampliada 1.500 vezes.) (Reproduzida, com autorização, de Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA. The Microbial World, 3rd ed. Copyright © 1970. Com autorização, de Prentice- Hall, lnc., Englewood Cliffs, NJ.)

50

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia uma diversidade de formas, como formas esféricas, espirala das, em placas ou em bastonetes; além disso, ocorrem formas unicelulares e multicelulares, em filamentos ou agregados. A multiplicação ocorre por divisão binária, brotamento, constri ção, fragmentação ou por outros mecanismos desconhecidos.

SUBTIPAGEM E SUA APLICAÇÃO

FIGURA 3.5 Micrografia eletrônica de células de um membro do grupo dos micoplasmas, o agente da broncopneumonia no rato (am pliada 1 .960 vezes). (Reproduzida, com autorização, de Klieneberger Nobel E, Cuckow FW: A study of organisms of the pleuropneumonia group by electron microscopy. J Gen Microbiol 1955;1 2:99.)

Em certas circunstâncias (como em caso de epidemia), é im portante distinguir entre cepas de determinada espécie ou iden tificar uma cepa em particular. Este processo é denominado subtipagem e consiste no exame de bactérias isoladas à procura de características que permitam uma discriminação abaixo do nível de espécie. Classicamente, a subtipagem é efetuada por bio tipagem, sorotipagem, teste de suscetibilidade a antimicrobianos e fagotipagem. Por exemplo, foram identificados mais de 130 so rogrupos de Vibrio cholerae com base em diferenças antigênicas no polissacarídeo O de seu LPS; entretanto, apenas os sorogru pos 01 e 0139 estão associados à cólera pandêmica e epidêmica, respectivamente. Dentro desses sorogrupos, apenas as cepas que produzem um pilus particular em forma de feixe e a toxina da cólera são virulentas e provocam cólera. Contudo, cepas O 1 não toxigênicas de V. cholerae, não associadas à cólera epidêmica, também foram isoladas de amostras do ambiente, de alimentos e de pacientes com diarreia esporádica.

Tipagem sorológica crescer e tende a formar colônias características em forma de"ovo frito" em meio sólido. Uma característica peculiar dos Mollicutes é que alguns gêneros necessitam de colesterol para crescerem; o colesterol não esterificado, quando presente, constitui um com ponente único das membranas tanto de espécies que necessitam quanto de espécies que não necessitam de esterol.

Arqueobactérias Esses microrganismos habitam predominantemente em am bientes terrestres e aquáticos de condições extremas (elevado teor de sal, altas temperaturas, anaeróbios) e são frequentemente denominados "extremófilos"; alguns são simbiontes no trato di gestório humano e de animais. As arqueobactérias consistem em microrganismos aeróbios, anaeróbios e anaeróbios facultativos que são quimiolitotróficos, heterotróficos ou heterotróficos facultativos. Algumas espécies são mesofílicas, enquanto outras são capazes de crescer a temperaturas superiores a lOOºC. Tais arqueobactérias hipertermofílicas são peculiarmente adaptadas ao crescimento em altas temperaturas. Com poucas exceções, as enzimas isoladas desses microrganismos são intrinsecamente mais termoestáveis do que as enzimas correspondentes encon tradas nos microrganismos mesofílicos. Algumas dessas enzimas termoestáveis, como a DNA polimerase do Thermus aquaticus (Taq polimerase), são um importante componente dos métodos de amplificação do DNA, tais como a reação em cadeia da poli merase (PCR, na sigla em inglês). As arqueobactérias podem ser diferenciadas das eubactérias em parte pela ausência de parede celular com peptidoglicano, presença de lipídeos diéter isoprenoide ou tetraéter diglicerol, e sequências características do RNA ribossômico. As arqueobac térias também compartilham algumas características molecu lares com as eubactérias (Quadro 3.4). As células podem exibir

A clonalidade em termos de microrganismos isolados de um surto de origem comum (fonte pontual de disseminação) constitui um importante conceito na epidemiologia das doen ças infecciosas. Agentes etiológicos associados a esses surtos de infecções são geralmente clonais; em outras palavras, consti tuem a progênie de uma única célula e, portanto, para todos os fins práticos, são geneticamente idênticos. Assim, a subti pagem desempenha importante papel na discriminação desses microrganismos. Avanços recentes, obtidos em biotecnologia, melhoraram notavelmente nossa capacidade de subtipar mi crorganismos. A tecnologia do hibridoma resultou no desen volvimento de anticorpos monoclonais contra antígenos de superfície celular que têm sido utilizados para criar sistemas de subtipagem altamente padronizados, que descrevem sorotipos bacterianos. Esta é uma importante ferramenta para definição da disseminação epidemiológica de uma infecção bacteriana. Outros microrganismos não podem ser identificados como sorotipos únicos. Por exemplo, alguns patógenos (Neisseria gonorrhoeae) são transmitidos como um inóculo composto de quasiespécies (que significa que existe uma extensa varia ção antigênica entre as bactérias presentes no inóculo). Nesses casos, grupos de hibridomas que reconhecem variantes dos microrganismos originais são empregados para categorizar so rovariantes ou sorovares.

Genotipagem A genotipagem por eletroforese de enzimas multilocal (MLEE, na sigla em inglês), o método-padrão para a pesquisa genética da população eucariótica, também foi utilizada para estudo da di versidade genética e da estrutura clonal dos microrganismos pa togênicos. A MLEE envolve a determinação das mobilidades de um conjunto de enzimas solúveis (em geral, 15 a 25 enzimas) por

CAPÍTULO 3 Classificação das bactérias

51

eletroforese em gel de amido. Como a velocidade de migração de

com endonucleases de restrição e, em seguida, a comparação

uma proteína durante a eletroforese e a sua carga eletrostática

do número e do tamanho dos fragmentos de restrição resul

efetiva são determinadas pela sequência de seus aminoácidos,

tantes frequentemente fornecem informações adicionais úteis.

as variantes de mobilidade (conhecidas como

eletromorfos ou

A análise dos plasmídeos mostrou-se extremamente útil para o

alozimas) de uma enzima refletem as substituições de aminoá

estudo de surtos restritos no tempo e no espaço (p. ex., surto

cidos na sequência proteica, que reflete alterações na sequência

em um hospital), particularmente quando é combinada com

do DNA que codifica a proteína. Os genes estruturais que codifi

outros métodos de identificação.

nética; todavia, ao utilizar a MLEE, os pesquisadores dos Centers

Análise de endonucleases de restrição

cam enzimas na Escherichia

coli exibem extensa diversidade ge

for Disease Control and Prevention verificaram que as cepas de

E. coli do

sorotipo 0157:H7 descendiam de um clone ampla

mente distribuído na América do Norte.

O uso de enzimas de restrição para a clivagem do DNA em frag mentos distintos constitui um dos procedimentos mais básicos em biologia molecular. As endonucleases de restrição reconhe cem sequências curtas de DNA (sequências de restrição) e cli

Fingerprint* químico

vam o DNA de filamento duplo no interior dessa sequência ou

A caracterização ou a identificação de isolados tem sido aperfei

adjacente a ela. As sequências de restrição, cujo comprimento

çoada pela aplicação de métodos físicos para as células procarió

varia de quatro a mais de 12 bases, ocorrem em todo o cromos

ticas, tais como a espectroscopia infravermelha transformada de

somo bacteriano. As enzimas de restrição que reconhecem se

Fourier (FTIR), a espectroscopia de pirólise de massa e a ioniza

quências curtas (p. ex., quatro pares de base) ocorrem com maior

laser com tempo de fuga (Maldi/Tof)

frequência do que as que reconhecem sequências longas (p. ex.,

ou a espectroscopia de massa por ionização. O equipamento ne

12 pares de base). Por conseguinte, as enzimas que reconhecem as

cessário para aplicação dessas técnicas poderosas é caro e não

sequências curtas de DNA produzem mais fragmentos do que as

está disponível na rotina dos laboratórios clínicos**.

enzimas que reconhecem sequências de restrição longas. Vários

ção/dessorção assistida a

métodos de subtipagem empregam o DNA digerido por endo

TAXONOMIA BASEADA EM ÁCIDOS NUCLEICOS Desde 1975, os desenvolvimentos no isolamento, na amplifica ção e na determinação da sequência dos ácidos nucleicos estimu laram a evolução de sistemas de subtipagem baseados em ácidos nucleicos. Esses sistemas incluem a análise do perfil de plasmí deos; análise da endonuclease de restrição; ribotipagem, eletrofo rese em gel de campo pulsado; amplificação com PCR e digestão de genes específicos com a endonuclease de restrição; AP-PCR (PCR com sequências iniciadoras escolhidas de maneira arbitrá ria); bem como análise da sequência de ácidos nucleicos.

Análise de plasmídeos A análise do perfil de plasmídeos foi a primeira técnica, e a mais simples, baseada no DNA aplicada a estudos epidemio lógicos. Os plasmídeos, elementos genéticos extracromossô micos (Cap. 7), são isolados de cada bactéria e, em seguida, separados por eletroforese em gel de agarose para determinar seu número e tamanho. Entretanto, muitas bactérias podem apresentar plasmídeos de tamanho idêntico, porém com dife rentes sequências. Por conseguinte, a digestão dos plasmídeos * N. de R.T. O termo fingerprint é utilizado para designar métodos ana

líticos capazes de detectar diferenças sutis entre compostos similares. ** N. de R.T. A rápida identificação de microrganismos, com base na tec nologia MALDI-TOF é alcançada através da obtenção de espectros e os comparando a um banco de dados. Os picos dos espectros obtidos são comparados com o padrão característico de uma espécie, gênero, ou fa mília de microrganismos, resultando assim na identificação do organis mo. Após a cultura os isolados são simultaneamente preparados para o MALDI-TOF e para outro aparelho automatizado de identificação e teste de sensibilidade a antimicrobianos. Em cerca de dois minutos, a identifi cação do organismo é obtida. As n i formações podem ser m i ediatamente transmitidas ao médico como auxílio ao diagnóstico. Os resultados dos testes de sensibilidade podem estar disponíveis em menos de cinco horas, dependendo do aparelho auxiliar utilizado. Atualmente alguns laborató rios no Brasil estão testando essa metodologia.

nucleases de restrição. O método básico consiste na digestão do DNA com uma enzima capaz de reconhecer um local de restri ção de ocorrência frequente, com separação de fragmentos, cujo comprimento em geral varia de 0,5 a 50 kb, por eletroforese em gel de agarose seguida de visualização sob luz ultravioleta após coloração com brometo de etídio. Uma das principais limitações dessa técnica é a dificuldade de interpretação dos perfis comple xos constituídos de centenas de bandas que podem apresentar má resolução e sobrepor-se. Este problema foi solucionado com o uso de endonucleases de restrição que efetuam clivagens em locais de restrição de ocorrência rara. Em geral, a digestão do DNA com tais enzimas resulta em cinco a 20 fragmentos, cujo comprimento varia de cerca de 10 a 800 kb. A separação desses grandes fragmentos de DNA é efetuada por uma técnica deno minada eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE, na sigla em inglês), que exige equipamento especializado. Teoricamente, todas as bactérias isoladas podem ser tipadas por esse método. Sua vantagem é que o perfil de restrição consiste em poucas ban das de boa resolução representando todo o cromossomo bacte riano em um único gel.

Análise por Southern blot Esta análise foi assim denominada em homenagem ao seu inventor, Edwin Mellor Southern, e tem sido utilizada como método de subtipagem para identificação de microrganismos isolados associados a surtos. Para essa análise, as preparações

de DNA de isolados bacterianos são submetidas à digestão por endonucleases de restrição. Após eletroforese em gel de agaro se, os fragmentos de restrição separados são transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. Esses fragmentos de DNA de fita dupla são primeiramente convertidos em se quências lineares de fita simples. Com a utilização de um frag mento marcado de DNA como sonda, é possível identificar os fragmentos de restrição que contêm sequências

(Zoei) homólo

gas à sonda por complementação com os fragmentos ligados à fita simples (Fig. 3.6). Os polimorfismos do comprimento dos

52

SEÇÃO 1 Fu nda m entos da Microbiologia

Enzimas de restrição

1) Digestão do DNA com o uso de enzimas de restrição 2) Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose

Gel de agarose

Membrana de náilon

3) Fragmentos separados são transferidos para uma membrana de náilon

" J � Sonda de DNA marcado Filme de detecção

4) Sonda de DNA marcado hibridiza com o DNA ligado à membrana de náilon

5) Detecção do fragmento marcado

FIGURA 3.6 Análise por Southern blot mostrando como toei específicos em fragmentos de DNA separados podem ser detectados com uma son da de DNA marcado. Este procedimento possibilita, em essência, a discriminação do DNA em três níveis: (1) no nível de reconhecimento por enzima de restrição, (2) pelo tamanho do fragmento de DNA, e (3) pela hibridização de uma sonda de DNA a um locus específico definido por uma banda específica, em uma posição específica da membrana.

fragmentos de restrição (RFLP, na sigla em inglês) referem-se às variações tanto no número de Zoei homólogos com a sonda quanto nos locais de restrição no interior desses Zoei ou adja centes a eles.

Ribotipagem Este método utiliza a análise por Southern bZotpara detectar poli morfismos de genes de rRNA encontrados em todas as bactérias. Como as sequências ribossômicas são altamente conserva das, podem ser detectadas com uma sonda comum preparada a partir do rRNA 16S e 23S de uma eubactéria, E. eoZi. Muitos

microrganismos possuem várias cópias (5 a 7) desses genes, re sultando em padrões com um número suficiente de bandas para proporcionar um poder de discriminação satisfatório; entretan to, a ribotipagem é de valor limitado para alguns microrganis mos, tais como as micobactérias, que só possuem uma cópia de tais genes.

Sequências repetitivas Na era atual da genômica na medicina molecular, centenas de genomas microbianos têm sido sequenciados. Com esta era, surgiram as ferramentas de bioinformática, para explorar essa

CAPÍTULO 3 Classificação das bactérias riqueza de informações sobre as sequências de DNA na iden tificação de novos alvos para subtipar patógenos, tais como as sequências repetitivas encontradas em diferentes espécies (Cap. 7). Essas sequências repetitivas foram chamadas de DNA satélite e possuem unidades repetitivas que variam de 10 pb (pares de base) a 100 pb. Em geral são chamadas de sequências repetidas de número variável (VNTR de variable number tandem repeats). As VNTR foram encontradas em regiões que controlam a expressão gênica de dentro de fases abertas de leitura. A unidade repetida e o número de cópias repetidas lado a lado definem cada locus VNTR. Uma estratégia de ge notipagem que emprega PCR, citada como análise VNTR de múltiplos locus (MLVA, de multiple-locus VNTR analysis), tem como vantagem os níveis de diversidade gerados pelo tamanho das unidades repetidas e pela variação do número de cópias em um número conhecido de Zoei. Essa técnica mostra-se espe cialmente útil na subtipagem de espécies monomórficas, como Bacillus anthracis, Yersinia pestis e Francisella tularensis.

Microbiologia forense Os métodos de genotipagem estão progredindo em direção à identificação de polimorfismos de um único gene em fases abertas de leitura e regiões intergênicas para responder a uma grande variedade de questões de epidemiologia e evolução. O campo da microbiologia forense desenvolveu-se na onda dos ataques bioterroristas com esporos de Bacillus anthracis (an traz ou carbúnculo) no outono de 2001 nos EUA. A micro biologia forense foi parte da investigação criminal usada para identificação exata de cepas e subcepas do microrganismo usa do nesse crime de bioterrorismo.

53

em muito o número de organismos cultiváveis (Quadro 3.5). Entretanto, estimativas mais recentes sugerem que o total de espécies bacterianas no mundo situa-se entre 107 e 109* Até re centemente, a identificação microbiana exigia o isolamento de culturas puras seguido de testes para inúmeros traços fisioló gicos e bioquímicos. Os médicos já estão familiarizados com as doenças humanas associadas a microrganismos visíveis, porém não cultiváveis. Na atualidade os cientistas estão utili zando uma abordagem auxiliada pela PCR, utilizando o rRNA para a identificação de microrganismos patogênicos in situ. A primeira fase dessa abordagem envolve a extração do DNA de uma amostra apropriada, o uso de técnicas moleculares padro nizadas para se obter uma "biblioteca" de clones, a recuperação da informação de sequências do rDNA e a análise compara tiva das sequências recuperadas. Todos esses dados fornecem informações sobre a identidade ou relação das sequências em comparação com a base de dados disponíveis. Na segunda fase, a prova de que as sequências provêm de células da amostra ori ginal é obtida por hibridização in situ, utilizando-se sondas es pecíficas para sequências. Essa abordagem vem sendo utilizada na identificação de microrganismos patogênicos. Por exemplo, um patógeno previamente não caracterizado foi identificado como a bactéria, em forma de bastonete, associada à doença de Whipple, atualmente designado Tropheryma whipplei. A abordagem com o rRNA também foi utilizada para identificar o agente etiológico da angiomatose bacilar como Bartonella henselae e mostrar que o patógeno oportunista Pneumocystis jiroveci é um fungo. Indubitavelmente esta e outras técnicas irão identificar outros agentes etiológicos no futuro.

OBJETIVOS MÉTODOS PARA A IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS SEM O USO DE CULTURAS As tentativas de estimar o número total de bactérias, arqueo bactérias e vírus são problemáticas devido a dificuldades como detecção e recuperação do meio ambiente, ou conhecimento incompleto de associações microbianas obrigatórias, e o pro blema do conceito de espécie nesses grupos. Contudo, estimati vas indicam que o número de micróbios não cultiváveis excede

1. Compreender como o vocabulário taxonômico é crítico na comunicação científica no campo das doenças infecciosas. 2. Como a taxonomia classifica. 3. Compreender as características de crescimento, bioquími cos e genéticos, que são usadas na identificação bacteriana. 4. Entender as diferenças entre eubactéria, arqueobactéria e eucariontes. 5. Entender como as diferentes técnicas moleculares podem auxiliar na taxonomia.

QUESTÕES DE REVISÃO QUADRO 3.5

Números estimados e conhecidos das espécies biológicasª Espécies conhecidas

Total de . espec1es estimadas

Vírus

5.000

1 30.000

4

Bactérias

4.760

40.000

12

Fungos

69.000

1 .500.000

5

Algas

40.000

60.000

67

Protozoários

30.800

100.000

31

Grupo

,

Porcentagem de espécies conhecidas

ª Reproduzido, com autorização, de Annual Reviews, lnc., from Buli AT et ai.: Biodiversity as a source of innovation in biotechnology. Ann RevMicrobiol 1992;46:219. Permission comveyed through Copyright Clearance Center, lnc.

1. As eubactérias desprovidas de parede celular e que não sinteti zam precursores do peptidoglicano são chamadas: (A) (B) (C) (D) (E)

Bactérias gram-negativas Vírus Micoplasmas Sorovares variantes Bacilos

2. As arqueobactérias podem ser distinguidas das eubactérias pela ausência de: (A) (B) (C) (D) (E)

DNA RNA Ribossomos Peptidoglicano Núcleo

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

54

3. Um paciente de 16 anos é admitido no hospital com fibrose cís tica. Uma cultura de escarro indica Burkholderia cepacia. Poste riormente, surgem dois outros pacientes com bacteriemia por B. cepacia, e o organismo é cultivado a partir do escarro de outros quatro pacientes. Durante esse surto hospitalar por B. cepacia, 50 isolados do ambiente e de sete pacientes estão sendo subtipa dos para identificação da origem do surto. Qual das seguintes técnicas pode ser a melhor nessa tentativa? (A) (B) (C) (D) (E)

Cultura Ribotipagem Sequenciamento do rRNA 16S Teste de sensibilidade aos antimicrobianos Sequenciamento dos ácidos nucleicos

4. Um microrganismo gram-positivo não cultivável foi identificado em amostras de tecidos obtidas de pacientes com doença prévia não descrita. Qual das seguintes técnicas pode ser a mais útil na identificação desse microrganismo? (A) (B) (C) (D) (E)

Sorologia Amplificação por PCR e sequenciamento dos genes do rRNA Eletroforese enzimática de múltiplos locus Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS Eletroforese em campo pulsado

5. O DNA polimerase do Thermus aquaticus é um importante com ponente dos métodos de amplificação do DNA, como a reação em cadeia da polimerase. Esse microrganismo é capaz de crescer em temperaturas superiores a lOOºC. Os microrganismos capa zes de crescer a tais temperaturas são chamados: (A) (B) (C) (D) (E)

Mesófilos Psicrófilos Halófilos Termófilos Quimiolitótrofos

Respostas c

3. E

2. D

4. B

1.

5. D

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C A P Í T U L O

Crescimento, sobrevida e

SOBREVIDA DOS MICRORGANISMOS NO AMBIENTE NATURAL A população de microrganismos na biosfera permanece apro ximadamente constante, visto que o crescimento microbiano é contrabalanceado pela sua própria morte. A sobrevivência de qualquer grupo microbiano em um nicho específico é, em última análise, influenciada pela competição bem-sucedida por nutrientes e pela manutenção de um reservatório de célu las vivas, frequentemente composto por células hospedeiras e por diferentes microrganismos. Consequentemente, o enten dimento da competição pelos recursos nutricionais dentro de um dado microambiente é essencial para compreensão sobre o crescimento, sobrevivência e a evolução das espécies bacteria nas (também conhecido como fisiologia). A maior parte do conhecimento adquirido sobre a fisiolo gia microbiana provém do estudo em laboratórios de culturas crescidas em condições ideais (excesso de nutrientes), consti tuindo assim a base de discussão desse capítulo. Entretanto, muitos microrganismos competem no ambiente natural em condições de estresse nutricional. Além disso, é preciso reco nhecer que um nicho microbiano vazio no meio ambiente será logo preenchido por outras bactérias. De certa forma, é um di lema que os procedimentos de saúde pública ainda enfatizem a simples eliminação de microrganismos mediante a limpeza de seu nicho, uma vez que estes espaços tendem a ser preenchi dos com outras espécies bacterianas. Logo, a compreensão das complexas interações que asseguram a sobrevivência de uma bactéria específica, em uma biosfera microbiana diversificada é uma questão de eficácia fisiológica.

O SIGNIFICADO DO CRESCIMENTO O crescimento consiste no aumento ordenado da soma de todos os componentes de um organismo. O aumento de tamanho que ocorre quando uma célula capta água ou forma depósitos de lipí deos ou polissacarídeos não constitui um crescimento verdadeiro. A multiplicação celular é uma consequência do crescimento; nos organismos unicelulares, o crescimento leva a um aumento no número de indivíduos que compõem uma população ou cultura.

Determinação das concentrações microbianas As concentrações microbianas podem ser medidas em ter mos de concentração celular (o número de células viáveis por

unidade de volume de cultura) ou de concentração de biomas sa (peso seco de células por unidade de volume de cultura). Esses dois parâmetros nem sempre são equivalentes, visto que o peso seco médio da célula varia em diferentes estágios da vida de uma cultura. Tampouco têm significado idêntico: em estu dos de genética microbiana e de inativação microbiana, a con centração celular constitui fator significativo; já em estudos de bioquímica ou nutrição microbiana, o fator significativo passa a ser a concentração de biomassa.

A. Concentração celular A contagem de células viáveis (Quadro 4.1) em geral, é con siderada uma medida da concentração celular. Para muitos propósitos, a turvação de uma cultura, medida por métodos fotelétricos, pode estar relacionada com a contagem viável na forma de uma curva-padrão. Como alternativa, é possível uma estimativa visual aproximada. Por exemplo, uma suspensão pouco turva de Escherichia coli contém cerca de 107 células por mililitro, enquanto uma suspensão bastante turva contém cerca de 108 células por mililitro. Quando se utilizam medidas turbi dimétricas, a correlação entre a turvação e a contagem de célu las viáveis pode variar durante o crescimento e a morte de uma cultura; as células podem perder a viabilidade sem produzirem perda na turvação da cultura.

B. Densidade da biomassa Em princípio, a biomassa pode ser medida diretamente ao se determinar o peso seco de uma cultura microbiana após sua lavagem com água destilada. Na prática, esse procedimento é trabalhoso, e o pesquisador geralmente prepara uma curva padrão que relaciona o peso seco com a turvação. Como al ternativa, pode-se estimar indiretamente a concentração da biomassa ao medir-se um importante componente celular, como as proteínas, ou determinar-se o volume ocupado pelas células que se sedimentaram na suspensão.

CRESCIMENTO EXPONENCIAL A constante da velocidade de crescimento A velocidade de crescimento das células não limitada por nu trientes é de primeira ordem: a velocidade de crescimento (me dida em gramas de biomassa produzida por hora) é o produto

56

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

QUADRO 4.1

Exemplo de contagem viável

Diluição

16

Contagem em placaª

Não diluído

Muito numerosa para contar

10-1 10-2

Muito numerosa para contar

, 0-3

72

, 0-4

6

1 o-s

1

8

510

fô' (Ó (/) (/) (Ó E ·º cc -

4

* Cada contagem corresponde à média de três placas (triplicata).

2

do tempo (t), da constante da velocidade de crescimento (k), e da concentração da biomassa, B: dB dt

1

= kB

(1)

O rearranjo da equação (1) demonstra que a constante da velocidade de crescimento é aquela em que as células produ zem mais células: k=

Bdt

(2)

dB

Uma constante da velocidade de crescimento de 4,3 h- 1, uma das mais altas registradas, significa que cada grama de cé lulas produz 4,3 g de células por hora durante esse período de crescimento. Os microrganismos de crescimento lento podem apresentar constantes de velocidade de crescimento muito bai xas, de até 0,02 h- 1* Com essa constante de crescimento, cada grama de células da cultura produz 0,02 g de células por hora. A integração da equação (1) fornece B,

BI ln = 2 3 1og10 Bo Bo -

'

- =

k(t1 - to )

(3)

O logaritmo natural da relação entre B (a biomassa no 1 tempo 1 [t1 ]) e B0 (a biomassa no tempo zero [t0]) é igual ao produto da constante da velocidade de crescimento (k) e à di ferença no tempo (t1 - t0). O crescimento que obedece à equa ção (3) é denominado exponencial porque a biomassa aumenta exponencialmente com relação ao tempo. Correlações lineares de crescimento exponencial são produzidas através da repre sentação gráfica do logaritmo da concentração da biomassa (B) como uma função do tempo (t).

Cálculo da constante da velocidade de crescimento e previsão da quantidade de crescimento As bactérias se reproduzem por divisão binária, e o tempo mé dio necessário para que a população ou a biomassa duplique é conhecido como tempo de geração ou tempo de duplicação (td). Em geral, o td é determinado ao traçar-se um gráfico da quantidade de crescimento em uma escala semilogarítmica em

2td

3td

Tempo de duplicação (td) Crescimento exponencial. A biomassa (B) duplica a cada tempo de duplicação (td). FIGURA 4.1

função do tempo; o tempo necessário para duplicar a biomassa é td (Fig. 4.1). A constante da velocidade de crescimento pode ser calculada a partir do tempo de duplicação ao substituirmos B /B0 pelo valor 2 e t1 -t0 por td na equação (3), o que resulta 1 em ln2 = ktd k=

ln2

(4)

td

Um tempo de duplicação rápido corresponde a uma alta constante da velocidade de crescimento. Por exemplo, um tem po de duplicação de 10 minutos (0,17 h) corresponde a uma 1 constante da velocidade de crescimento de 4,1 h * O tempo de duplicação relativamente longo de 35 h indica a uma constante da velocidade de crescimento de 0,02 h- 1* A constante da velocidade de crescimento calculada pode ser utilizada para se determinar a quantidade de crescimento que ocorrerá em um período específico ou calcular o tempo necessário para que ocorra um aumento específico de cresci mento. A quantidade de crescimento em um período específico po de ser prevista com base no seguinte rearranjo da equação (3): (5) É possível determinar a quantidade de crescimento que ocorrerá se uma cultura com constante de velocidade de cres cimento de 4,1 h- 1 crescer exponencialmente durante 5 h: log io

li_ = 4,lh-1 Bo

X

2,3

5h

(6)

Nesse exemplo, o aumento da biomassa é de 10-9; uma 1 única célula bacteriana com peso seco de 2 x 10- 3 g originaria

CAPÍTULO 4 Crescimento, sobrevida e morte dos microrganismos 0,2 mg de biomassa, quantidade que povoaria densamente uma cultura de células de 5 mL. Obviamente, essa velocidade de crescimento não pode ser mantida por muito tempo. Um período adicional de 5 h de crescimento a essa velocidade pro duziria 200 kg de peso seco de biomassa, ou aproximadamente uma tonelada de células. Outro rearranjo da equação (3) permite-nos calcular a quantidade de tempo necessária para que ocorra uma quanti dade específica de crescimento. Na equação (7) a concentração de biomassa, B, é substituída pela concentração celular, N, para possibilitar o cálculo do tempo necessário para que haja um aumento específico no número de células.

(7)

Utilizando a equação (7), é possível, por exemplo, deter minar o tempo necessário para que um organismo de cresci mento lento com constante da velocidade de crescimento de 1 0,02 h- cresça de uma única célula até uma suspensão celular pouco turva com concentração de 107 células/mililitro.

t -t 1

o

=

2,3

7 0,02h -l X

---

(8)

A solução da equação (8) revela que seriam necessárias cer ca de 800 h - pouco mais de 1 mês - para que ocorresse tal quantidade de crescimento. A sobrevida dos microrganismos de crescimento lento implica que a corrida pela sobrevida bio lógica nem sempre se baseia na velocidade - as espécies que crescem competem com êxito por nutrientes e evitam sua des truição por predadores e outros riscos ambientais.

QUADRO 4.2

57

Fases da curva de crescimento

bacteriano Fase

Taxa de crescimento

Latência

Zero

Exponencial

Constante

Estacionária máxima

Zero

Declínio

Negativa (morte)

apresentado na Figura 4.2. As fases da curva de crescimento bacteriano mostradas na Figura 4.2 são reflexões dos eventos em uma população de células, e não em células individuais. Esse tipo de cultura é classificado como cultura em batelada. Uma típica curva de crescimento pode ser analisada em quatro fases (Quadro 4.2). A cultura em batelada é um sistema fecha do com recursos limitados, sendo muito diferente de um hos pedeiro humano.

A fase de latência (fase lag) A fase de latência representa um período durante o qual as cé lulas, com depleção de seus metabólitos e enzimas, em conse quência das condições desfavoráveis existentes no final de sua cultura anterior, adaptam-se ao seu novo ambiente. Verifica-se a formação de enzimas e intermediários que se acumulam até alcançarem concentrações suficientes para permitir o reinício do crescimento. Se as células forem obtidas de um meio totalmente diferen te, às vezes ocorre de serem geneticamente incapazes de crescer no novo meio. Nesses casos, poderá ocorrer uma fase de latên cia longa no crescimento, representando o período necessário para que alguns mutantes presentes no inóculo possam multi plicar-se o suficiente para produzirem um aumento efetivo e aparente no número de células.

A CURVA DE CRESCIMENTO Se um volume fixo de meio líquido for inoculado com células microbianas retiradas de uma cultura que previamente cres ceu até a saturação e o número de células viáveis por milili tro for determinado periodicamente, bem como representado em forma de gráfico, em geral se obtém uma curva do tipo

Fase estacionária

.....

Fase log ou de crescimento exponencial

o o
Fase de latência (fase lag)

-

� e:

.3

Fase de morte ou fase logarítmica de declínio

A fase exponencial Durante a fase exponencial, as células encontram-se em estado de equilíbrio dinâmico. Novo material celular está sendo sin tetizado a uma velocidade constante, porém o novo material é, em si, catalítico, e a massa aumenta de modo exponencial. Tal situação prossegue até que ocorra uma de duas alternativas: esgotamento de um ou mais nutrientes no meio, ou acúmulo de produtos metabólicos tóxicos que inibem o crescimento. No caso dos microrganismos aeróbios, o oxigênio costuma ser o nutriente que se torna limitante. Quando a concentração de células ultrapassa cerca de 1 x 107/mL (no caso das bactérias), a velocidade de crescimento diminui, a não ser que seja acres centado oxigênio ao meio por agitação ou por borbulhamento de ar. Quando a concentração bacteriana atinge 4 a 5 x 109/mL, a velocidade de difusão do oxigênio não consegue suprir as de mandas mesmo em um meio de cultura arejado, o que retarda progressivamente o crescimento.

A fase estacionária máxima Tempo FIGURA 4.2

Curva de crescime nto bacte riano.

Por fim, a exaustão de nutrientes ou o acúmulo de produ tos tóxicos resulta em interrupção completa do crescimento.

58

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

Entretanto, na maioria dos casos ocorre renovação celular na fase estacionária: verifica-se uma lenta perda de células por morte, compensada pela formação de novas células por cresci mento e divisão. Quando isso ocorre, a contagem total de célu las aumenta lentamente, embora a contagem viável permaneça constante.

Biofilmes Tem sido cada vez mais reconhecido, que muitas infecções são causadas por bactérias que não crescem individualmente (ou planctonicamente). Em vez disso, as células bacterianas cres cem em comunidades complexas em que comunicam-se entre si. É rotina, por exemplo, escovar os dentes todos os dias pa

A fase de declínio: a fase de morte Depois de um período na fase estacionária, que varia de acordo com o microrganismo e as condições de cultura, a velocidade de morte aumenta até atingir o nível de equilíbrio dinâmico. A matemática da morte no estado de equilíbrio dinâmico será discutida adiante. Na maioria dos casos, a taxa de morte celular é mais lenta do que o crescimento exponencial. Com frequên cia, após ocorrer a morte da maioria das células, a velocidade de morte diminui drasticamente, de modo que um pequeno número de sobreviventes pode persistir durante meses ou mes mo anos. Em alguns casos, essa persistência pode refletir reno vação celular com o crescimento de algumas células à custa dos nutrientes liberados pelas células que morrem e sofrem lise. Acredita-se que um fenômeno, no qual as células são cha madas viáveis, mas não cultiváveis (VMNC), seja resultado de uma resposta genética desencadeada pela privação de nutrien tes na fase estacionária. Assim como algumas bactérias for

ra remover a película de bactérias que cresce continuamente, até mesmo enquanto se dorme. De forma similar, os biofilmes estão associados a infecções pulmonares causadas por Pseudo

monas aeruginosa e à colonização de cisternas de hospitais por Legionella pneumophila, entre outros. Esse padrão de cresci mento começa com uma única célula bacteriana, que se adere a uma determinada superfície. Em seguida, essa célula se autor replica, sucessivamente, ou ocorre o recrutamento de outras espécies bacterianas na estrutura colonial em formação.

O reconhecimento desse padrão de crescimento tem sido amplamente estudado. A estratégia conceitua! da formação do biofilme tem um sentido lógico: (1) através do crescimento bacteriano na forma de camadas sucessivas, as bactérias iniciais (presentes nas camadas mais internas do biofilme) são menos suscetíveis a ação do sistema imune e a (2) penetração de an timicrobianos, que são protegidas pelo crescimento bacteriano das camadas mais externas. O estudo dos bioftlmes

in vitro e in

vivo é uma ciência em constante evolução.

mam esporos como mecanismo de sobrevivência, outras são capazes de se tornar dormentes, sem alteração em sua morfolo gia. Quando as condições adequadas estão disponíveis (p. ex., migração direta de um animal) os micróbios VMNC retomam o crescimento.

DEFINIÇÃO E MEDIDA DA MORTE O significado da morte Para uma célula microbiana, a morte significa perda irreversível da capacidade de reprodução (crescimento e divisão). O teste

MANUTENÇÃO DAS CÉLULAS NA FASE EXPONENCIAL As células podem ser mantidas na fase exponencial mediante sua repetida transferência em meio de cultura fresco de composição idêntica, enquanto ainda estão crescendo de modo exponencial. Esse processo é conhecido como

cultura contínua; o aparelho

de cultura contínua de uso mais comum é um quimiostato. Uma cultura contínua é mais similar às condições encontradas pelos microrganismos no mundo real (p. ex., corpo humano) onde os nutrientes são constantemente substituídos.

O quimiostato

empírico de morte consiste em uma cultura de células em meios sólidos: uma célula é considerada morta se não conseguir formar

uma colônia em qualquer meio. Naturalmente, a confiabilida

de do teste depende da escolha do meio de cultura e das condi

ções: uma cultura em que 99% das células parecem "mortas", em termos de sua capacidade de formar colônias em determinado

meio, poderá mostrar-se 100% viável se for testada em outro

meio. Além disso, a detecção de algumas células viáveis em uma amostra clínica grande pode não ser possível por semeadura di reta, visto que o seu líquido pode ser inibitório para o crescimen to microbiano. Em tais circunstâncias, pode ser necessário diluir inicialmente a amostra em meio líquido, permitindo o cresci mento das células viáveis antes de tal semeadura. As condições de incubação na primeira hora após o trata

O quimiostato consiste em um recipiente de cultura equipado

mento também são decisivas para a determinação da "morte".

com um sifào de fluxo e um mecanismo de gotejamento no meio

Assim, por exemplo, se as células bacterianas forem irradiadas

de cultura fresco a partir de um reservatório, a uma velocidade

com luz ultravioleta e semeadas imediatamente em qualquer

controlada. O meio de cultura no recipiente é agitado por uma

corrente de ar estéril; cada gota do meio de cultura fresco que

entra determina a saída de uma gota da cultura pelo sifão.

O meio é preparado de modo que um nutriente limite o crescimento. O recipiente é inoculado e as células crescem até a exaustão do nutriente limitante; em seguida, o meio de cultura fresco do reservatório flui a uma velocidade tal que as células utilizam o nutriente limitante à mesma velocidade com que ele é fornecido. Nessas condições, a concentração celular perma nece constante, e a velocidade de crescimento é diretamente proporcional à velocidade de fluxo do meio.

meio de cultura, poderá parecer que 99,99% delas foram des truídas. Entretanto, se essas células irradiadas forem inicial mente incubadas em tampão apropriado durante 20 minutos, a semeadura indicará que apenas 10% delas morreram. Em ou tras palavras, a irradiação determina que uma célula "morrerá" se for semeada imediatamente, mas pode sobreviver se tiver a oportunidade de proceder ao reparo da lesão por irradiação antes de sua semeadura. Por conseguinte, uma célula microbiana não fisicamente rompida está "morta" apenas em termos das condições utiliza das para testar sua viabilidade.

CAPÍTULO 4 Crescimento, sobrevida e morte dos microrganismos

A

A

medida da morte

Quando se trata de microrganismos, não se costuma determinar a morte de cada célula, mas de uma população. Esse aspecto constitui um problema estatístico: em qualquer condição passível de levar à morte celular, a probabilidade de determinada célula morrer é constante por unidade de tempo. Por exemplo, se for utilizada uma condição capaz de provocar a morte de 90% das células nos primeiros 1 O minutos, a probabilidade de que qualquer célula morra em um intervalo de 10 minutos será de 0,9. Por conseguinte, pode-se esperar que 90% das células sobreviventes irão morrer a cada intervalo sucessivo de 10 minutos, obtendo-se uma curva de morte semelhante as curvas mostradas na Figura 4.3. Assim, o número de células que morrem a cada intervalo de tempo constitui uma função do número de sobreviventes presentes, de modo que a morte de uma população segue um processo exponencial de acordo com a fórmula geral S

=

S e -kt o

6 ....J E (15 Q) e: Q) .<:> .o o cn cn co :::::l -Q) (.) Q) -

.....

5

4

3

"O

e Q) E :::::l 'e: o

"O o �

Cl

.9

2

1

o

(9)

em que S0 é o número de sobreviventes no tempo zero, e S, o número de sobreviventes em qualquer momento posterior t. Como no caso do crescimento exponencial, -k representa a velocidade de morte exponencial quando a fração ln (S/S0) é representada graficamente com relação ao tempo. A curva de impacto único mostrada na Figura 4.3A é típica da cinética de inativação observada em muitos agentes antimicrobianos. O fato de ser uma linha reta a partir do tempo zero (dose zero) - em lugar de exibir um desvio inicial - significa que um único "impacto" pelo agente inativador é suficiente para matar a célula, ou seja, apenas um único alvo precisa ser lesionado para que toda a célula seja inativada. Esse alvo pode ser o cromossomo de uma bactéria haploide ou uma membrana celular, mas não pode ser uma enzima ou outro componente celular presente em várias cópias. Uma célula que contenha várias cópias do alvo a ser inativado exibe curva de múltiplo impacto do tipo apresentado na Figura 4.3B. A extrapolação da porção reta da curva na ordenada permite uma estimativa do número de alvos (p. ex., 4 na Figura 4.3B).

10

20

30

40

50

60

40

50

60

Minutos B

7

....J E ..._

6

fil

-

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.....

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Cl o ....J

1

Esterilização Na prática, define-se "esterilização" como processo de destrui ção de todos os microrganismos em uma preparação. Entre tanto, com base nas considerações expostas anteriormente, percebe-se que nenhum conjunto de condições assegura a es terilização de uma preparação. Considere a situação exemplifi cada na Figura 4.3. Aos 60 minutos, existe um microrganismo (10º) por mililitro. Aos 70 minutos, haveria 10- 1, aos 80 minu tos, 10-2 e assim por diante. Logo, pode-se dizer que em uma solução contendo uma concentração de 10-2 microrganismos por mililitro,, em um volume total de 100 mL, haveria um microrganismo sobrevivente. Quanto tempo, então, seria ne cessário para "esterilizar" a cultura? Tudo que pode-se dizer é que, após dado período de tratamento, a probabilidade de ha ver quaisquer microrganismos sobreviventes em 1 mL é aquela apresentada pela curva na Figura 4.3. Após 2 h, no exemplo ci tado, a probabilidade é de 1 x 10-6* Em geral, isso é considerado

59

10

20

30

Minutos Curva da morte de uma suspensão de 106 organismos viá veis por mililitro. (A) Curva de impacto único. (8) Curva de múltiplo impac to. A porção da linha reta extrapolada para 6,5 corresponde a 4 x 106 célu las. Portanto, o número de alvos é de 4 x 106, ou quatro por célula. FIGURA 4.3

um tempo seguro de esterilização. Entretanto, um volume de 1.000 mL pode conter ainda um microrganismo viável. Observe que esses cálculos dependem de a inclinação da curva permanecer inalterada durante todo o período decorrido. Infeliz mente, é muito comum que a curva se incline para cima depois de certo período, em virtude da heterogeneidade da população quanto à sua sensibilidade ao agente inativador. As extrapolações são perigosas e podem levar a erros, como os encontrados nas primeiras preparações da vacina estéril contra a pólio.

60

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia 2,4

O efeito da concentração do fármaco Quando são utilizadas substâncias antimicrobianas (fármacos) para inativar as células microbianas, é comum verificar-se que a

2,0

concentração empregada está relacionada com o tempo neces

Inclinação n

sário para destruir determinada fração da população através da seguinte expressão:

=

-

cn o

:::::l e:

1,6

-

C"t = K

(10)

Nesta equação, C é a concentração do fármaco, t o tempo necessário para destruir determinada fração das células, e

ne

K são constantes. Tal expressão mostra que, por exemplo, se

E E

·-

Q) -

1,2

......

o

Cl o

�

...J

0,8

n = 6 (como no

caso do fenol), a duplicação da concentração do fármaco irá reduzir o tempo necessário para se obter o mesmo grau de ina

0,4

tivação 64 vezes. O fato de a eficácia de um fármaco variar de acordo com a sexta potência da concentração, sugere serem

0 '--��-'-��-'-�--' 1 ,1o 1 ,20 1 ,30 1 ,00

necessárias seis moléculas dele para inativar uma célula, em bora não haja evidências químicas diretas que corroborem essa conclusão. Para se determinar o valor de

n de qualquer fármaco,

são

obtidas curvas de inativação para cada uma das várias con centrações, determinando-se o tempo necessário, em cada

Log10 C (em partes por 1 .000) Relação entre a concentração do fármaco e o tempo necessário para destruir determinada fração de população celular. FIGURA 4.4

concentração, para inativar uma fração fDCa da população. Por exemplo, considere-se C1 a primeira concentração utilizada e t o tempo necessário para inativar 99% das células, bem como 1 C e t a segunda concentração e o tempo necessário para inati 2 2 var 99% das células. A partir da equação (10), verifica-se que

(11) Resolvendo a partir de

tem a capacidade de inibir a multiplicação bacteriana que re começa com a retirada do agente. (Os termos "fungistático" e "esporostático" referem-se aos biocidas que inibem, respecti

C. Bactericida

logt2 - logt1

(12)

logC1 - logC2

Termo que se refere à propriedade pela qual um biocida é capaz de matar bactérias. A ação bactericida difere da bacte

Por conseguinte, é possível determinar

n

medindo a in

clinação da linha que resulta quando o log t é representado graficamente contra o log C (Fig. 4.4). Se

Termo referente à propriedade pela qual um agente biocida

vamente, o crescimento de fungos e esporos.)

n, tem-se

n=

B. Bacteriostático

n for determinado ex

perimentalmente dessa maneira, K poderá ser determinado ao substituir os valores observados para C, t e n na equação (10).

riostática apenas por ser irreversível, isto é, o microrganismo "morto" não pode mais se reproduzir mesmo após a remoção do contato com o agente. Em alguns casos, o agente provoca a lise (dissolução) das células; em outros, as células permanecem intactas, podendo mesmo continuar metabolicamente ativas. (Os termos, "fungicida'', "esporicida" e "virucida" referem-se à propriedade pela qual os biocidas são capazes de matar, respec

AGENTES ANTIMICROBIANOS

tivamente, fungos, esporos e vírus.)

Definições

D. Esterilização

Os termos a seguir são comumente utilizados com relação aos

Um processo definido, utilizado para deixar uma superfície ou

antimicrobianos e seus usos.

um produto livres de organismos viáveis, inclusive bactérias e esporos.

A. Biocida

E. Desinfetantes

É um agente químico ou físico, em geral de amplo espectro, que inativa microrganismos (Quadro 4.3). Os químicos in

Produtos ou biocidas utilizados para reduzir o número de mi

cluem o peróxido de hidrogênio,, fenóis, alcoóis, hipoclorito

crorganismos viáveis, ou a carga biológica em um produto ou

de sódio e clorexidina; e os biocidas físicos incluem o calor e

superfície a um nível previamente especificado como apropria

a radiação. Os biocidas geralmente são de largo espectro, em

do para seu manuseio ou sua posterior utilização. Os desinfe

contraste com os anti-infecciosos, que têm um espectro da ati

tantes não são necessariamente esporicidas, mas mostram-se

vidade antimicrobiana mais restrito.

esporostáticos, inibindo a germinação ou o crescimento.

CAPÍTULO 4 Crescimento, sobrevida e morte dos microrganismos

QUADRO 4.3

61

Alguns biacidas usados em antissepsia, desinfecção, preservação e outras finalidades

Agente

Fórmula

Usos

Alcoóis

Antissepsia, desinfecção, preservação

Etanol

CH3 -CHOH

lsopropanol

CH3"CHOH CH3/

Aldeídos

Desinfecção, esterilização, preservação

Glutaraldeído H"C=O H/

Formaldeído Biguanidas

Clorexidina

CI

f '

N(HCN)2H(CH2)6N(HCN)2H

11

11

NH CI

OH

Triclosana

Antissepsia, atividade antiplaca

o

j

CI

CI

OH

OH

CI

CI

�

Desodorante, preservação

CI CI � CI

CI Agentes liberadores de halogênio

Compostos clorados

CI

Antissepsia, atividade biofilme dental, preservação, desinfecção

NH

Bifenóis

Hexaclorofeno

f '

Desinfecção, antissepsia �

OCI-, HOCI, Cl2

Compostos iodados Derivados de metais pesados

Compostos de prata

Ag

Preservação, antissepsia

Compostos de mercúrio

Hg

Desinfecção

Acidos orgânicos

Preservação

COOH

Acido benzoico Acido propiônico

Sais de sódio ou cálcio usados para preservação

Peroxigênios

Desinfecção, esterilização

Peróxido de hidrogênio Ozônio Acido peracético Fenóis e cresóis

Desinfecção, preservação

Fenol

Cresol

OH

CH3 Compostos de amônio quaternário

Rl

"

/

R2

/

R3

N "

R4

+

Desinfecção, antissepsia, preservação x-

(continua)

SEÇÃO 1

62

QUADRO 4.3

Fundamentos da Microbiologia Alguns biocidas usados em antissepsia, desinfecção, preservação e outras finalidades (continuação)

Agente

Fórmula

Cetrimida H3C ' / H3C

Cloreto de benzalcônio

N

Usos +

CH3 / ' CoH2n+1

O- cH2

'

/ H3C

CH3 /

N

Desinfecção, antissepsia, preservação sr-

+

' C0H2n+l

Fase de vapor

Esterilização, desinfecção

óxido de etileno

Formaldeído

H

1

H - C=O Peróxido de hidrogênio

F. Séptico Caracteriza-se pela presença de micróbios patogênicos em te cido vivo ou fluidos corpóreos.

G. Antisséptico Um biocida ou produto que destrói ou inibe o crescimento de microrganismos em tecido vivo (p. ex., pele) ou fluidos bioló gicos (p. ex., secreções de mucosa).

H. Asséptico Livre de, ou que emprega métodos para ficar livre de microrgan1smos. *

1. Preservação Prevenção da multiplicação de microrganismos em produtos formulados, como produtos farmacêuticos e alimentos.

e pirimidínicas para formar complexos de DNA ou ligações cruzadas entre filamentos. A radiação lesiona o DNA de várias maneiras: a luz ultravioleta, por exemplo, induz a formação de ligações cruzadas entre pirimidinas adjacentes em um dos dois filamentos de polinucleotídeos, formando dímeros de pirimi dina; as radiações ionizantes induzem quebras em filamentos simples ou duplos. As lesões do DNA induzidas pela radiação ou por agentes químicos destroem a célula principalmente por interferir na replicação do DNA. Ver no Capítulo 7 uma dis cussão sobre os sistemas de reparo do DNA.

B. Desnaturação das proteínas As proteínas ocorrem em um estado tridimensional compacta do, determinado primariamente, por ligações covalentes de dis sulfeto intramoleculares e por várias interações não covalentes, como ligações iônicas, hidrofóbicas e de hidrogênio ou ligações covalente dissulfeto. Esse estado, denominado estrutura terciá

ria da proteína, é facilmente desorganizado por diversos agentes

físicos (p. ex., calor) ou químicos (p. ex., álcool), resultando em

J. Antibióticos Compostos orgânicos de ocorrência natural ou sintética que

uma proteína não funcional. A ruptura da estrutura terciária de uma proteína é denominada desnaturação proteica.

inibem ou destroem bactérias de maneira seletiva, geralmente a baixas concentrações.

Modos de ação A. Dano ao DNA

C. Ruptura da membrana ou da parede celular A membrana celular atua como barreira seletiva (melhor ca racterizada como uma rede de pesca), permitindo a passagem de alguns solutos e excluindo outros. Muitos compostos são transportados ativamente através da membrana, concentran

Vários agentes físicos e químicos atuam danificando o DNA.

do-se no interior da célula. A membrana também constitui o

Tais agentes incluem radiações ionizantes, luz ultravioleta e

local das enzimas envolvidas na biossíntese de componentes

substâncias químicas que reagem com o DNA. Na última ca

do envelope celular. As substâncias que se concentram na su

tegoria estão incluídos os agentes alquilantes e outros com

perfície celular podem alterar as propriedades físicas e quími

postos que reagem de modo covalente com as bases purínicas

cas da membrana, impedindo o desempenho de suas funções

CAPÍTULO 4 Crescimento, sobrevida e morte dos microrganismos

63

normais e, portanto, destruindo ou inibindo a viabilidade da célula. A parede celular atua como estrutura de sustentação (me lhor caracterizada como uma rede de pesca) protegendo a célula contra a lise osmótica. Assim, os agentes que destroem a parede celular (p. ex., lisozima, que cliva ligações glicosídicas) ou im pedem sua síntese normal (p. ex., penicilina, que interrompe as ligações cruzadas peptídicas) podem provocar a lise celular.

ácidos nucleicos (nucleotídeos). Em alguns casos, o análogo simplesmente impede a incorporação do metabólito normal (p. ex., o 5-metiltriptofano impede a incorporação do triptofa no à proteína), ao passo que, em outros casos, o análogo subs titui o metabólito normal na macromolécula, tornando-a não funcional. A incorporação da p-fluorofenilalanina em lugar da fenilalanina em proteínas constitui um exemplo do último tipo de antagonismo.

D. Ruptura dos grupos sulfidrila livres

Reversão da ação antibacteriana

As enzimas que contêm cisteína possuem cadeias laterais que terminam em grupos sulfidrila. Além disso, as coenzimas, co mo a coenzima A e o diidrolipoato, contêm grupos sulfidrila livres. Tais enzimas e coenzimas não podem funcionar, a não ser que os grupos sulfidrila permaneçam livres e no estado re duzido. Por conseguinte, os agentes oxidantes interferem no metabolismo, formando ligações de dissulfeto entre grupos sulfidrila vizinhos:

Na seção sobre definições, foi assinalado que a ação bacterios tática é, por definição, reversível. Essa reversão pode ser obtida de diversas maneiras.

R - SH + HS - R

2 - H

>R-S-S-R

Muitos metais, como o íon mercúrico, também interferem ao se combinarem com grupos sulfidrila. Existem muitas enzi mas sulfidrílicas na célula; por conseguinte, os agentes oxidan tes e os metais pesados provocam lesão disseminada.

E. Antagonismo químico A interferência de um agente químico na reação normal entre uma enzima e seu substrato é conhecida como antagonismo químico. O antagonista atua ao combinar-se com alguma parte da holoenzima (a apoenzima proteica, o ativador mineral ou a coenzima), impedindo assim a fixação do substrato normal. (O termo substrato é usado aqui no sentido amplo para incluir os casos em que o inibidor se combina com a apoenzima, impe dindo assim a ligação com a coenzima.) Um antagonista combina-se com uma enzima em virtu de de sua afinidade química por um local essencial existente na enzima. As enzimas desempenham sua função catalítica em virtude de sua afinidade por seus substratos naturais; por conseguinte, qualquer composto estruturalmente semelhante ao substrato em certos aspectos essenciais também pode exi bir afmidade pela enzima. Se essa afmidade for intensa o sufi ciente, o "análogo" irá deslocar o substrato normal e impedir a ocorrência da reação apropriada. Muitas holoenzimas incluem um íon mineral como ponte entre a enzima e a coenzima ou entre a enzima e o substrato. As substâncias químicas que se combinam facilmente com es ses minerais também impedem a ligação da coenzima ou do substrato; por exemplo, o monóxido de carbono e o cianeto combinam-se com o átomo de ferro nas enzimas que contêm heme, impedindo sua função na respiração. Os antagonistas químicos podem ser convenientemente classificados em duas categorias: (a) antagonistas de proces sos produtores de energia e (b) antagonistas de processos de biossíntese. Os primeiros incluem venenos que afetam as en zimas respiratórias (monóxido de carbono, cianeto) e a fosfo rilação oxidativa (dinitrofenol); os últimos incluem análogos das unidades formadoras das proteínas (aminoácidos) e dos

A. Remoção do agente Quando as células inibidas pela presença de um agente bac teriostático são removidas por sucessivas lavagens e cen trifugações do meio, contendo a substância bacteriostática, readquirem sua capacidade de multiplicação normal.

B. Reversão pelo substrato Quando um antagonista químico do tipo análogo se liga rever sivelmente à enzima, é possível deslocá-lo ao adicionar-se uma alta concentração do substrato normal. Esses casos são deno minados "inibição competitiva". A relação entre a concentra ção do inibidor e a concentração do substrato que reverte a inibição é denominada índice antimicrobiano; em geral, esse valor apresenta-se muito alto (100 a 10.000), indicando afmi dade muito maior da enzima para o análogo do que para seu substrato normal.

C. lnativação do agente Com frequência, um agente pode ser inativado mediante o acréscimo ao meio de uma substância que se combina com ele, impedindo assim sua combinação com componentes ce lulares. Por exemplo, o íon mercúrico pode ser inativado pelo acréscimo de compostos sulfidrílicos ao meio, como o ácido tioglicólico.

D. Proteção contra a lise É possível evitar a ocorrência da lise osmótica ao se tornar o meio isotônico para os protoplastos bacterianos desnudos. São necessárias concentrações de sacarose de 10 a 20%. Nessas con dições, os protoplastos induzidos pela penicilina (p. ex., o ma terial vivo de uma célula bacteriana incluindo o protoplasma e membrana após a parede celular ser removida), permanecem viáveis e continuam a crescer como formas L.

Resistência aos agentes antibacterianos A capacidade das bactérias de adquirir resistência aos antibac terianos constitui um importante fator para seu controle. Os mecanismos pelos quais a resistência é adquirida são discuti dos nos Capítulos 7, Genética microbiana; e 28, Quimioterapia antimicrobiana.

64

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

Agentes físicos A. Calor A aplicação de calor constitui a maneira mais simples de esteri lizar materiais, contanto que o próprio material seja resistente ao calor. A temperatura de lOOºC irá destruir todas as formas bacterianas, exceto os esporos, em 2 a 3 minutos nas culturas em escala laboratorial. A temperatura de 121 ºC durante 15 minutos é usada para matar os esporos. Em geral utiliza-se o vapor, visto que as bactérias são mais rapidamente destruídas em condições úmidas e o vapor proporciona um meio de distribuição do ca lor em todas as partes do recipiente de esterilização. No nível do mar, o vapor deve ser mantido a uma pressão de 15 lb/sq (meia atmosfera) acima da pressão atmosférica a fim de se obter uma temperatura de 121 ºC; para essa finalidade, utilizam-se au toclaves ou panelas de pressão. Em altitudes maiores, a pressão pode ser superior a 15 psi para se alcançar 121 ºC. Para esterilizar materiais que devem permanecer secos, dispõe-se de estufas elé tricas com ar quente circulante; como o calor se mostra menos eficaz em material seco, é comum a aplicação de uma tempera tura de 160 a 170ºC durante 1 hora ou mais. Nessas condições (i. e., temperaturas excessivas aplicadas por longos períodos), o calor atua desnaturando as proteínas e os ácidos nucleicos das células e rompendo as membranas celulares.

B. Radiação A luz ultravioleta e a radiação ionizante têm várias aplicações como agentes esterilizantes. Seus mecanismos de ação foram discutidos anteriormente.

Agentes químicos As estruturas químicas e os usos dos biocidas são apresentados no Quadro 4.3.

A. Alcoóis O álcool etílico, o álcool isopropílico e o n-propanol exibem rápida atividade antimicrobiana de amplo espectro contra bac térias vegetativas, vírus e fungos, mas não são esporicidas. A atividade é ótima quando estes são diluídos em uma concen tração com 60 a 90% de água.

B. Aldeídos Utiliza-se o glutaraldeído para desinfecção e esterilização a baixa temperatura de endoscópios e equipamentos cirúrgicos. Normalmente, é utilizado em forma de solução a 2% para se obter atividade esporicida. O formaldeído é bactericida, espo ricida e virucida.

C. Biguanidas A clorexidina é amplamente utilizada na lavagem das mãos e de produtos orais, e como desinfetante e conservante. Em geral, as micobactérias são altamente resistentes a esses compostos, em virtude de sua parede celular rica em ácidos micólicos.

D. Bifenóis São amplamente utilizados em sabões antissépticos e para lava gem das mãos. Em geral, são de amplo espectro, porém exibem

pouca atividade contra Pseudomonas aeruginosa e bolores. A triclosana e o hexaclorofeno são bactericidas e esporostáticos.

E. Agentes que liberam halogênios Os tipos mais importantes de agentes que liberam cloro são o hipoclorito de sódio, o dióxido de cloro e o dicloroisocianura to de sódio, agentes oxidantes que têm a propriedade de des truir a atividade celular das proteínas. O ácido hipocloroso é o composto ativo responsável pelos efeitos bactericida e virucida de tais compostos. Em concentrações mais altas, esse grupo é esporicida. O iodo é fortemente bactericida, fungicida, tuber culocida, virucida e esporicida. Os iodóforos (p. ex., iodopovi dona) são complexos de iodo com um agente solubilizante ou transportador, que atua como reservatório do 12 ativo.

F. Derivados de metais pesados A sulfadiazina de prata (Ag+), uma combinação de dois anti bacterianos, Ag+ e sulfadiazina, tem amplo espectro de ativida de. A ligação a componentes celulares, como o DNA, pode ser responsável pelas suas propriedades inibitórias.

G. Ácidos orgânicos Os ácidos orgânicos são usados como preservativos na indús tria farmacêutica e de alimentos. O ácido benzoico é fungistáti co; o ácido propiônico é bacteriostático e fungistático. H. Peroxigênios O peróxido de hidrogênio tem atividade de amplo espectro contra vírus, bactérias, leveduras e esporos bacterianos. A ati vidade esporicida exige concentrações mais altas (10 a 30%) de H202 e maior tempo de contato. 1. Fenóis O fenol e muitos compostos fenólicos têm propriedades antis sépticas, desinfetantes ou conservantes.

J. Compostos de amônio quaternário Estes compostos têm duas regiões nas suas estruturas molecu lares, ou seja, um grupo que repele a água (hidrofóbico) e outro que a atrai (hidrofílico). Os detergentes catiônicos, exemplifica dos pelos compostos de amônio quaternário (CAQ), são antis sépticos e desinfetantes úteis. Os CAQ têm sido utilizados com várias finalidades clínicas (p. ex., desinfecção pré-operatória da pele íntegra), bem como para a limpeza de superfícies duras. São esporostáticos, e inibem o desenvolvimento dos esporos, mas não o processo de germinação em si. Os CAQ também são micobacteriostáticos e têm efeito sobre vírus com envelope lipídico, mas não sobre vírus sem envelope.

K. Esterilizantes com fase de vapor

Os dispositivos médicos e os suprimentos cirúrgicos sensíveis ao calor podem ser efetivamente esterilizados por sistemas com fase de vapor que usam óxido de etileno, formaldeído, peróxi do de hidrogênio ou ácido peracético.

CAPÍTULO 4 Crescimento, sobrevida e morte dos microrganismos

(C) Constante (D) Decrescente (E) Negativa

OBJETIVOS 1. Compreender as diferenças entre crescimento em um sis tema fechado (cultura líquida), crescimento em cultura contínua e crescimento em biofilme. 2. Ententer as diferenças entre conceitos bacteriostáticos e bactericidas. 3. Conhecer as condições para esterilização microbiana. 4. Ter conhecimento dos mecanismos de ação dos principais agentes desinfectantes.

QUESTÕES DE REVISÃO 1. Uma mulher de 23 anos teve dez células de Escherichia cali inocu ladas em sua bexiga durante uma relação sexual. Essas células de E. coli têm um tempo de geração de 20 min. Após 20 min em fase de latência, a bactéria entra em fase exponencial de crescimento. De pois de 3 horas em fase exponencial de crescimento, o número total de células é: (A) (B) (C) (D) (E)

2.560 5.012 90 1.028 1.000.000

2. Uma mulher de 73 anos é admitida em um hospital para trata mento intravenoso de abscesso causado por Staphylacoccus au reus. Após o tratamento e a alta hospitalar, é necessário fazer a desinfecção do leito hospitalar. Mil células de S. aureus ficam expostas ao desinfetante. Após 10 minutos, 90% das células estão mortas. Quantas células permanecem viáveis após 20 minutos? (A) (B) (C) (D) (E)

500 100 10 1

O

3. Qual dos seguintes agentes ou processos tem ação sobre as bacté rias em que pode ocorrer uma reversão bacteriana? (A) (B) (C) (D) (E)

Um desinfetante Um agente bactericida Um agente bacteriostático Autoclavação a 121ºC por 15 minutos Aquecimento a seco a 160 a 170ºC por 1 hora

4. A taxa de crescimento bacteriano durante a fase exponencial do crescimento é: (A) Zero (B) Crescente

65

5. A taxa de crescimento bacteriano durante o pico da fase estacio nária de crescimento é: (A) (B) (C) (D) (E)

Zero Crescente Constante Decrescente Negativa

Respostas 1. A

3.

c

c

4.

c

2.

5. A

REFERÊNCIAS Block SS (editor): Disinfectian, Sterilizatian, and Preservatian, 5th ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2001. Colwell RR, Grimes DJ (editors): Nanculturable Micraarganisms in the Enviranment. ASM Press, 2000. Donohue WD: The cell cycle of Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 1993;47:199. Gerhardt P et al. (editors): Manual afMethodsfar General Bacteriology. American Society for Microbiology, 1981. Hans-Curt Flemming, Jost Wingender: The bioftlm matrix. Nat Rev Microbiol 2010;8:623-633. Kjelleberg S (editor): Starvatian in Bacteria. Plenum Press, 1993. Kjelleberg S, Hermansson M, Mârdén P, Jones GW: The transient phase between growth and nongrowth of heterotrophic bacteria. Annu Rev Micrabial 1987;41:25. Kolter R, Siegels DA, Tormo A: The stationary phase of the bacterial life cycle. J Bacterial 1992;174:345. McDonnell GE: Antisepsis, Disinfectian, and Sterilization: Types, Actian, and Resistance. ASM Press, 2007. McDonnell G, Russell AD: Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clin Microbial Rev 1999; 12:147. Olmstad RN (editor): APIC Infectian Cantrol and Applied Epidemio logy: Principies and Practices. Mosby Year Book, 1996. Russell AD, Hugo WB, Ayliffe GAJ (editors): Principies and Practice of Disinfectian, Preservation and Sterilizatian, 3rd ed. Blackwell Scientific Publications, 1999. Sanear A, Sanear GB: DNA repair enzymes. Annu Rev Biachem 1988;57:29. Siegels DA, Kolter R: Life after log. J Bacterial 1992;174:345.

C A P Í T U L O

Cultura de microrganismos

Cultura refere-se ao processo de propagação de microrganis mos pelo fornecimento de condições ambientais apropriadas. Os microrganismos em crescimento duplicam-se e necessitam dos elementos presentes na sua composição química. Os nu trientes devem proporcionar tais elementos em uma forma metabolicamente acessível. Além disso, os microrganismos necessitam de energia metabólica para sintetizar macromolé culas e manter gradientes químicos essenciais através de suas membranas. Os fatores que precisam ser controlados durante o crescimento consistem em nutrientes, pH, temperatura, ae ração, concentração de sal e força iônica do meio.

uma combinação desses fatores. Alternativamente, as células supridas com uma fonte de ATP podem utilizar a energia de suas ligações de anidrido para criar uma força motriz dos pró tons que pode ser empregada para mover a célula e manter os gradientes químicos. Para crescer, um organismo necessita de todos os elemen tos que compõem sua matéria orgânica e de todo o comple mento de íons indispensáveis aos processos energéticos e à catálise. Além disso, deve haver uma fonte de energia dispo nível para estabelecer a força motriz dos prótons e possibili tar a síntese das macromoléculas. Há uma ampla variação nas demandas nutricionais e nas fontes de energia metabólica dos m1crorgan1smos. *

*

EXIGÊNCIAS PARA O CRESCIMENTO A maior parte do peso seco dos microrganismos consiste em matéria orgânica constituída pelos elementos carbono, hi drogênio, nitrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre. Além des ses, são necessários íons inorgânicos, como potássio, sódio, ferro, magnésio, cálcio e cloreto, para facilitar a catálise enzi mática e manter os gradientes químicos através da membrana celular. Em sua maior parte, a matéria orgânica consiste em macro moléculas formadas por ligações de anidrido entre as unida des precursoras. A síntese das ligações anidrido requer energia química, fornecida pelas duas ligações fosfodiéster do ATP (trifosfato de adenosina; Cap. 6). A energia adicional necessá ria para manter uma composição citoplasmática relativamente constante durante o crescimento, em uma variedade de am bientes químicos extracelulares, provém da força motriz dos prótons. Esta força é a energia potencial que pode ser obtida pela passagem de um próton através de uma membrana. Nos eucariotos, essa membrana pode ser parte da mitocôndria ou do cloroplasto. Nos procariotos, essa membrana é a membrana citoplasmática da célula. A força motriz dos prótons é um gradiente eletroquímico com dois componentes: uma diferença de pH (concentração de íons hidrogênio) e outra na carga iônica. A carga existente do lado externo da membrana bacteriana é mais positiva do que a do lado interno, e a diferença de carga contribui para a energia livre liberada quando um próton penetra no citoplas ma a partir do lado externo da membrana. Os processos me tabólicos que geram a força motriz dos prótons são discutidos no Capítulo 6. A energia livre pode ser utilizada para mover a célula, manter gradientes iônicos ou moleculares através da membrana, sintetizar ligações de anidrido no ATP ou para

FONTES DE ENERGIA METABÓLICA Os três principais mecanismos para a produção de energia me tabólica são a fermentação, a respiração e a fotossíntese. Pelo menos um desses mecanismos tem de ser usado para que o organ1smo possa crescer. *

Fermentação A formação de ATP na fermentação não está acoplada à trans ferência de elétrons. A fermentação caracteriza-se pela fosfori lação de substratos, processo enzimático em que uma ligação de pirofosfato é diretamente doada para o ADP (difosfato de adenosina) por um intermediário metabólico fosforilado. Os intermediários fosforilados são formados por rearranjo meta bólico de um substrato passível de fermentação, como a gli cose, a lactose ou a arginina. Dado que a fermentação não é acompanhada de qualquer alteração no estado de oxirredução global do substrato passível de fermentação, a composição ele mentar dos produtos de fermentação deve ser idêntica a dos substratos. Por exemplo, a fermentação de uma molécula de glicose (C6H1 06) pela via de Embden-Meyerhof (Cap. 6) re 2 sulta em um ganho líquido de duas ligações de pirofosfato no ATP e forma duas moléculas de ácido láctico (C3H603).

Respiração A respiração é análoga ao acoplamento de um processo depen dente de energia à descarga de uma bateria. A redução química de um oxidante (aceptor de elétrons) por uma série específi ca de transportadores de elétrons na membrana estabelece a

68

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

força motriz dos prótons através da membrana bacteriana. O redutor (doador de elétrons) pode ser orgânico ou inorgânico: por exemplo, o ácido láctico atua como redutor para alguns organismos, enquanto o gás hidrogênio é um redutor para outros. O oxigênio gasoso (02) é frequentemente usado como oxidante, mas existem outros oxidantes usados por alguns or ganismos, como o dióxido (C02), o sulfato (So�- ) e o nitrato (NO;) de carbono.

Fotossíntese A fotossíntese assemelha-se à respiração, uma vez que a redu ção de um oxidante por uma série específica de transportadores de elétrons estabelece a força motriz dos prótons. A diferença entre os dois processos é que, na fotossíntese, o redutor e o oxidante são criados fotoquimicamente pela energia luminosa absorvida por pigmentos presentes na membrana. Por conse guinte, a fotossíntese só poderá continuar enquanto houver uma fonte de energia luminosa. As plantas e algumas bactérias são capazes de utilizar uma quantidade significativa de energia luminosa ao transformarem a água em redutor para o dióxi do de carbono. Há formação de oxigênio nesse processo, com a produção de matéria orgânica. A respiração - a oxidação energeticamente favorável de matéria orgânica por um aceptor de elétrons, como o oxigênio - pode fornecer energia a mi crorganismos que realizam a fotossíntese na ausência de luz.

NUTRIÇÃO Os nutrientes nos meios de crescimento devem conter todos os elementos necessários à síntese biológica de novos micror ganismos. Na discussão a seguir, os nutrientes são classificados de acordo com os elementos que eles fornecem.

Fonte de carbono Conforme analisado anteriormente, as plantas e algumas bacté rias têm a propriedade de utilizar a energia da fotossíntese para reduzir o dióxido de carbono à custa de água. Esses organismos pertencem ao grupo dos autótrofos, isto é, seres que não ne cessitam de nutrientes orgânicos para seu crescimento. Outros autótrofos são os quimiolitotrófos, organismos que utilizam um substrato inorgânico, como o hidrogênio ou o tiossulfato, como redutor, e dióxido de carbono como fonte de carbono. Os heterótrofos necessitam de carbono orgânico para seu crescimento, e esse carbono orgânico deve estar em uma forma passível de ser assimilada. Por exemplo, o naftaleno pode forne cer todo o carbono e a energia necessários para o crescimento heterotrófico respiratório; todavia, um número muito pequeno de microrganismos é dotado da via metabólica necessária à assi milação do naftaleno. Já a glicose pode sustentar o crescimento fermentativo ou respiratório de muitos organismos. É impor tante que os substratos para o crescimento sejam fornecidos em níveis adequados para a cepa microbiana que está sendo cultiva da: os níveis que sustentam o crescimento de determinado mi crorganismo podem inibir o crescimento de outro. O dióxido de carbono é necessário para diversas reações de biossíntese. Muitos microrganismos respiratórios produ zem dióxido de carbono em quantidades maiores do que as

suficientes para preencher essa necessidade, enquanto outros precisam de uma fonte de dióxido de carbono em seu meio de crescimento.

Fonte de nitrogênio O nitrogênio é um importante componente das proteínas, dos ácidos nucleicos e de outros compostos, e representa cerca de 5% do peso seco de uma célula bacteriana típica. O nitrogênio inorgânico (N2) é altamente prevalente, compreendendo 80% da atmosfera terrestre. É também um composto muito estável, devido principalmente à alta energia de ativação necessária pa ra quebrar a tripla ponte nitrogênio-nitrogênio. Entretanto, o nitrogênio pode ser fornecido de várias maneiras diferentes, e os microrganismos variam quanto à sua capacidade de assimi lar o nitrogênio (Quadro 5.1). O produto final de todas as vias de assimilação do nitrogênio é a forma do elemento mais redu zida, a amônia (NH3). Quando está disponível, a NH3 difunde se na maioria das bactérias através de canais transmembrana, como NH3 dissolvida em forma gasosa, em vez do íon amônio (NH4+). A capacidade de assimilar N2 pela redução por NH3, de nominada fixação do nitrogênio, constitui uma propriedade exclusiva dos procariotos, e relativamente poucas bactérias são capazes de quebrar a ligação tripla nitrogênio-nitrogênio. Esse processo (Cap. 6) exige grande quantidade de energia meta bólica e é rapidamente inativado pelo oxigênio. A capacidade de fixação do nitrogênio é observada em bactérias amplamente divergentes que desenvolveram estratégias químicas muito di ferentes para proteger do oxigênio suas enzimas fixadoras de nitrogênio. A maioria dos microrganismos tem a capacidade de utili zar NH3 como única fonte de nitrogênio, e muitos microrga nismos têm a capacidade de produzir NH3 a partir de aminas (R-NH2) ou aminoácidos (RCHNH2COOH), geralmente no modo intracelular. A produção de amônia a partir da desami nação de aminoácidos é denominada amonificação. A amônia é introduzida na matéria orgânica por vias bioquímicas que en volvem o glutamato e a glutamina, discutidas no Capítulo 6. Muitos microrganismos possuem a capacidade de assimi lar nitrato (No;> e nitrito (NO�) reduzindo por conversão es tes íons em NH3* Esses processos são denominados redução assimiladora de nitrato e redução assimiladora de nitrito, respectivamente. Essas vias para assimilação diferem daquelas utilizadas para dissimilação de nitrato e de nitrito. As vias de dissimilação são usadas por organismos que empregam esses

QUADRO 5.1

Fontes de nitrogênio na nutrição

microbiana Composto

Valência de N

N03-

+5

N02-

+3 o -3

R-NH2ª ªR, radical orgânico.

-3

CAPÍTULO 5

íons como aceitantes de elétrons terminais na respiração. Al gumas bactérias autotróficas (p. ex., Nitrosomonas, Nitrobacter spp.) são capazes de converter NH3 em N gasoso em condi 2 ções anaeróbias; este processo é conhecido como denitrifi cação. Nossa compreensão do ciclo do nitrogênio continua a expandir-se. Em meados da década de 1990, a reação anamox foi descoberta. A reação

Cultura de microrganismos

69

sideraminas, e derivados do catecol (p. ex., 2,3-di-hidroxi benzoilserina). Os sideróforos determinados por plasmídeos desempenham importante papel na capacidade de invasão de alguns patógenos bacterianos (Cap. 7). Os mecanismos depen dentes de sideróforo e não dependente de sideróforo de capta ção de ferro pelas bactérias são discutidos no Capítulo 9.

Fatores de crescimento na qual a amônia é oxidada pelo nitrito, é um processo micro biano que ocorre em águas anóxicas dos oceanos e é a maior via pela qual o nitrogênio retorna para a atmosfera.

Fonte de enxofre De modo similar ao nitrogênio, o enxofre é um componente de muitas substâncias orgânicas da célula. Forma parte da es trutura de várias coenzimas e é encontrado nas cadeias laterais cisteinil e metionil das proteínas. O enxofre em sua forma ele mentar não pode ser utilizado por plantas ou animais, mas al gumas bactérias autotróficas são capazes de oxidá-lo em sulfato (S042- ). A maioria dos microrganismos tem a capacidade de utilizar sulfato como fonte de enxofre, reduzindo o sulfato ao nível de sulfeto de hidrogênio (H S). Alguns microrganismos 2 podem assimilar diretamente o H S do meio de crescimento, 2 mas esse composto pode ser tóxico para muitos deles.

Fonte de fósforo O fosfato (P043-) é necessário como componente do ATP, dos ácidos nucleicos e de coenzimas, como NAD, NADP e flavinas. Além disso, muitos metabólitos, lipídeos (fosfolipídeos, lipídeo A), componentes da parede celular (ácido teicoico), alguns polis sacarídeos capsulares e certas proteínas são fosforilados. O fosfa to é sempre assimilado em forma de fosfato inorgânico livre (Pi).

Fontes de minerais Vários minerais são necessários para a função das enzimas. O íon magnésio (Mg2+) e o íon ferroso (Fe2+) também são encon trados em derivados da porfirina: o magnésio na molécula da clorofila e o ferro como parte das coenzimas dos citocromos e das peroxidases. Tanto o Mg2+ quanto o K+ são essenciais para a função e a integridade dos ribossomos. O Ca2+ é necessário como componente das paredes celulares dos microrganismos gram-positivos, embora seja dispensável nas bactérias gram negativas. Muitos organismos marinhos necessitam de Na+ pa ra o seu crescimento. Ao formular-se um meio para a cultura da maioria dos microrganismos, é necessário fornecer fontes de potássio, magnésio, cálcio e ferro, geralmente em forma de seus íons (K+, Mg2+, Ca2+ e Fe2+). Muitos outros minerais (p. ex., Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+ e Zn2+) são necessários; com frequência, podem ser fornecidos através da água potável ou como contaminantes de outros ingredientes do meio. A captação de ferro, que forma hidróxidos insolúveis em pH neutro, é facilitada em muitas bactérias e fungos pela pro dução de sideróforos - compostos que atuam como quelantes do ferro e promovem seu transporte em forma de complexo solúvel, como os hidroxamatos (-CONH 0H), denominados 2

Um fator de crescimento é um composto orgânico de que a célula necessita para crescer, mas o qual ela é incapaz de sin tetizar. Muitos microrganismos, quando supridos com os nu trientes anteriormente citados, são capazes de sintetizar todas as unidades formadoras de macromoléculas (Fig. 5.1), as quais são os aminoácidos; as purinas, pirimidinas e pentoses (os pre cursores metabólicos dos ácidos nucleicos); os carboidratos adicionais (precursores dos polissacarídeos); os ácidos graxos e os compostos isoprenoides. Além disso, os microrganismos de vida livre devem ser capazes de sintetizar as vitaminas comple xas que atuam como precursores de coenzimas. Cada um desses compostos essenciais é sintetizado por uma sequência distinta de reações enzimáticas; cada enzima é produ zida sob o controle de um gene específico. Quando o organismo sofre mutação gênica, resultando em incapacidade funcional de uma dessas enzimas, a cadeia é interrompida, e o produto final não é mais gerado. Em tais circunstâncias, o organismo preci sa obter esse composto a partir do meio ambiente: o composto torna-se um fator de crescimento para o organismo. Tal tipo de mutação pode ser facilmente induzido em laboratório. Diferentes espécies microbianas variam amplamente nas suas necessidades de fatores de crescimento. Os compostos envolvidos são encontrados em todos os organismos, sendo essenciais; as diferenças nas exigências refletem diferenças na capacidade de síntese. Algumas espécies não necessitam de fatores de crescimento, enquanto outras - como alguns lac tobacilos - perderam, durante a evolução, a capacidade de sintetizar até 30 a 40 compostos essenciais, cuja presença no meio de cultura se faz necessária.

FATORES AMBIENTAIS QUE AFETAM O CRESCIMENTO Para ser apropriado, um meio de crescimento deve conter to dos os nutrientes necessários à cultura do microrganismo, e determinados fatores, como pH, temperatura e aeração, pre cisam ser cuidadosamente controlados. Utiliza-se um meio líquido, que pode ser gelificado para finalidades especiais me diante o acréscimo de ágar ou gel de sílica. O ágar, um extrato de polissacarídeo alga marinha, é especialmente apropriado para cultura microbiana por ser resistente à ação microbiana e dissolver-se a lOOºC, porém não se solidifica até ser resfriado abaixo de 45ºC. É possível suspender células em um meio a 45ºC, resfriando-o rapidamente até a obtenção de um gel sem lesionar as células.

Nutrientes Nas páginas anteriores, foi descrita a função de cada tipo de nutriente e apresentada uma lista de substâncias apropriadas.

70

Fundamentos da Microbiologi a

SEÇÃO 1

Blocos de formação

_,_

_ _ _ _ _ _ _ _ _

.,._

_ _ _ _ _

Macromoléculas

Percentual de peso seco em células típicas

H2 0 Aminoácidos

Proteínas

50

Acidas nucleicos

20

Polissacarídeos

10

H2 0 Mononucleotídeos

'

H2 0 Monossacarídeos

� Precursores

isoprenoides

Acetato

Lipídeos

10

D*H2 Ácidos graxos FIGURA 5.1 Síntese macromolecular. A polimerização das unidades formadoras nas macro moléculas é efetuada, em grande parte, pela introdu ção de ligações de anidrido. A formação de graxos a partir do acetato requer várias etapas de redução bioquímica por meio de doadores orgânicos de hidrogênio (D · H2).

Em geral, devem ser fornecidos os seguintes itens: (1) doa dores e aceptores de hidrogênio, cerca de 2 gL; (2) fonte de carbono: cerca de 1 gL; (3) fonte de nitrogênio, cerca de 1 gL; (4) minerais: enxofre e fósforo, cerca de 50 mgL de cada, e oli goelementos, 0,1 a 1 mgL de cada; (5) fatores de crescimento: aminoácidos, purinas e pirimidinas, cerca de 50 mgL de cada; vitaminas, O, 1 a 1 mgL de cada. Para estudos do metabolismo microbiano, geralmente é ne cessário preparar um meio totalmente sintético cujas característi cas e concentrações exatas de cada ingrediente sejam conhecidas, porém é muito mais barato e simples utilizar materiais naturais, como extrato de levedura, digestão de proteínas ou substâncias semelhantes. Os micróbios de vida livre, em sua maioria, cres cem adequadamente em extrato de levedura; já as formas para sitárias podem exigir substâncias especiais, encontradas apenas no sangue ou em extratos de tecidos animais. Todavia, alguns parasitos microbianos (p. ex., Treponema pallidum) que não po dem crescer in vitro só se desenvolvem no interior das células eucarióticas (p. ex., Chlamydia trachomatis). Para muitos microrganismos, um único composto (p. ex., um aminoácido) pode servir como fonte de energia, carbono e nitrogênio; outros necessitam de um composto distinto para cada uma dessas fontes. Se os materiais naturais para meios não sintéticos forem deficientes em qualquer nutriente, deve rão ser suplementados.

Os microrganismos regulam seu pH interno dentro de uma ampla faixa de valores do pH externo. Os microrganismos aci dófilos mantêm um pH interno de cerca de 6,5 com relação a uma faixa externa de 1,0 a 5,0. Os neutralóftlos mantêm um pH interno de cerca de 7,5 em uma faixa externa de 5,5 a 8,5 e os alcalófilos mantêm um pH interno de cerca de 9,5 em uma faixa externa de 9,0 a 1 1 ,0. O pH interno é regulado por um conjunto de sistemas de transporte de prótons na membrana citoplasmática, inclusive uma bomba primária de prótons im pulsionada por ATP e um intercambiador de Na+/H+. Também é sugerida a contribuição de um sistema de troca de K+/H+ na regulação do pH interno dos microrganismos neutralóftlos.

Temperatura

Concentração de íons hidrogênio (pH)

As faixas de temperatura ótima para o crescimento das diferen tes espécies microbianas variam amplamente (Fig. 5.2): as psi crófilas crescem melhor a baixas temperaturas (entre -5 e 15°C) e normalmente são encontradas em ambientes como o Ártico e regiões Árticas; os psicotróficos apresentam uma temperatura ótima de crescimento entre 20 e 30°C, porém não crescem muito bem em temperaturas menores. Eles são importantes causas de contaminação de alimentos*. As mesóftlas crescem mais ade quadamente entre 30e 37ºC; enquanto a maioria das termófilas vive em temperaturas entre 50°C e 60ºC. Alguns microrganis mos são hipertermófilos e podem crescer melhor em tempe ratura de ebulição da água, o que ocorre em condição de alta pressão nas profundezas do oceano. Os microrganismos são, em

A maioria dos microrganismos apresenta uma faixa bastante estreita de pH ótimo, que deve ser determinado empiricamente para cada espécie. A maioria dos microrganismos (neutralófi los) cresce mais adequadamente a um pH de 6,0 a 8,0, embora algumas formas (acidóftlas) tenham um pH ótimo de 3,0, e outras (alcalóftlas) de 10,5.

* N. de R.T. Embora as pisocrotolerantes não crescam muito bem em tem peraturas mais baixas, podem suportar e se manter viáveis a temperatura de refrigeração (-4°C). Assim, importantes em saúde pública por conta minarem alimentos como carnes e derivados; leite e derivados; vegetais e frutas mantidas em refrigeração (p. ex., Salmonella, Yersinia, Listeria e Staphylococcus).

CAPÍTULO 5

Cultura de microrganismos

71

Ótimo

i

Termórfilo

Mesófilo

Hipertermófilo

t

Psicrotófico

-10

o

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110 120

Temperatura (ºC) FIGURA 5.2 Temperatura necessária para o crescimento. Os pro cariontes são comumente classificados em cinco grupos baseados na temperatura ótima de crescimento. Nota-se que a temperatura ótima de crescimento, no ponto em que a taxa de crescimento é maior está próxima do limite superior da faixa de crescimento. (Reproduzida, com autorização, de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [edi tors]: Microbiology: A Human Perspective, 6th ed. MacGraw-Hill, 2009, p. 91. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

sua maioria, formas mesófilas; a temperatura de 30ºC é ótima para muitas formas de vida livre, enquanto a temperatura cor poral do hospedeiro é ideal para os simbiontes de animais de sangue quente. A extremidade superior da faixa de temperatura tolerada por qualquer espécie correlaciona-se bem com a termoestabili dade geral das proteínas dessa espécie, conforme determinado em extratos celulares. Os microrganismos compartilham com as plantas e os animais a resposta de choque térmico, isto é, a síntese transitória de um conjunto de "proteínas de choque tér mico" (heat-shock proteins) quando expostos a uma súbita ele vação da temperatura acima do ideal para o crescimento. Essas proteínas parecem notavelmente termorresistentes e capazes de estabilizar as proteínas termossensíveis da célula. A relação entre a velocidade de crescimento e a tempera tura em determinado microrganismo pode ser observada em um gráfico típico de Arrhenius (Fig. 5.3). Este físico sueco mostrou que o logaritmo da velocidade de qualquer reação química (log k) é uma função linear da recíproca da tempera tura (1/1); como o crescimento celular resulta de um conjun to de reações químicas, pode-se esperar esse tipo de relação. A Figura 5.3 demonstra ser esse o caso na faixa normal de tem peraturas para determinada espécie: o log k diminui linear mente com 1/T. Todavia, acima e abaixo da faixa normal, o log k cai rapidamente, de modo que os valores máximo e mínimo de temperatura são definidos. Além de terem efeitos sobre a velocidade do crescimento, os extremos de temperatura matam os microrganismos. O ca lor extremo é utilizado para esterilizar preparações (Cap. 4); o frio extremo também mata as células microbianas, embora não possa ser utilizado com segurança para esterilização. As bacté rias também exibem um fenômeno denominado choque pelo frio: a destruição de células por resfriamento rápido em vez de lento. Por exemplo, o resfriamento rápido da Escherichia coli, de

Alta temperatura

Temperatura normal

Baixa temperatura

1/T (ºK) FIGURA 5.3 Forma geral de um gráfico de Arrhenius para o cres cimento bacteriano. (Reproduzida, com autorização, de lngraham JL: Growth of psychrophilic bacteria,J Bacteriol July 76(1):75-80, 1958.)

37ºC para 5ºC, pode matar 90% das células. Diversos compostos protegem as células do congelamento ou do choque pelo frio; o glicerol e o dimetil sulfóxido são os mais comumente utilizados.

Aeração O papel do oxigênio como aceptor de hidrogênio é discutido no Capítulo 6. Muitos microrganismos são aeróbios obrigatórios, e exigem especificamente a presença de oxigênio como aceptor de hidrogênio; alguns são anaeróbios facultativos, isto é, têm a capacidade de viver em condições de aerobiose ou anaerobiose; e outros são anaeróbios obrigatórios, exigindo outra substância diferente do oxigênio como aceptor de hidrogênio, e sendo sen síveis à inibição pelo oxigênio. Alguns microrganismos também podem ser microaerófilos, necessitando de uma concentração reduzida de oxigênio (2-10%) para seu metabolismo aeróbio (concentrações maiores são inibitórias)*; ou ainda anaeróbios aerotolerantes, que suportam a presença do oxigênio, porém não o utiliza como aceptor de hidrogênio (Fig. 5.4). Os subprodutos naturais do metabolismo aeróbio são os compostos reativos peróxido de hidrogênio (H202) e superó xido de hidrogênio (02- ). Na presença de ferro, essas duas es pécies podem produzir radicais hidroxila (*OH), passíveis de lesionar qualquer macromolécula biológica:

* N. de R.T. Em geral, microrganismos microaeróftlos também crescem melhor quando n i cubados a 5% de C02 (capnoftlia). Essa condição pode ser obtida incubando as placas semeadas em uma jarra com uma vela ace sa, que depois é colocada na estufa. Quando a chama consumir o oxigênio necessário para manter a combustão, o C02 produzido no interior da jarra manterá a condição de capnofilia.

72

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

Aeróbio obrigatório

Anaeróbio facultativo

Anaeróbio obrigatório

Microaerófilo

Aerotolerantes

Bactéria Bactéria *

*****

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Catalase, Superóxido dismutase

Ausência tanto de catalase quanto de superóxido dismutase

.

. . .. . . . . . . *

.

Enzimas celulares para a detoxificação do 02

Catalase: 2H202 --+ 2H20 + 02 Superóxido dismutase: 202- + 2H+--+ 02 + H202

Pequena concentração de catalase e de superóxido dismutase

Superóxido dismutase

FIGURA 5.4 Necessidade de oxigênio (02) pelos procariontes. (Reproduzida, com autorização, de Nester EW, Andersen DG, Roberts CE, Nester MT [editors]: Microbiology: A Human Perspective, 6th ed. McGraw-Hill, 2009, p. 92. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

Muitos aeróbios e anaeróbios aerotolerantes são protegidos desses produtos pela presença da superóxido dismutase, enzi ma que catalisa a reação 202- + 2H+ � 02 + H202 e pela presença da catalase, enzima que catalisa a reação 2H202 � 2H20 + 02 Alguns microrganismos fermentativos (p. ex., Lactobacillus plantarum) são aerotolerantes, mas não contêm catalase sem superóxido dismutase. O oxigênio não é reduzido e, por con seguinte, não há produção de H202 e 02- . Todos os anaeróbios estritos não têm superóxido dismutase nem catalase. Alguns microrganismos anaeróbios (p. ex., Peptococcus anaerobius) têm considerável tolerância ao oxigênio em virtude de sua ca pacidade de produzir altos níveis de uma enzima (NADH oxi dase) que reduz o oxigênio a água de acordo com a reação NADH + H+ + Y202 � NAD+ + H20 O peróxido de hidrogênio deve grande parte de sua toxicida de à lesão que provoca no DNA. Os mutantes com deficiência de reparo do DNA são excepcionalmente sensíveis ao peróxido de hidrogênio; constatou-se que o produto do gene recA, que atua tanto na recombinação quanto no reparo genéticos, é mais im portante que a catalase ou a superóxido dismutase na proteção da E. coli contra a toxicidade do peróxido de hidrogênio. O suprimento de ar a culturas de aeróbios constitui um sério problema técnico. Em geral, os recipientes são agitados mecani camente para introduzir oxigênio no meio, ou o ar é forçado atra vés do meio de cultura por pressão. Com frequência, a difusão de oxigênio torna-se o fator limitante no crescimento das bactérias aeróbias; quando a concentração celular atinge 4 a 5 x 109/mL, a velocidade de difusão do oxigênio para as células limita acentua damente a velocidade do crescimento posterior. Já os anaeróbios obrigatórios apresentam o problema da exclusão do oxigênio. Existem muitos métodos para isso: podem-se acrescentar agentes redutores, como o tioglicato de sódio, as culturas líquidas; os tubos de ágar podem ser selados com uma camada de petrolato e parafina; o recipiente de cul tura pode ser colocado em outro recipiente a partir do qual o oxigênio é removido por evacuação ou por meios químicos; ou

o microrganismo pode ser manipulado dentro de uma câmara anaeróbia por mãos enluvadas.

Força iônica e pressão osmótica Pode ser necessário controlar, em menor grau, certos fatores, como a pressão osmótica e a concentração de sal. Para a maio ria dos microrganismos, as propriedades dos meios comuns são satisfatórias; entretanto, para as formas marinhas e os mi crorganismos adaptados ao crescimento em soluções ricas em açúcar, por exemplo, é preciso considerar esses fatores. Os mi crorganismos que necessitam de altas concentrações de sal são denominados halofílicos, enquanto os que necessitam de altas pressões osmóticas chamam-se osmofílicos. A maioria das bactérias é capaz de tolerar ampla faixa de pressões osmóticas externas e de forças iônicas em virtude de sua capacidade de regular a osmolalidade e a concentração iônica internas. A osmolalidade é regulada pelo transporte ativo de íons K+ no interior da célula; a força iônica interna é mantida cons tante pela excreção compensatória de uma poliamina orgânica de carga positiva, a putrescina. Como a putrescina possui várias cargas positivas por molécula, obtém-se uma acentuada queda da força iônica com pequeno custo na força osmótica.

MÉTODOS DE CULTURA Dois problemas devem ser considerados: a escolha de um meio de cultura apropriado e o isolamento de um microrganismo bacteriano em cultura pura.

O meio de cultura A técnica utilizada e o tipo de meio escolhido dependem da na tureza da investigação. Em geral, podem ser encontradas três situações: (1) pode haver necessidade de cultivar um grupo de células de uma determinada espécie disponível; (2) pode haver a necessidade de certo número e dos tipos de microrganismos presentes em determinado material; ou (3) pode-se desejar iso lar determinado tipo de microrganismo de uma fonte natural. A. Crescimento de células de determinada espécie

Os microrganismos cujo crescimento no ambiente natural podem ser observados ao microscópio podem exibir extrema

CAPÍTULO 5

dificuldade de crescer em cultura pura em um meio artificial. Por exemplo, certas formas parasitárias nunca foram cultiva das fora do hospedeiro. Todavia, em geral pode-se preparar um meio apropriado com a cuidadosa reprodução das condi ções encontradas no ambiente natural do microrganismo. É simples reproduzir o pH, a temperatura e a aeração; os nutrien tes constituem o principal problema. A contribuição feita pelo ambiente vivo é importante e difícil de analisar; assim, um pa rasito pode necessitar de um extrato do tecido do hospedeiro, enquanto uma forma de vida livre pode exigir uma substância excretada por um microrganismo ao qual está associada na na tureza. Pode ser necessária considerável experimentação para determinar as necessidades do microrganismo, de modo que o sucesso irá depender do suprimento de uma fonte apropriada de cada categoria de nutriente relacionada no início deste capí tulo. A cultura de parasitos obrigatórios, como as riquétsias, é discutida no Capítulo 27.

B. Exame microbiológico de materiais naturais Um material natural pode conter muitos microambientes dis tintos, proporcionando, cada qual, um nicho para uma espécie diferente. A semeadura de amostra do material em determina do conjunto de condições irá permitir que um grupo selecio nado de formas produza colônias, mas fará com que muitos outros tipos passem despercebidos. Por essa razão, é habitual semear amostras do material em diferentes meios e condições de incubação. Seis a oito condições diferentes de cultura não representam um número exagerado quando se pretende des cobrir a maioria das formas presentes. Como cada tipo de microrganismo presente deve ter a opor tunidade de crescer, são utilizados meios sólidos, e evita-se a aglomeração de colônias. Caso contrário, a competição irá impe dir a formação de colônias por alguns tipos de microrganismo.

C. Isolamento de determinado tipo de microrganismo Uma pequena amostra de solo, quando processada adequada mente, irá produzir um tipo diferente de microrganismo para cada microambiente presente. No caso de solo fértil (úmido, arejado, rico em minerais e matéria orgânica), isso significa a possibilidade de isolar centenas ou mesmo milhares de tipos de microrganismo. Esse isolamento é efetuado ao selecionar se o tipo desejado. Por exemplo, inocula-se 1 g de solo em um recipiente com meio líquido preparado com a fmalidade de favorecer determinado tipo de microrganismo, por exemplo, fixadores aeróbios de nitrogênio (Azotobacter). Nesse caso, o meio não contém nitrogênio combinado, sendo incubado em condições aeróbias. Se houver Azotobacter no solo, as células irão crescer bem nesse meio; as formas incapazes de filar o nitrogênio só irão crescer à medida que o solo tiver introduzi do nitrogênio filado contaminante no meio. Por conseguinte, quando a cultura estiver totalmente desenvolvida, a porcenta gem de Azotobacter na população total terá aumentado acentua damente; por esse motivo, o método é denominado cultura de enriquecimento. A transferência de uma amostra dessa cultura para um novo meio irá resultar em maior enriquecimento de Azotobacter; depois de várias transferências seriadas, a cultura poderá ser semeada em meio sólido de enriquecimento, po dendo isolar colônias de Azotobacter.

Cultura de microrganismos

73

Deve-se utilizar um meio líquido para permitir a competi ção e, portanto, a seleção ideal, mesmo quando o tipo desejado é representado no solo em forma de apenas algumas células em uma população de milhões. Pode-se tirar proveito do "enrique cimento natural". Assim, por exemplo, na pesquisa de oxidan tes do querosene, escolhe-se um solo carregado de óleo, visto que se trata de um meio de enriquecimento para essas formas. A cultura de enriquecimento, portanto, constitui um proce dimento pelo qual o meio é preparado de modo a reproduzir o ambiente natural ("nicho") do microrganismo desejado, levando à sua seleção. Um princípio importante envolvido nesta seleção é o seguinte: o microrganismo selecionado será do tipo cuja ne cessidade nutricional for dificilmente satisfeita. O Azotobacter, por exemplo, cresce melhor em um meio de cultura que conte nha nitrogênio orgânico, porém sua exigência mínima consiste na presença de N2; por conseguinte, ele será selecionado em um meio que contenha N2 como única fonte de nitrogênio. Se for acrescentado nitrogênio orgânico ao meio, as condições não irão selecionar mais Azotobacter, mas uma forma cuja exigência mí nima seja a presença de nitrogênio orgânico. Ao pesquisar um determinado tipo de microrganismo, que é parte de uma população mista, meios seletivos e diferenciais devem ser usados. Os meios seletivos inibem o crescimento de diferentes microrganismos, permitindo o crescimento dos mi crorganismos desejáveis. Por exemplo, o ágar Thayer-Martin usado no isolamento de Neisseria gonorrhoeae (agente etio lógico da gonorreia) de um espécime clínico. Os meios dife renciais contêm substâncias que podem ser metabolizadas ou não pelos microrganismos, permitindo a distinção entre eles. Por exemplo, as colônias de E. coli exibem um brilho metá lico característico em ágar que contenha os corantes eosina e azul de metileno (ágar-EMB). O ágar-EMB, que contém alta concentração de um açúcar, fará com que os microrganismos que fermentam esse açúcar formem colônias avermelhadas. São utilizados meios diferenciais para certos propósitos, como a identificação de bactérias entéricas em água ou leite e a pre sença de determinados patógenos em amostras clínicas. O Quadro 5.2, apresenta vários exemplos de condições de cultura de enriquecimento, bem como os tipos de bactérias que elas irão selecionar. Contudo, a despeito dos melhores esfor ços, muitos ambientes contêm várias bactérias não cultivadas.

Isolamento de microrganismos em cultura pura Para se estudarem as propriedades de determinado microrga nismo, é necessário manipulá-lo em uma cultura pura livre de todos os outros tipos de microrganismos. Para isso, é necessário isolar uma única célula de todas as demais; essa célula isolada deve ser cultivada de modo que sua progênie coletiva também permaneça isolada. Existem vários métodos disponíveis.

A. Semeadura em placa Diferentemente das células em meio líquido, as células em meio sólido ou sobre ele ficam imobilizadas. Desse modo, se for colocado um número suficiente de células sobre, ou dentro do meio sólido, cada célula irá crescer, formando uma colônia isolada. O agente sólido ideal para a maioria dos meios de cul tura microbiológica é o ágar, um polissacarídeopolissacarídeo

74

SEÇÃO 1

QUADRO 5.2 Fonte de nitrogênio

Fundamentos da Microbiologia Alguns meios de cultura enriquecidos Fonte de carbono

Atmosfera

Iluminação

Aeróbia ou anaeróbia Álcool, ácidos graxos, etc. Glicose

Álcool, ácidos graxos, etc. Glicose

Álcool, ácidos graxos, etc. Glicose

Organismo predominante inicialmente enriquecido

Escura

Nenhum

Luz

Cianobactérias

Anaeróbia

Escura

Nenhum

Ar

Escura

Azotobacter

Anaeróbia

Escura

Clostridium pasteurianum

Ar

Escura

Azotobacter

Aeróbia ou anaeróbia

Escura

Nenhum

Luz

Algas verdes e cianobactérias

Anaeróbia

Escura

Desnitrificadores

Ar

Escura

Aeróbios

Anaeróbia

Escura

Fermentadores

Ar

Escura

Aeróbios

Anaeróbia

Escura

Nenhum

Aeróbia

Escura

Nitrosomonas

Aeróbia ou anaeróbia

Luz

Algas verdes e cianobactérias

Anaeróbia

Escura

Redutores de sulfato ou de carbonato

Aeróbia

Escura

Aeróbios

Anaeróbia

Escura

Fermentadores

Aeróbia

Escura

Aeróbios

Nota: componentes de todos os meios: MgS04, K2HP04, FeCl3, CaCl2, CaC03 e oligoelementos.

ácido extraído de determinadas algas vermelhas. Uma suspen são a 1,5 a 2% em água é dissolvida a lOOºC, formando uma solução transparente que se solidifica a 45ºC. Por conseguinte, uma solução estéril de ágar pode ser resfriada a 50ºC; em segui da, são adicionadas bactérias ou outras células microbianas, e depois a solução é rapidamente resfriada abaixo de 45ºC para formar um gel. (Embora as células microbianas sejam, em sua maioria, destruídas a 50ºC, o tempo necessário para o processo de morte é suficientemente lento a essa temperatura para pos sibilitar o procedimento; ver a Fig. 4.3.) Uma vez solidificado, o ágar não se liquefaz novamente até ser aquecido acima de SOºC, de modo que qualquer temperatura apropriada à incuba ção de uma cultura microbiana pode ser utilizada subsequente mente. No método de semeadura em profundidade (método de pour-plate), uma suspensão de células é misturada com ágar liquefeito a 50ºC e distribuída em uma placa de Petri. Quando o ágar se solidifica, as células são imobilizadas no ágar e cres cem em colônias. Se a suspensão de células tiver sido diluída o suficiente, as colônias ficarão bem separadas, de modo que cada uma delas terá alta probabilidade de originar-se de uma única célula (Fig. 5.5). Entretanto, para se ter certeza disso, é necessário escolher uma colônia do tipo desejado, suspendê-la em água e semeá-la novamente. A repetição desse procedimen to várias vezes irá garantir a obtenção de uma cultura pura. Uma alternativa consiste em semear a suspensão original em placa de ágar com alça de metal (técnica da placa estriada). À medida que se procede a isso, o número de células deixa das na alça torna-se cada vez menor, de modo que, fmalmente, a alça poderá depositar células isoladas no ágar (Fig. 5.6). A placa

é incubada, e qualquer colônia bem isolada é removida, suspensa novamente em água e mais uma vez semeada na superfície do ágar. Se uma suspensão (e não apenas um pequeno crescimento de uma colônia ou de material em tubo inclinado) for semeada com alça, esse método será tão confiável quanto o método de semeadura em profundidade, além de ser muito mais rápido. Na técnica de semeadura por espalhamento, um pequeno volume da suspensão microbiana diluída contendo cerca de 30 a 300 células é transferido para o centro de uma placa de ágar e espalhado igualmente sobre a superfície com uma alça de vidro estéril*. As células dispersas desenvolvem-se em colô nias isoladas. Uma vez que o número de colônias deve ser igual ao número de organismos viáveis em uma amostra, pode-se usar as placas semeadas para contar a população microbiana.

B. Diluição Um método muito menos confiável consiste em diluição até a extinção. A suspensão é diluída de modo seriado e faz-se a semeadura de amostras de cada diluição. Se apenas algumas amostras de determinada diluição exibirem crescimento, pre sume-se que algumas dessas culturas foram iniciadas a partir de células isoladas. Tal método só deverá ser utilizado se a semeadura em placas for, por algum motivo, impossível. Um aspecto indesejável desse método é que ele só pode ser utiliza do para isolar o tipo predominante de microrganismo em uma população mista. * N. de R.T. As alças de vidro empregadas em semeadura microbiológica também sao conhecidas como alças de Drigalski.

CAPÍTULO 5 1 ,0 mL

9 m L de H20

Amostra original

1 ,0 mL

1 ,0 mL

(diluição 10-1)

9 mL de H20

(diluição 10-2)

Cultura de microrganismos

75

1 ,0 mL

9 mL de H20

(diluição 1 Q-3)

9 mL de H20

(diluição 10-4)

Misturar com ágar morno e verter na placa *

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FIGURA 5.5 Técnica de semeadura em profundidade (método de pour-plate). A amostra original é diluída diversas vezes, a fim de reduzir a população. As amostras mais diluídas são misturadas com ágar morno e vertidas em placas de Petri. As células isoladas crescem em colônias e são usadas para a obtenção de colônias puras. As colônias de superfície são circulares; as colônias imersas no ágar são lenticulares (em forma de lente). (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley & Klein's Microbiology, 7th ed., McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

Nota: este método só funciona se a ferramenta usada para a semeadura (geralmente uma alça de inoculação) for reesterilizada após cada um dos passos 1 a 4.

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A Passos da técnica da placa estriada.

B

FIGURA 5.6 Técnica da placa estriada. (A) Um típico padrão de semeadura. (Reproduzida, com autorização de Willey JM, Sherwood CJ, Wool verton CJ: Prescott, Harley, & Klein's Microbiology, 7th ed., McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, lnc.) (B) Um exemplo de placa estriada. (Reproduzida, com autorização, de Kathy Park Talaro.)

RESUMO DO CAPÍTULO *

Todos os organismos necessitam de compostos orgânicos e inorgânicos necessários para o seu crescimento. Os nu trientes são classificados de acordo com os elementos que eles fornecem, incluindo fontes de carbono, de nitrogênio, de fósforo, de enxofre e de sais minerais.

*

*

Fatores de crescimento são compostos orgânicos que as células necessitam para o seu desenvolvimento, porém são incapazes de sintetizá-los. É necessária uma fonte de energia para manter uma força motriz de prótons e para permitir a síntese de macromolé culas. Há três principais mecanismos de metabolismo cata bólico: fermentação, respiração e fotossíntese.

SEÇÃO 1

76

*

*

*

Fundamentos da Microbiologia

Fatores ambientais, tais como pH, temperatura e aeração são importantes para o crescimento microbiano. A maioria dos patógenos humanos neutrófilos (cresce melhor em pH 6,0 a 8,0) e mesófilos (cresce melhor entre 30 e 37°C). Os organismos variam enormemente na sua habilidade de usar o oxigênio como aceptor de hidrogênio e pela sua capacidade de inativar produtos tóxicos do metabolismo aeróbio. Eles podem ser agrupados como: aeróbios obri gatórios, anaeróbios obrigatórios, anaeróbios facultativos, microaerófilos e aerotolerantes. Os meios microbiológicos são formulados para permitirem o crescimento de diferentes espécies bacterianas (meio en riquecido), distinguir entre as espécies presentes em uma amostra (meio diferencial) ou isolar um organismo presen te em uma amostra mista (meio seletivo).

QUESTÕES DE REVISÃO 1. A maior parte dos microrganismos patogênicos para seres hu manos cresce melhor em laboratório quando incubada a (A) (B) (C) (D) (E)

15 a 20ºC 20 a 30ºC 30 a 37ºC 38 a 50ºC 50 a 55ºC

2. O processo pelo qual os microrganismos formam ATP durante a fermentação da glicose é caracterizado por (A) Acoplamento da produção de ATP com a transferência de elétrons (B) Desnitrificação (C) Redução do oxigênio (D) Fosforilação do substrato (E) Respiração anaeróbia 3. Qual das seguintes técnicas de cultura e meios pode enumerar o maior número de espécies microbianas em uma amostra de solo? (A) (B) (C) (D) (E)

Cultura de enriquecimento Placa de meio seletivo Placa de meio diferencial Tubo com caldo nutriente Diferentes meios de cultura e diferentes condições de incu bação

4. A polimerização das unidades formadoras (p. ex., aminoácidos) em macromoléculas (p. ex., proteínas) é grandemente alcançada por (A) (B) (C) (D) (E)

Desidratação Redução Oxidação Assimilação Hidrólise

5. Uma cepa de E. coli sofre mutação que a impede de crescer bem em um meio que contenha glicose, sais minerais e cloreto de amônio. Entretanto, a cepa será capaz de crescer nesse meio se for adicionada metionina, referida como (A) (B) (C) (D) (E)

Um sal inorgânico Uma fonte de enxofre Um fator de crescimento Uma fonte de energia Uma fonte de nitrogênio

6. Qual das seguintes alternativas NÃO é um exemplo de metabo lismo catabólico realizada por microrganismos? (A) (B) (C) (D) (E)

Fermentação Síntese proteica Respiração Fotossíntese C eD

7. Qual dos seguintes termos melhor descreve um microrganismo que cresce a 20°C? (A) (B) (C) (D) (E)

Neutrófilo Psicrófilo Mesófilo Osmófilo Termófilo

8. A habilidade de assimilar N2 via NH3 é denominada: (A) (B) (C) (D) (E)

Amonificação Anammox (oxidação anaeróbia de amônia) Redução do nitrato Deaminação Fixação do nitrogênio

9. Qual das seguintes moléculas NÃO é absorvida pelas células eu cariontes? (A) (B) (C) (D) (E)

Glicose Lactato Sulfato (SOi-) Nitrogênio (N2) Fosfato (PO�-)

10. As bactérias que são patógenos humanos intracelulares obrigató rios (p. ex., Chlamydia trachomatis) são consideradas: (A) (B) (C) (D) (E)

Autotróficas Fotossintéticas Quimiolitotróficas Hipertermófilas Heterotróficas

Respostas 1. e

4. A

7. B

2. D

5. e

8. E

3. E

6. B

9. D

10. E

REFERÊNCIAS Adams MW: Enzymes and proteins from organisms that grow near or above lOOºC. Annu Rev Med 1993;47:627. Koch AL: Microbial physiology and ecology ofslow growth. Microbial Molec Biol Rev 1997;61:305. Maier RM, Pepper IL, Gerba CP: Environmental Microbiology. Aca demic Press, 1992. Marzlut GA: Regulation of sulfur and nitrogen metabolism in fila mentary fungi. Annu Rev Microbiol 1993;42:89. Pelczar MJ Jr, Chan ECS, Krieg NR: Microbiology: Concepts and Ap plications. McGraw-Hill, 1993. Schloss PD, Handelsman J: Status of the microbial census. Microbial Molec Biol Rev 2004;68:686. Wood JM: Bacterial osmoregulation: A paradigm for the study of cel lular homeostasis. Annu Rev Microbiol 2011;65:215.

C A P Í T U L O

Metabolismo microbiano

O PAPEL DO METABOLISMO NA BIOSSÍNTESE E NO CRESCIMENTO O crescimento microbiano exige a polimerização das subuni dades bioquímicas em proteínas, ácidos nucleicos, polissaca rídeos e lipídeos. As subunidades precursoras precisam estar pré-formadas no meio ou devem ser sintetizadas pelas células em crescimento. A necessidade de coenzimas que participam na catálise enzimática constitui uma demanda adicional de biossíntese. As reações de polimerização nos processos de bios síntese exigem a transferência das ligações de anidrido a partir da adenosina trifosfato (ATP). O crescimento requer uma fon te de energia metabólica para a síntese das ligações de anidrido, bem como manutenção dos gradientes transmembrana de íons e metabólitos. O metabolismo apresenta dois componentes: o catabo lismo e o anabolismo (Fig. 6.1). O metabolismo catabólico engloba processos de obtenção de energia, liberada pela cliva gem de diferentes compostos (p. ex., glicose), que é usada para síntese de ATP. O metabolismo anabólico, ou de biossíntese inclui processos que utilizam a energia armazenada no ATP para sintetizar e montar as subunidades das macromoléculas que compõem a célula. A sequência das subunidades em uma macromolécula é deter minada de duas maneiras. Nos ácidos nucleicos e nas proteínas, a sequência é dirigida por um modelo: o DNA atua como modelo para sua própria síntese e a síntese dos vários tipos de RNA; o RNA mensageiro serve de modelo para a síntese das proteínas. Já nos carboidratos e lipídeos, a disposição das subunidades é totalmente determinada por especificidades enzimáticas. Uma vez sintetizadas, as macromoléculas organizam-se para formar as estruturas supramoleculares da célula, como, por exemplo, ribos somos, membranas, parede celular, flagelos e pili. A velocidade da síntese macromolecular e a atividade das vias metabólicas precisam ser reguladas, de modo que a bios síntese seja equilibrada. Todos os componentes necessários à síntese macromolecular devem estar presentes para que o cres cimento seja ordenado, e o controle tem de ser exercido para que as reservas das células não sejam consumidas em produtos que não contribuem para o crescimento ou a sobrevida. Este capítulo faz uma revisão sobre o metabolismo micro biano e sua regulação. Os microrganismos representam extre mos de divergência evolutiva, encontrando enorme variedade de rotas metabólicas dentro desse grupo. Assim, por exemplo, qualquer uma de mais de meia dúzia de vias metabólicas dife rentes pode ser utilizada para a assimilação de um composto

relativamente simples, como o benzoato, e uma única via para a assimilação do benzoato pode ser regulada por qualquer um de mais de meia dúzia de mecanismos de controle. O objetivo é ilustrar os princípios subjacentes às vias metabólicas e sua re gulação. O princípio básico que determina as vias metabólicas é que elas sejam seguidas mediante a organização de um nú mero relativamente pequeno de reações bioquímicas em uma sequência específica. Muitas vias de biossíntese podem ser de duzidas pela verificação das estruturas químicas das substâncias de partida, do produto final e, talvez, de um ou dois interme diários metabólicos. O princípio básico subjacente à regulação metabólica consiste no fato de que as enzimas tendem a atuar apenas quando sua atividade catalítica se faz necessária. A ati vidade de uma enzima pode ser modificada ao variar-se a sua quantidade ou a do substrato. Em alguns casos, a atividade das enzimas pode ser alterada pela ligação de efetores específicos - metabólitos que modulam a atividade enzimática.

METABÓLITOS FOCAIS E SUAS INTERCONVERSÕES lnterconversões de gl icose-6-fosfato e carboidratos As origens da biossíntese das subunidades que formam as macromoléculas e as coenzimas podem ser rastreadas até aos precursores denominados metabólitos focais. As Figuras 6.2 a 6.5 ilustram como os respectivos metabólitos focais (gli cose-6-fosfato ( G6PD ), fosfoenolpiruvato, oxaloacetato e a-ketoglutarato) dão origem a maioria dos produtos finais da biossíntese. A Figura 6.2 ilustra como a G6PD é convertida em uma série de produtos finais de biossíntese através de ésteres de fos fato de carboidratos com cadeias de diferentes comprimentos. Os carboidratos possuem a fórmula empírica (CH20)n, e o ob jetivo primeiro de seu metabolismo é modificar o valor de n, o comprimento da cadeia de carbonos. Os mecanismos pelos quais os comprimentos das cadeias de fosfatos de carboidratos são interconvertidos encontram-se resumidos na Figura 6.6. Em um caso, são utilizadas reações oxidativas para remover um único carbono da G6PD, produzindo-se o derivado de pentose, a ribulose-5-fosfato. As reações da isomerase e da epimerase interconvertem as formas bioquímicas mais comuns das pen toses: ribulose-5-fosfato, ribose-5-fosfato e xilulose-5-fosfato. As transcetolases transferem um fragmento de dois carbonos

78

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

CATABOLISMO

ANABOLISMO

Fonte energética

(glicose) .__�� -'--������-Estruturas celulares

(Parede celular, membrana, ribossomos, estruturas de superfície) Energia Macromoléculas

(Proteínas, ácidos nucleicos) Energia Subunidades

(aminoácidos, nucleotídeos)

Energia Precursores

Dejetos metabólitos

(Ácidos, dióxido de carbono)

Nutrientes

(Fonte de nitrogênio, enxofre, etc.)

FIGURA 6.1 A relação entre o metabolismo catabólico e o anabó lico. O catabólico compreende processos que, pela clivagem de com postos, resultam na liberação de energia usada na síntese de adenosina trifosfato (ATP); além de precursores metabólicos usados na biossínte se. O anabólico ou a biossíntese incluem processos que utilizam ATP e os precursores metabólicos para sintetizar e montar as subunidades das macromoléculas que constituem a célula. (Reproduzida, com auto rização, de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [editors]: Microbiology: A Human Perspective, 6th ed. McGraw-Hill, 2009, p. 127. © The McGraw-Hill Companies, lnc.).

de um doador para uma molécula aceptora, reações que pos sibilitam às pentoses formar ou serem formadas a partir de carboidratos com cadeias de comprimentos variáveis. Como mostra a Figura 6.6, duas pentoses-5-fosfato (n 5) são inter conversíveis com a triose-3-fosfato (n 3) e com a heptose-7fosfato (n 7); a pentose-5-fosfato (n 5) e a tetrose-4-fosfato (n 4) são interconversíveis com a triose-3-fosfato (n 3) e a hexose-6-fosfato (n 6). A cadeia hexose de seis carbonos da frutose-6-fosfato pode ser convertida em dois derivados triose de três carbonos pela ação consecutivamente de uma quinase e uma aldolase sobre a frutose-6-fosfato. Como alternativa, podem ser utilizadas aldo lases, que atuam em conjunto com fosfatases, para aumentar o comprimento das moléculas dos carboidratos: as trioses-fos fato dão origem à frutose-6-fosfato; uma triose-fosfato e uma tetrose-4-fosfato formam heptose-7-fosfato. A forma final da interconversão do comprimento das cadeias de carboidratos é a reação da transaldolase, que interconverte a heptose-7-fosfa to e a triose-3-fosfato em tetrose- 4-fosfato e hexose-6-fosfato. A coordenação das diferentes reações de rearranjo dos car boidratos, para atingir um objetivo metabólico global, é ilus trada pela derivação da hexose-monofosfato (Fig. 6.7), ciclo metabólico utilizado pelas cianobactérias para a redução do nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) em nicotinamida =

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adenina dinucleotídeo reduzido (NADH), que atua como re dutor para a respiração no escuro. Muitos microrganismos utilizam o derivado de hexose monofosfato para reduzir a ni cotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+) em nico tinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido (NADPH), utilizado em reações de redução biossintéticas. As primeiras etapas na derivação da hexose-monofosfato são as reações oxi dativas que encurtam seis hexoses-6-fosfato (abreviadas como 6 C6 na Fig. 6.7) em seis pentoses-5-fosfato (abreviadas co mo 6 C5). As reações de rearranjo dos carboidratos convertem as seis moléculas C5 em cinco moléculas C6 de modo que o ciclo oxidativo possa continuar. Evidentemente, todas as reações de interconversão de comprimentos de cadeias de carboidratos não atuam ao mes mo tempo. A seleção de conjuntos específicos de enzimas, essencialmente a determinação da via metabólica tomada, é condicionada pela fonte de carbono e pelas necessidades de biossíntese da célula. Assim, por exemplo, a célula que rece be uma triose-fosfato como fonte de carboidrato utilizará a combinação aldolase-fosfatase para formar frutose-6-fosfato; a quinase que atua sobre a frutose-6-fosfato na sua conversão em triose-fosfato não seria ativa nessas circunstâncias. Se as necessidades de pentose-5-fosfato forem altas, como no caso da assimilação fotossintética de dióxido de carbono, as trans cetolases que poderão dar origem a pentoses-5-fosfato serão muito ativas. Em suma, a G6PD pode ser considerada um metabólito fo cal, visto que atua tanto como precursor direto de subunidades metabólicas quanto como fonte de carboidratos de compri mento variável, utilizados para fins de biossíntese. A própria G6PD pode ser produzida a partir de outros carboidratos fos forilados pela seleção de vias a partir de um conjunto de rea ções para interconversão de comprimentos de cadeias. As reações escolhidas são determinadas pelo potencial genético da célula, pela fonte primária de carbono e pelas necessidades de biossíntese do microrganismo. É necessário haver uma regula ção metabólica para garantir a escolha das reações que suprirão as demandas do organismo.

Formação e utilização do fosfoenolpiruvato As trioses-fosfato formadas pela interconversão de fosfoés teres de carboidratos são convertidas em fosfoenolpiruvato pela série de reações mostradas na Figura 6.8. A oxidação do gliceraldeído-3-fosfato pelo NAD+ é acompanhada pela for mação da ligação acilfosfato no carbono 1 do 1,3-difosfoglice rato. Esse anidrido-fosfato acilfosfato é transferido mediante a fosforilação do substrato em adenosina difosfato (ADP), produzindo uma ligação rica em energia (ATP). Outra ligação fosfato rica em energia é formada pela desidratação do 2-fos foglicerato em fosfoenolpiruvato; por meio de outra fosfori lação de substrato, o fosfoenolpiruvato pode doar a ligação rica em energia ao ADP com a consequente formação de ATP e piruvato. Por conseguinte, podem ser obtidas duas ligações ricas em energia do ATP pela conversão metabólica da triose fosfato em piruvato. Trata-se de um processo oxidativo, e, na ausência de um aceptor exógeno de elétrons, o NADH gera do pela oxidação do gliceraldeído-3-fosfato deve ser oxidado em NAD+ pelo piruvato ou por metabólitos derivados a partir do piruvato. Os produtos formados em consequência desse

CAPÍTULO 6

Metabólito focal

Metabolismo microbiano

Intermediários

Produtos finais

Hexase fosfatos

Polissacarídeos

79

Ácidos nucleicos Pentase fosfatos

Histidina Triptofano

G 1 icose-6-fosfato

Tetrase fosfato

Corismato

Fenilalanina Tirosina

Triase-fosfatos

Lipídeos Glicina

3-Fosfoglicerato

Seri na

Cisteína Triptofano

FIGURA 6.2 Produtos finais da biossíntese formados a partir da glicose-6-fosfato. Os ésteres de fosfato dos carboidratos com cadeias de compri mento variável atuam como intermediários nas vias biossintéticas.

Metabólito focal

Intermediários

Produtos finais

Triase fosfatos

Glicina

t

3-Fosfoglicerato

Serina

Cisteína Triptofano

Corismato

........,

Fenilalanina Tirosina

Fosfoenolpiruvato

Polissacarídeos Alanina Piruvato �

Valina lsoleucina

Acetil-CoA

--------�

Lipídeos

FIGURA 6.3 Produtos finais da biossíntese formados a partir do fosfoenolpiruvato.

processo variam e, conforme descreveremos adiante neste ca pítulo podem ser utilizados na identificação de bactérias de importância clínica. A formação de fosfoenolpiruvato a partir do piruvato re quer uma quantidade substancial de energia metabólica, e no processo são utilizadas invariavelmente duas ligações anidrido

do ATP. Alguns microrganismos - por exemplo, Escherichia coli - fosforilam diretamente o piruvato com ATP, havendo, em seguida, a formação de adenosina monofosfato (AMP) e fosfato inorgânico (Pi). Outros microrganismos utilizam duas etapas metabólicas: uma ligação pirofosfato do ATP é utilizada na carboxilação do piruvato em oxaloacetato, e uma segunda

80

SEÇÃO 1

Funda m entos da Microbiologia

Metabólito focal

Produtos finais

Asparagina Oxaloacetato

Aspartato

Treonina

lsoleucina

Metionina Coenzimas Pirimidinas Ácidos nucleicos FIGURA 6.4 Produtos finais da biossíntese formados a partir do oxaloacetato. Os produtos finais: aspartato, treonina e pirimidinas atuam como intermediários na síntese de outros compostos.

Metabólito focal

Intermediários

Produtos finais

Lisina a-Cetoglutarato

Glutamato Semialdeído glutâmico

Glutamina Arginina Prolina

FIGURA 6.5 Produtos finais da biossíntese formados a partir do a-cetoglutarato.

ligação pirofosfato (frequentemente transportada mais pelo guanosina trifosfato [GTP] do que pelo ATP) é utilizada para gerar fosfoenolpiruvato a partir do oxaloacetato.

Formação e utilização do oxaloacetato Conforme previamente descrito, muitos microrganismos for mam oxaloacetato mediante a carboxilação, dependente de ATP, do piruvato. Outros microrganismos, como a E. coli, que formam fosfoenolpiruvato diretamente a partir do piru vato, sintetizam o oxaloacetato por carboxilação do fosfoe nolpiruvato. A succinil-CoA é um precursor biossintético necessário à síntese das porfirinas e outros compostos essenciais. Alguns microrganismos formam a succinil-CoA mediante a redução do oxaloacetato via malato e fumarato. Tais reações represen tam uma reversão do fluxo metabólico observado no ciclo con vencional dos ácidos tricarboxílicos (Fig. 6.11).

Formação do a-cetoglutarato a partir do p1ruvato *

A conversão do piruvato em a-cetoglutarato requer uma via metabólica divergente e, em seguida, convergente (Fig. 6.9). Por um caminho, o oxaloacetato é formado por carboxilação do piruvato ou do fosfoenolpiruvato. Pelo outro, o piruvato sofre oxidação em acetil-CoA. É interessante assinalar que, independentemente do mecanismo enzimático utilizado para

a formação do oxaloacetato, a acetil-CoA é necessária como efetor metabólico positivo desse processo. Por conseguinte, a síntese do oxaloacetato é equilibrada com a produção de acetil CoA. A condensação do oxaloacetato com acetil-CoA produz citrato. A isomerização da molécula de citrato produz isocitra to, descarboxilado de modo oxidativo em a-cetoglutarato.

VIAS DE ASSIMILAÇÃO Crescimento com acetato O acetato é metabolizado via acetil-CoA, tendo inúmeros microrganismos com a capacidade de formar acetil-CoA (Fig. 6.10), utilizada na biossíntese do a-cetoglutarato e, na maioria dos microrganismos respiratórios, o fragmento acetil da acetil-CoA é oxidado por completo em dióxido de carbono pelo ciclo dos ácidos tricarboxílicos (Fig. 6.11). Entretanto, a capacidade de usar o acetato como fonte efetiva de carbono limita-se a um número relativamente pequeno de microrganis mos e vegetais. A síntese final dos precursores biossintéticos a partir do acetato é efetuada por reações de acoplamento do ci clo dos ácidos tricarboxílicos com duas outras reações catalisa das pela isocitrato-liase e pela malato-sintase. Conforme ilustra a Figura 6.12, essas reações possibilitam a conversão oxidati va final de duas porções acetil provenientes da acetil-CoA em uma molécula de succinato. O succinato pode ser utilizado para fins de biossíntese após sua conversão em oxaloacetato, a-cetoglutarato, fosfoenolpiruvato ou G6PD.

CAPÍTULO 6

Metabolismo microbiano

81

Desidrogenases

Glicose-6-fosfato (Ca)

Ribulose 5-fosfato (Cs)

Transcetolases

Xilulose 5-fosfate ( Cs)

Gliceraldeído 3-fosfato (C3)

Ribose 5-fosfato (Cs)

Sedoeptulose 7-fosfato (C1)

Xilulose 5-fosfato ( Cs)

Gliceraldeído 3-fosfato (C3)

Eritrose 4-fosfato (C4)

Frutose 6-fosfato (Ca)

Quinase, aldolase

ADP Frutose 6-fosfato (Ca)

Di-hidroxiacetona fosfato (C3)

ATP

'") .

Frutose 1 ,6-difosfato Gliceraldeído 3-fosfato (C3)

Aldolase, fosfatase

Di-hidroxiacetona fosfato (C3)

H20 Fosfato Frutose 1 ,6-difosfato

\. /.

Frutose 6-fosfato (Ca)

Gliceraldeído 3-fosfato (C3) Di-hidroxiacetona fosfato (C3)

H20 Fosfato Sedoeptulose 1 ,7-difosfato

\. /.

Sedoeptulose 7-fosfato (Cy)

Eritrose 4-fosfato (C4)

Transaldolase

Sedoeptulose 7-difosfato (C1)

Eritrose 4-fosfato (C4)

Gliceraldeído 3-fosfato (C3)

Frutose 6-fosfato (Ca)

FIGURA 6.6 Mecanismos bioquímicos para modificação do comprimento das moléculas dos carboidratos. A fórmula empírica geral dos ésteres de fosfato dos carboidratos - (C0H2000)-N-fosfato - está abreviada (C0) para enfatizar as alterações no comprimento das cadeias.

82

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

Sistema de reação + H20

Glicose 6-fosfato + 1 2NAD+

6C02 + 12NADH + Fosfato

Trans cetolase

6NADH

Trans aldolase

6NADH Trans cetolase

Fosfato Aldolase, fosfatase FIGURA 6.7 A derivação de hexose-monofosfato. As reações oxidativas (Fig. 6.6) reduzem o NAD+ (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato) e produzem C02, resultando em encurtamento das seis hexases-fosfato (abreviadas por C6) em seis pentases-fosfato (abreviadas por C5). Os rearranjos dos carboidratos (Fig. 6.6) convertem as pentases-fosfato em hexases-fosfato, de modo que o ciclo oxidativo possa prosseguir.

OXIDAÇÃO CH 0H 1 2 c=o 1 CH2OPO32Triase fosfato

CHO 1 HCOH 1 CH2OPO32-

FOSFORILAÇÃO DO SUBSTRATO

o 11 COPO32- ADP

6

p1.

ATP

\_ _/

H 0H 1 CH20P0321 ,3-Difosfoglicerato

co21 HCOH 1 CH20P0323-Fosfoglicerato

FOSFORILAÇÃO DO SUBSTRATO

co21 C=O 1 CH3

ATP

ADP

\. .)

Piruvato

co21 COPO32ll CH2 Fosfoenolpiruvato

co21 HCOPO32I CH20H 2-Fosfoglicerato

FIGURA 6.8 Formação do fosfoenolpiruvato e do piruvato a partir da triase-fosfato. A figura chama a atenção para dois locais de fosforilação do substrato e para a etapa oxidativa que resulta na redução do (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NAD+) em nicotinamida adenina dinucle otídeo hidreto (NADH). A repetição dessa via de produção de energia requer um mecanismo para a oxidação do NADH em NAD+. Os microrganismos fermentativos atingem esse objetivo ao utilizar o piruvato ou metabólitos derivados do piruvato como oxidantes.

Crescimento com dióxido de carbono: o ciclo de Calvin De forma similar as plantas e algas, diversas espécies microbia nas são capazes de utilizar o dióxido de carbono como única fonte de carbono. Em quase todos esses organismos, a prin cipal via de assimilação do carbono é a do ciclo de Calvin, em que o dióxido de carbono e a ribulose-difosfato combinam-se para formar duas moléculas de 3-fosfoglicerato (Fig. 6.13A). O 3-fosfoglicerato é fosforilado em 1,3-difosfoglicerato, com posto reduzido no derivado triose, o gliceraldeído 3-fosfato. As reações de rearranjo dos carboidratos (Fig. 6.6) possibilitam a

conversão da triose fosfato no derivado pentose, ribulose-5fosfato, que sofre fosforilação para regenerar a molécula acep tora, ribulose-1,5-difosfato (Fig. 6.13B). O carbono reduzido adicional, formado por assimilação redutora do dióxido de carbono, é convertido em metabólitos focais para as vias bios sintéticas. As células que podem utilizar o dióxido de carbono co mo única fonte de carbono são denominadas autotróficas, e as exigências para esse padrão de assimilação do carbono po dem ser resumidas brevemente como a seguir: além da reação primária de assimilação que dá origem ao 3-fosfoglicerato, deve existir um mecanismo para a regeneração da molécula

CAPÍTULO 6 NAD+ HSCoA

C02

o 11 CH3CSCoA

Piruvato

Acetil-CoA

HSCoA co21 c=o 1 CH 3 Piruvato

ATP AMP

ADP o = cco21 CH2Co20xaloacetato

Acetil CoA necessana para reação -

,

83

NADH+H+

co21 C=O 1 CH3

ATP

Metabolismo microbiano

.

co21 2 COPO3 ll CH2 Fosfoenol piruvato

CH2Co2I HOCC02I CH2C02-

CHC02I eco2' CH2C02-

Citrato

Aconitato

o = cco21 CH2 1 CH2Co2a-Cetoglutarato

lsocitrato

Oxalossuccinato

FIGURA 6.9 Conversão do piruvato em a-cetoglutarato. O piruvato é convertido em a-cetoglutarato por uma ramificação da rota de biossíntese. Em uma ramificação, o piruvato é oxidado em acetil-CoA; em outra, o piruvato é carboxilado em oxaloacetato.

co21 c=o 1 CH3

��------��N�AD NAD+

Piruvato

H+H+

HSCoA

HSCoA

pp.1

CH3Co2-

o 11 CH3CSCoA

Acetato

Acetil-CoA

ATP

AMP

P-OXIDAÇÃO

Acidos graxos

HSCoA

pp.1

ATP

AMP

,

FIGURA 6.10 Fontes bioquímicas de acetil-CoA. AMP, adenosina monofosfato; ATP, adenosina trifosfato.

84

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

Acetil-CoA

CHC02ll cco21 CH2C02Aconitato

o = cco21 CH2Co2NADH+H+

0xaloacetato

HOCHC02I CHC02I CH 2C02-

HOCHC02I

CH2Co2L·Malato

lsocitrato Sistema de reação Acetil-CoA + 3NAD+ + Enz(FAD) + GDP + Pi + 2H20 �

HSCoA + 2C02 + 3NADH + 3H+ + Enz(FADH2) + GTP

o =cco21 CHC02-

CHC02ll CHC02Fumarato

Enz(FAD)

NADH+H+

I

CH2C020xalosuccinato

CH2C02I CH2C02Succinato GTP

o =cco21 CH2 1 CH CO HSCoA

HSCoA

GDP

o 11 CH2CSCoA 1 CH2C02-

a-Cetoglutarato

NADH + Succinil-CoA H+

FIGURA 6.11 Ciclo do ácido tricarboxílico. Existem quatro etapas oxidativas, três delas originando nicotinamida adenina dinucleotídeo hidreto (NADH), enquanto uma dá origem a uma flavoproteína reduzida, Enz(FADH2). O ciclo só pode prosseguir se houver aceptores de elétrons disponíveis para oxidar o NADH e a flavoproteína reduzida. GDP, guanosina difosfato; GTP, guanosina trifosfato.

aceptora, a ribulose 1,5-difosfato, processo que requer a redu ção, dependente de energia, do 3-fosfoglicerato para o nível do carboidrato. Por conseguinte, o autotrofismo exige a presença de dióxido de carbono, ATP, NADPH e um conjunto especí fico de enzimas.

Despolimerases Existem muitos substratos potenciais de crescimento que ser vem como subunidades formadoras dentro da estrutura dos polímeros biológicos. Essas moléculas grandes não são facil mente transportadas através da membrana celular sendo, com frequência, fixadas a estruturas celulares ainda maiores. Inú meros microrganismos elaboram despolimerases extracelula res que hidrolisam proteínas, ácidos nucleicos, polissacarídeos e lipídeos. O padrão das atividades de despolimerase pode ser útil na identificação de microrganismos.

Oxigenases Muitos compostos presentes no meio ambiente são relativa mente resistentes à modificação enzimática, de modo que a sua utilização como substratos para crescimento exige uma classe especial de enzimas, denominadas oxigenases, que usam dire tamente o oxigênio molecular oxidante potente como subs trato em reações que convertem um composto relativamente intratável em uma forma na qual pode ser assimilado por rea ções favorecidas termodinamicamente. A ação das oxigenases é ilustrada na Figura 6.14, que mostra o papel de duas oxigena ses na utilização do benzoato.

Vias de redução Alguns microrganismos vivem em ambientes extremamen te redutores, os quais favorecem reações químicas que não

CAPÍTULO 6 o 11 CH3CSCoA

Metabolismo microbiano

85

CH2Co2I HOCC02I CH2Co2-

Acetil-CoA

Citrato

HSCoA

CHC02-

ll

O = CC02CH2Co2-

cco21 CH2Co2-

0xaloacetato

Aconitato

I

NADH+H+

I

o 11 CH3CSCoA

HOCHC02I

CH2C02L·Malato

HOCHC02-

HSCoA

CHC02I

CH2C02-

Acetil-CoA

lsocitrato

MALATO SINTASE

ISOCITRATO LIASE

O = CHC02Glioxilato

CH2C02I CH2C02Succinato Sistema de reação 2Acetil-CoA + NAD+ + 2H20 � Succinato + 2HSCoA + NADH + H+ FIGURA 6.12 O ciclo do glioxilato. Observe que as reações que convertem o maiato em isocitrato são compartilhadas pelo ciclo do ácido tricar boxílico (Fig. 6.11). A divergência metabólica no nível do isocitrato e a ação de duas enzimas, a isocitrato-liase e malato-sintase, modificam o ciclo do ácido tricarboxílico, resultando em conversão redutora de duas moléculas de acetil-CoA em succinato.

ocorreriam em microrganismos que utilizam o oxigênio como aceptor de elétrons. Nesses microrganismos, podem ser utili zados redutores potentes para impulsionar reações que possi bilitam a assimilação de compostos relativamente intratáveis. Um exemplo é a assimilação redutora do benzoato, processo em que o anel aromático é reduzido e aberto para formar o pi melato do ácido dicarboxílico. Reações metabólicas posteriores convertem o pimelato em metabólitos focais.

Assimilação do nitrogênio A assimilação redutora do nitrogênio molecular, também conhecida como fixação do nitrogênio, é necessária para a manutenção da vida em nosso planeta. Tal fixação é efetua da por uma variedade de bactérias e cianobactérias que utili zam um sistema de inúmeros multicomponentes denominado complexo enzimático nitrogenase. Apesar da variedade dos

microrganismos capazes de fixar o nitrogênio, na maioria deles o complexo nitrogenase é semelhante (Fig. 6.15). A nitroge nase é um complexo de duas enzimas - uma (dinitrogenase redutase) contendo ferro e a outra (dinitrogenase) contendo ferro e molibdênio. Juntas, elas catalisam a seguinte reação: N2 + 6H+ + 6e- + 12ATP -- � + 12ADP+ 12P Devido à alta energia de ativação para quebrar as fortes liga ções triplas que unem dois átomos de nitrogênio, essa assimila ção redutora do nitrogênio exige uma quantidade substancial de energia metabólica: 20 a 24 moléculas de ATP são hidroli sadas, enquanto uma única molécula de N2 é reduzida a duas moléculas de NH3* Outras demandas fisiológicas são impostas pelo fato de a nitrogenase ser facilmente inativada pelo oxigênio. Os micror ganismos aeróbios que utilizam a nitrogenase desenvolveram

86

SEÇÃO 1

Fundamentos da M icrobiologia

A

CH20H

� =O � H OH

ATP

ADP

"" )

1

io

HCOH

2 CH2OPO3 I co2 c=o

� H OH 1

""

2ATP

io

1

2HCOH

1

2 CH2OPO3 -

HCOH

1

1

2 CH20P03 -

2 CH20P03 -

Ribulose 5-fosfato (Cs)

Ribose 1 ,5-difosfato

11

2 COPO3 -

2ADP

co2-

2 3-Fosfo glicerato

2NADPH

o

2NADP+

I

CHO

1

2HCOH

2HCOH

2 1,3-Difosfo glicerato

2 Gliceraldeído 3-fosfato (2 C3)

1

1

2 CH2OPO3 -

2 CH2OPO3 -

B

Metabólitos focais e biossíntese

Aldolase, fosfatase Trans cetolase

Aldolase, fosfatase

2C7

Trans cetolase

2C5

Assimilação redutora de C02 12NADP+ 12NADPH

("\

12ADP 12ATP

T\

6ADP

6ATP

Sistema de reação 6C02 + 12NADPH + 1 8ATP � 2 Triase fosfato (C 3) + 12NADP+ + 18ADP + 18Pi

(A)

FIGURA 6.13 O ciclo de Calvin. Assimilação redutora do C02* A adenosina trifosfato (ATP) e a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) são utilizadas para conversão redutora da pentase 5-fosfato (C5) em duas moléculas de triase fosfato (C3). (8) O ciclo de Calvin é concluído através de reações de rearranjo dos carboidratos (Fig. 6.6) que possibilitam a síntese final do carboidrato e a regeneração da pentase fosfato, de modo que o ciclo possa continuar. ADP, adenosina difosfato.

mecanismos elaborados para proteger a enzima da inativação. Alguns formam células especializadas nas quais ocorre a fIXa ção do nitrogênio, enquanto outros desenvolveram cadeias de transporte de elétrons elaboradas para proteger a nitrogenase da inativação pelo oxigênio. As mais importantes dessas bac térias na agricultura são as Rhizobiaceae, microrganismos que

fIXam simbioticamente o nitrogênio nos nódulos das raízes das plantas leguminosas. A capacidade de utilizar a amônia como fonte de nitrogênio é amplamente observada entre os microrganismos. A principal porta de entrada do nitrogênio no metabolismo do carbono é o glutamato, formado por aminação redutora do a-cetoglutarato.

CAPÍTULO 6 Metabolismo microbiano

®

CD

1

�

co2-

� Benzoato

o2

NADH + H+

C02

co2OH OH

NAD+

NAD+

NADH + H+

87

?"'

1

OH

� OH Catecol

02

�

Succinil-CoA + Acetil-CoA �------ 5 etapas

)1

co2co2-

----

FIGURA 6.14 O papel das oxigenases na utilização aeróbia do benzoato como fonte de carbono. O oxigênio molecular participa diretamente nas reações que rompem o anel aromático do benzoato e do catecol.

Leghemoglobina

Carboidrato -� (da glicólise ou fotossíntese)

Sistema oxidase terminal

16MgATP

16MgADP + Pi 2H+ + 2e

H2 8NADH + H+

/c

aptação de hidrogenase

8Fd

FIGURA 6.15 Redução do N2em duas moléculas de NH3* Além do redutor, a reação da nitrogenase requer uma quantidade significativa de ener gia metabólica. O número de moléculas de adenosina trifosfato (ATP) necessário para a redução de uma única molécula de nitrogênio em amônia é incerto, e parece situar-se entre 12 e 16. A reação global requer nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato - 8NADH + H+, seis utilizados para reduzir o N2 em 2NH3, enquanto dois são empregados para formar H2* A hidrogenase de captação devolve o H2 ao sistema, conservando, assim, a energia. (Redesenhada e reproduzida, com autorização, de Moat AG, Foster JW: Microbial Physiology, 4th ed., Wiley-Liss, 2002. Reproduzida, com autorização, de John Wiley & Sons, lnc.)

Conforme ilustra a Figura 6.16, existem dois mecanismos bio químicos pelos quais isso pode ser feito. Um deles, que consiste na redução em uma única etapa catalisada pela glutamato-desi drogenase (Fig. 6.16A), é efetivo em ambientes em que existe su primento de amônia abundante. O outro, um processo em duas etapas em que a glutamina atua como intermediário (Fig. 6.16B), é usado em ambientes nos quais há pouco suprimento de amô nia. O último mecanismo possibilita que a célula utilize a energia livre formada por hidrólise de uma ligação pirofosfato no ATP para assimilar a amônia a partir do meio ambiente. O nitrogênio amida da glutamina, um intermediário na as similação em duas etapas da amônia em glutamato (Fig. 6.16B), também é transferido diretamente para nitrogênio orgânico,

que aparece nas estruturas das purinas, pirimidinas, arginina, triptofano e glicosamina. A atividade e a síntese da glutami na-sintase são reguladas pelo suprimento de amônia e pela disponibilidade de metabólitos que contenham nitrogênio, derivado diretamente do nitrogênio amida da glutamina. A maior parte do nitrogênio orgânico nas células provém do grupo a-amino glutamato, e o mecanismo primário pelo qual o nitrogênio é transferido consiste na transaminação. Nessas reações, o aceptor habitual é um a-cetoácido, transfor mado no a-aminoácido correspondente. O a-cetoglutarato, o outro produto da reação de transaminação, pode ser converti do em glutamato por aminação redutora (Fig. 6.16).

88

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

A. Altas concentrações de amônia. co21 C=O 1 NH3 CH2 + + NADPH 1 CH2 1 co2a-Cetoglutarato

co2 +1 H3NCH 1 CH2 + 1 CH2 1 co2Glutamato

NADP+

B. Baixas concentrações de amônia. co2+ 1 H3NCH 1 NH3 CH2 + ATP + 1 CH2 1 co2-

Glutamato

co2+ 1 H3NCH 1 CH2 1 CH2 1 C=O 1 NH2 Glutamina

Glutamina

co21 C=O 1 CH 2 + 1 CH 2 1 co2-

+

a-Cetoglutarato

NADPH

(A).

co2+ 1 H3NCH 1 CH2 + 1 CH2 1 co2-

co2+1 H3NCH 1 CH2 + 1 CH2 1 co2-

NADP+

2-Glutamatos

FIGURA 6.16 Mecanismos de assimilação do NH3* Quando a concentração de NH3se apresenta elevada, as células são capazes de assimilar o composto através da reação da glutamato desidrogenase. (8) Quando a concentração de NH3 é baixa, como ocorre mais frequentemente, as células acoplam as reações da glutamina sintase e da glutamato sintase para utilizar a energia produzida por hidrólise de uma ligação de pirofosfato na assimilação da amônia.

VIAS DE BIOSSÍNTESE Traçado das estruturas dos precursores biossintéticos: glutamato e aspartato Em muitos casos, é possível estabelecer a origem biossintéti ca do esqueleto de carbono de um produto final metabólico. A glutamina, que fornece um exemplo óbvio, é claramente derivada do glutamato (Fig. 6.17). O esqueleto do glutamato nas estruturas da arginina e da prolina (Fig. 6.17) é menos evi dente, porém facilmente discernível. De modo semelhante, o esqueleto de carbono do aspartato, derivado diretamente do metabólito focal oxaloacetato, é evidente nas estruturas da as paragina, treonina, metionina e pirimidinas (Fig. 6.18). Em alguns casos, diferentes esqueletos de carbono combi nam-se em uma via de biossíntese. Assim, por exemplo, o as partato semialdeído e o piruvato combinam-se para formar os precursores metabólicos da lisina, o ácido diaminopimélico e o ácido dipicolínico (Fig. 6.19). Os dois últimos compostos são

encontrados unicamente nos procariotos. O ácido diaminopi mélico é um componente do peptidoglicano da parede celular, enquanto o ácido dipicolínico representa um componente ma joritário dos endosporos.

co2 +1 H3NCH 1 CH2 1 CH2 1 C=O 1 NH2

co2 +1 H3NCH 1 CH2 1 CH2 1 CH2 1 NH 1 C = NH 1 NH2

Glutamina

Arginina

Prolina

FIGURA 6.17 Aminoácidos formados a partir do glutamato.

CAPÍTULO 6

co2

-

+

1

H3NCH

1

+

co2 + 1 H3NCH CHOH

C=O

CH3

1 1

1

NH2 Asparagina

1

H3NCH 1 CH2 1 CH2 1 s 1 CH3

1

CH2

co2

Treonina

Metionina

Uracila

FIGURA 6.18 Produtos finais da biossíntese formados a partir do aspartato.

Síntese do peptidoglicano da parede celular A estrutura do peptidoglicano é mostrada na Figura 2.16; a via pela qual ele é sintetizado encontra-se ilustrada de modo simplificado na Figura 6.20A. A síntese do peptidoglicano começa com a síntese em etapas do UDP-ácido N-acetilmu râmicopentapeptídeo no citoplasma. A N-acetilglicosamina liga-se inicialmente ao uridina difosfato (UDP) e, em seguida, é convertida em UDP-ácido N-acetilmurâmico por condensa ção com o fosfoenolpiruvato e redução. Os aminoácidos do pentapeptídeo são sequencialmente adicionados, sendo cada

H2C / -:::0 ::1 HC '-.... HOOC ,..,. NH2

+

Aspartato semialdeído

Piruvato

Succinil-CoA

Acido tetraidropicolínico

HOOC

Ácido di-hidropicolínico

CoA

,

N ,,,,;:. COOH

Acido dipicolínico (esporos) ,

H2 ,...,... e ""'

H2e cH2 1 1 C HC -::: ::HOOC ,..,. O 1 -...... COOH NH

1

(Succ) COOH

1

HC - NH2

1

(CH2)3

1

HC -NH2

1

COOH Ácido diaminopimélico (paredes celulares)

89

adição catalisada por uma enzima diferente, envolvendo, cada qual, a clivagem do ATP em ADP + Pi. O UDP-ácido-N-acetilmurâmicopentapeptídeo liga-se ao bactoprenol (um lipídeo da membrana celular) e recebe uma molécula de N-acetilglicosamina do UDP. Algumas bactérias (p. ex., Staphylococcus aureus) formam um derivado pen taglicina em uma série de reações que utilizam glicil-RNAt como doador; o dissacarídeo obtido é polimerizado em um intermediário oligomérico antes de ser transferido para a porção terminal de um polímero de glicopeptídeo na parede celular. A ligação cruzada final (Fig. 6.20B) é efetuada por meio de uma reação de transpeptidação, em que o grupo amino livre de um resíduo de pentaglicina desloca o resíduo o-alanina termi nal de um pentapeptídeo vizinho. A transpeptidação é catalisa da por uma enzima de um conjunto de enzimas denominadas proteínas de ligação da penicilina (PBP). As PBP ligam-se à penicilina e a outros antibióticos betalactâmicos de modo co valente, devido, em parte, a uma semelhança estrutural entre esses antibióticos e o pentapeptídeo precursor. Algumas PBP exibem atividades de transpeptidase ou carboxipeptidase, sen do provável que suas velocidades relativas controlem o grau de formação de ligações cruzadas no peptidoglicano (fator impor tante na septação celular). A via de biossíntese tem importância especial em medicina, visto que proporciona uma base para a ação antibacteriana sele tiva de vários quimioterápicos. Diferentemente de suas células

H e -:::::H 2C / CH -2H 1 1 HC '-.... C HOOC ,..,. N � -...... COOH

H e

Metabolismo microbiano

Lisina (proteínas)

FIGURA 6.19 Produtos finais da biossíntese formados a partir do aspartato semialdeído e do piruvato.

90

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

O Derivados de UDP do NAM e

O O NAM -pentapeptídeo é transferido

do NAG são sintetizados (não mostrado).

para o bactoprenol fosfato. Eles são ligados por uma ponte pirofosfato.

UDP-NAM L-Ala f) Adição sequencial de aminoácidos a UDP-NAM para formar o D-Glu NAM-pentapeptídeo. O ATP é usado para completá-lo, mas o tRNA e os ribossomos não L-Lys (DAP) estão envolvidos na formação das pontes peptídeas que ligam D-Ala -D-A a os aminoácidos.

0r r

Citoplasma A

NAM-pentapeptídeo. Se for necessária uma ponte pentaglicina, esta é criada com o emprego de moléculas especiais glicil-tRNA, e os ribossomos não são empregados. A formação das pontes ocorre na membrana.

L-Ala

0 O bactoprenol carreador transfere

Cicloserina

as unidades repetidas NAM-NAG pentapeptídeo através da membrana.

Lipídeo 1

o

R

Pentapeptídeo 1 8 - NAM -NAG

UDP

UMP

Bacitracina

Lipídeo li

UDP- NAG

UDP-NAM - pentapeptídeo

Pi

Membrana

o

Periplasma

P. R

Peptidoglicano Peptidoglicano - NAM -NAG . . 1 Vancom1c1na Pentapeptídeo

O As ligações peptídicas entre as cadeias

O O bactoprenol carreador retorna através

do peptidoglicano são formadas por transpeptidação (não mostrado) B

O O UDP transfere o NAG para o bactoprenol

da membrana. Nessa operação, perde um fosfato, tornando-se bactoprenol fosfato, ficando pronto para iniciar um novo ciclo.

- NAM- NAG

1

Pentapeptídeo

O O NAM-NAG-pentapeptídeo é acoplado à

região terminal crescente de uma cadeia do peptidoglicano, aumentando a extensão da cadeia em uma unidade repetida.

Transpeptidação de Escherichia coli

...

NA

- NAM ...

e

1 L -Ala 1 D- Glu 1 DAP 1 D- ia

f

D - Ala

...

D-Ala 1 D-Ala 1 H2N- DAP 1 D-Glu 1 L-Ala 1 - NAM ...

... ..

- NAM 1 L-Ala 1 D-Glu 1 DAP 1 D-Ala

***

...

NA

D-Ala 1 D-Ala 1 DAP 1 D - Glu 1 L-Ala 1 - NAM ...

Transpeptidação de Staphylococcus aureus Penicilinas

...

- NAM ...

D - Ala 1 1 D - Ala L-Ala 1 1 L - Lys D-GluNH2 1 1 D - GluNH2 L- Lys 1 I � D-Ala H2N-(Gly)5 L - Ala 1 1 D-Ala ... NA - NAM ...

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e

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- NAM ... D -Ala 1 1 D - Ala L-Ala 1 1 L - Lys D-G luNH 2 / / 1 1 D - GluNH2 (Gly)5 L- Lys 1 1 � L-Ala D-Ala 1 - NAM ... ...

FIGURA 6.20 (A) Biossíntese do peptidoglicano. NAM é o ácido N-acetilmurâmico e NAG a N-acetilglicosamina. O pentapeptídeo contém L-lisina no peptidoglicano de Staphylococcus aureus e ácido diaminopimélico (DAP) em Escherichia coli. Também é mostrada a inibição por bacitracina, ci closserina e vancomicina. Os números correspondem a seis dos oito estágios discutidos no texto. O oitavo estágio é mostrado na Figura 6.208.NAM, Ácido N-acetilmurâmico; NAG, N-acetilglicosamina; UDP, uridina difosfato. (8) Transpeptidação. As reações de transpeptidação na formação do peptidoglicano de Escherichia coli e de Staphylococcus aureus. (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein's Microbiology, 7th ed. MacGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, lnc.).

CAPÍTULO 6

hospedeiras, as bactérias não são isotônicas com os líquidos biológicos. O conteúdo das bactérias encontra-se sob elevada pressão osmótica, e sua viabilidade depende da integridade da rede de peptidoglicano na parede celular, que deve ser mantida por todo o ciclo de crescimento. Qualquer composto capaz de inibir uma etapa no processo de biossíntese do peptidoglicano provoca o enfraquecimento da parede da célula bacteriana em crescimento e a lise celular. As Figuras 6.20A e B mostram os locais de ação de vários antibióticos.

Síntese do lipopolissacarídeo do envelope celular A Figura 2.20 mostra a estrutura geral do lipopolissacarídeo antigênico dos envelopes celulares de microrganismos gram negativos. A biossíntese do grupo terminal repetitivo, que confere ao envelope sua especificidade antigênica, é apresen tada na Figura 6.21. Observe a semelhança com a síntese do peptidoglicano: em ambos os casos, uma série de subunida des é organizada em um transportador lipídico na membrana e, em seguida, transferida para as extremidades abertas do polímero.

Síntese dos polímeros capsulares extracelulares Os polímeros capsulares, alguns deles relacionados no Qua dro 2.1, são sintetizados enzimaticamente a partir de subu nidades ativadas. Nenhum transportador lipídico ligado à membrana tem sido envolvido nesse processo. A presença de uma cápsula é frequentemente determinada pelo ambiente: os dextranos e os levanos, por exemplo, só podem ser sintetiza dos com a utilização do dissacarídeo sacarose (frutose-glicose)

GDP BP-

Síntese dos grânulos de reserva alimentar Quando existe um excesso de nutrientes com relação às neces sidades de crescimento, as bactérias convertem alguns deles em grânulos intracelulares de reserva alimentar. Os principais são o amido, glicogênio, poli-�-hidroxibutirato e a volutina, que consiste principalmente em polifosfato inorgânico (Cap. 2). O tipo de grânulo formado é próprio da espécie. Os grânu los são degradados quando ocorre a depleção dos nutrientes exógenos.

PADRÕES DE METABOLISMO PRODUTORES DE ENERGIA EM MICRÓBIOS Conforme descrito no Capítulo 5, existem dois mecanismos metabólicos principais para a geração de ligações de pirofos fato ácido ricas em energia no ATP: a fosforilação do subs trato (a transferência direta de uma ligação acilfosfato de um doador orgânico para o ADP) e a fosforilação do ADP pelo fosfato inorgânico. A última reação é desfavorável do ponto de vista energético e tem de ser impulsionada por um gradien te eletroquímico transmembrana, a força motriz de prótons. Na respiração, o gradiente eletroquímico é criado a partir de um redutor e um oxidante fornecidos externamente. A energia liberada por transferência de elétrons do redutor para o oxi dante através de transportadores ligados à membrana é aco plada à formação do gradiente eletroquímico transmembrana.

BP-

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®-®-(gal-rha-man)n-1

BP-

®-®-gal-rha

BP-

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n

TOP

Polissacarídeo principal

TDP-rha

Polissacarídeo (gal-rha-man)n principal

BP-

®-®-gal

BP-

BP-

UMP UDP-gal

®

91

como fonte da subunidade apropriada, por isso sua síntese de pende da presença de sacarose no meio.

GDP-man BP-

Metabolismo microbiano

®-®

p.1

FIGURA 6.21 Síntese da unidade repetida da cadeia lateral do polissacarídeo da Salmonella enterica sorovar Newington e sua transferência para o cerne do lipopolissacarídeo. BP, bactoprenol; GDP, guanosina difosfato; TOP, timidina difosfato; UDP, unidina difosfato; UMP, uridina monofosfato.

92

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

Na fotossíntese, a energia luminosa gera redutores e oxidantes associados à membrana; a força motriz de prótons é gerada à medida que esses transportadores de elétrons retornam ao es tado basal. Tais processos são discutidos a seguir.

Vias de fermentação

a estrutura quanto a localização de um substrato são modifi cadas. Convém assinalar que a escolha do ATP ou do fosfoe nolpiruvato como agente de fosforilação não altera a produção de ATP da fermentação, visto que o fosfoenolpiruvato é utili zado como fonte de ATP nos estágios finais da fermentação (Fig. 6.8).

A. Estratégias para a fosforilação de substratos

C. A via de Embden-Meyerhof

Na ausência de respiração ou de fotossíntese, as células de pendem totalmente da fosforilação de substratos para obter energia: a geração de ATP precisa ser acoplada ao rearranjo químico de compostos orgânicos. Muitos compostos podem atuar como substratos de crescimento passíveis de fermenta ção, e várias vias foram desenvolvidas, apresentando três está gios gerais: (1) conversão do composto passível de fermentação no doador de fosfato para a fosforilação de substrato; esse es tágio com frequência abrange reações metabólicas nas quais o NAD+ é reduzido a NADH; (2) fosforilação do ADP pelo doador de fosfato rico em energia; (3) etapas metabólicas que colocam os produtos da fermentação em equilíbrio químico com os materiais de partida. A exigência mais frequente nesse último estágio consiste em um mecanismo para a oxidação do NADH, gerado no primeiro estágio de fermentação, em NAD+, de modo que a fermentação possa prosseguir. Nas próximas seções são fornecidos exemplos de cada um dos três estágios da fermentação.

Esta via (Fig. 6.22), um mecanismo comumente encontrado na fermentação da glicose, utiliza uma quinase e uma aldolase (Fig. 6.6) para transformar a hexose (C6) fosfato em duas mo léculas de triose (C3) fosfato. A conversão da triose-fosfato em duas moléculas de piruvato é acompanhada de quatro reações de fosforilação dos substratos. Por conseguinte, tendo em vista as duas ligações de pirofosfato do ATP necessárias à formação de triose-fosfato a partir da glicose, a via de Embden-Meyerhofpro duz um ganho líquido de duas ligações de pirofosfato de ATP. A formação do piruvato a partir da triose-fosfato é um proces so oxidativo, e o NADH formado na primeira etapa metabólica (Fig. 6.22) deve ser convertido em NAD+ para que a fermentação prossiga. A Figura 6.23 ilustra dois dos mecanismos mais sim ples para se atingir esse objetivo. A redução direta do piruvato pelo NADH gera o lactato como o produto final da fermentação e, portanto, resulta em acidificação do meio. Como alternativa, o piruvato pode ser descarboxilado em acetaldeído, que é então utilizado para oxidar o NADH com a consequente formação do produto neutro etanol. A via escolhida é determinada pela histó ria evolutiva do microrganismo e, em alguns deles, pelas condi ções de crescimento.

B. Fermentação da glicose A diversidade das vias é ilustrada ao se considerarem alguns dos mecanismos utilizados por microrganismos para efetuar a fosforilação de substratos à custa da glicose. Em princípio, a fosforilação do ADP em ATP pode ser acoplada a uma de duas transformações quimicamente balanceadas: Glicose -� 2 Ácido lático (C6H12 06) (C3 H603 ) ou Glicose -� 2 Etanol + 2 Dióxido de carbono (C6 H12 06 ) (C2H6 0) (C02)

Os mecanismos bioquímicos pelos quais essas transforma ções ocorrem variam de modo considerável. Em geral, a fermentação da glicose é iniciada pela sua fos forilação em G6PD. Existem dois mecanismos pelos quais essa reação pode ser efetuada: ( 1) a glicose extracelular pode ser transportada, através da membrana citoplasmática, para o interior da célula e, em seguida, fosforilada pelo ATP, produ zindo G6PD e ADP; (2) em muitos microrganismos, a glicose extracelular é fosforilada à medida que está sendo transportada através da membrana citoplasmática por um sistema enzimá tico existente na membrana, que fosforila a glicose extracelular à custa do fosfoenolpiruvato, produzindo G6PD e piruvato in tracelulares. O último processo é um exemplo do metabolismo vetorial, um conjunto de reações bioquímicas em que tanto

D. As fermentações de Entner-Doudoroff e do heterolactato A Figura 6.24 mostra vias alternativas para a fermentação da glicose, inclusive algumas reações enzimáticas especializadas. A via de Entner-Doudoroff diverge das outras vias do meta bolismo dos carboidratos em virtude de uma desidratação do 6-fosfogliconato, seguida de uma reação de aldose ou aldolase que produz piruvato e triose fosfato (Fig. 6.24A). A fermenta ção do heterolactato e algumas outras vias fermentativas de pendem de uma reação da fosfocetolase (Fig. 6.24B), que cliva fosforoliticamente uma cetose fosfato, produzindo acetilfosfa to e triose fosfato. O acetilfosfato pode ser utilizado para sin tetizar o ATP ou possibilitar a oxidação de duas moléculas de NADH em NAD+ à medida que é reduzido a etanol. As Figuras 6.25 e 6.26 dão uma visão geral das vias de En tner-Doudoroff e do heterolactato, respectivamente, que pro duzem apenas uma única molécula de triose fosfato a partir da glicose, com produção de energia correspondentemente baixa: diferentemente da via de Embden-Meyerhof, as vias de Entner-Doudoroff e do heterolactato produzem apenas uma fosforilação do substrato de ADP por molécula de glicose fer mentada. Por que outras vias de fermentação da glicose têm sido selecionadas no ambiente natural? Para responder a esta pergunta, é preciso ter em mente dois fatos. Em primeiro lu gar, na competição direta pelo crescimento entre duas espécies microbianas, a velocidade de utilização de substrato pode ser mais importante do que a quantidade de crescimento. Em se gundo lugar, a glicose é apenas um dos inúmeros carboidratos

Meta boli smo microbiano

CAPÍTULO 6

93

G licose A glicose é fosforilada à custa de uma molécula de ATP, criando glicose 6-fosfato, um precursor metabólico e molécula de partida para a via da pentose-fosfato.

ADP

Glicose 6-fosfato

lsomerização da glicose 6-fosfato (um aldeído) para frutose 6-fosfato (uma cetona e um precursor metabólico).

Frutose 6-fosfato

Mais uma molécula de ATP é consumida para fosforilar C1 da frutose. A célula dispensa uma parte de sua energia para poder ganhar mais na etapa seguinte da glicólise. -

-

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Fase 6C

Frutose 1 , 6-bifosfato -

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-

FA frutose 1 ,6-bifosfato é convertida em duas moléculas de três carbonos, uma das quais é um precursor metabólico.

---

-

Gliceraldeído 3-fosfato

O gliceraldeído 3-fosfato é oxidado e simultaneamente fosforilado, criando uma molécula de alta energia. Os elétrons liberados reduzem o NAD1 a NADH.

e2

C

....--.... p.1

NAD 1 NADH 1 H1

1 ,3-bifosfoglicerato O ATP é produzido como substrato de fosforilação. E produzido outro precursor metabólico. '

-

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Fase 3C

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Gliceraldeído 3-fosfato

e2

C

....--.... p.1

NAD 1 NADH 1 H1

1 ,3-bifosfoglicerato

,,..--o. ADP

ADP

�C ATP 3-fosfoglicerato

3-fosfoglicerato

t 2-fosfoglicerato

t 2-fosfoglicerato

Fosfoenolpiruvato

Fosfoenolpiruvato

Outro precursor metabólico é produzido.

A clivagem oxidativa de uma molécula de glicose resulta na formação de duas moléculas de piruvato. O piruvato é um dos precursores metabólicos mais importantes.

,,,_-, ADP ..,_,_.�e ATP Piruvato ©-©-©

Piruvato

FIGURA 6.22 A via de Embden-Meyerhof. Esta é uma das três vias glicolíticas usadas para catabolizar a glicose em piruvato e que ocorre durante a respiração aeróbia, a respiração anaeróbia e a fermentação. Quando utilizada durante o processo respiratório, os elétrons aceitos pelo NAD+ (nico tinamida adenina dinucleotídeo fosfato) são transferidos para uma cadeia de transporte de elétrons e finalmente aceitos por um receptor exógeno de elétrons. Quando utilizada durante a fermentação, os elétrons aceitos pelo NAD+ são doados para um aceptor de elétrons endógeno (p. ex., o piruvato). A via de Embden-Meyerhof é também uma importante via anfibólica, pois gera vários precursores metabólitos (acima, em azul). ADP, adenosina difosfato; ATP, adenosina trifosfato. (Reproduzida, com autorização, de Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein's Microbiology, 7th ed, McGraw-Hill, 2008.)

encontrados pelos microrganismos em seu ambiente natural. Por exemplo, as pentoses podem ser fermentadas com muita eficiência pela via usada pelo heterolactato.

E. Outras variações na fermentação dos carboidratos As vias de fermentação dos carboidratos podem englobar mui tos outros substratos além dos já descritos, e os produtos finais podem ser muito mais diversificados do que o sugerido até o

presente. Por exemplo, existem vários mecanismos para a oxi dação do NADH à custa do piruvato. Uma dessas vias consiste na formação do succinato por redução. Muitas bactérias de im portância clínica formam piruvato a partir da glicose pela via de Embden-Meyerhoff, podendo ser distinguidas com base nos produtos de redução formados a partir do piruvato, o que re flete a constituição enzimática de diferentes espécies. Os prin cipais produtos de fermentação, relacionados no Quadro 6.1, formam a base de muitos testes diagnósticos.

94

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

F. Fermentação de outros substratos

co21 C=O 1 CH3

Os carboidratos não são os únicos substratos passíveis de fer mentação. O metabolismo dos aminoácidos, das purinas e das pirimidinas pode possibilitar a ocorrência da fosforilação dos substratos. Assim, por exemplo, a arginina pode atuar como fonte de energia, dando origem ao carbamoil-fosfato, que pode ser utilizado na fosforilação do ADP em ATP. Alguns micror ganismos fermentam pares de aminoácidos, utilizando um de les como doador de elétrons e o outro como aceptor.

Piruvato

NADH+H+ H 1 c=o 1 CH3

Padrões de respiração

Acetaldeído

co21 CHOH 1 CH3

NADH+H+

Lactato

A respiração exige uma membrana fechada. Nas bactérias, tal membrana é a própria membrana celular. Os elétrons passam de um redutor químico para um oxidante químico através de um conjunto específico de transportadores de elétrons no in terior da membrana, resultando no estabelecimento da força motriz de prótons (Fig. 6.27); o retorno dos prótons através da membrana está acoplado à síntese do ATP. Conforme su gere a Figura 6.27, o redutor biológico para a respiração é fre quentemente o NADH, enquanto o oxidante costuma ser o ox1gen10. Existe uma enorme diversidade microbiana no que concer ne às fontes de redutores utilizados para a geração do NADH, sendo muitos microrganismos capazes de utilizar aceptores de elétrons diferentes do oxigênio. Os substratos orgânicos de '

FIGURA 6.23 Dois mecanismos bioquímicos pelos quais o piruva to pode oxidar o nicotinamida adenina dinucleotídeo hidreto (NADH). A esquerda: formação direta do lactato, resultando em produção efeti va de ácido láctico a partir da glicose. A direita: formação dos produtos neutros dióxido de carbono e etanol.

A

'

co21 C=O 1 CH3

A

co21 HCOH 1 HOCH 1 HCOH 1 HCOH 1 2 CH2OPO3 -

H20

)

)

6-Fosfogliconato

B

co21 C=O 1 CH2 1 HCOH 1 HCOH 1 2 CH2OPO3 -

Piruvato

CHO 1 HCOH 1 2 CH2OPO3 -

2-Ceto-3-desoxi6-fosfogliconato

CH20H 1 C=O 1 HOCH 1 HCOH 1 2 CH2OPO3 Xilulose 5-fosfato

p,1

Gliceraldeído 3-fosfato

o 11 2 CH3COPO3 -

CHO 1 HCOH 1 2 CH20P03 Gliceraldeído 3-fosfato

FIGURA 6.24 Reações associadas a vias específicas de fermentação dos carboidratos. (A) Reações de desidratase e aldolase utilizadas na via de Entner-Doudoroff. (8) A reação da fosfocetolase, encontrada em diversas vias de fermentação dos carboidratos, que gera o ácido anidrido acetilfos fato misto, o qual pode ser utilizado para a fosforilação de substrato da adenosina difosfato (ADP).

CAPÍTULO 6 Glicose

Metabolismo microbiano

95

Glicose ATP

ATP

ADP

ADP

Glicose 6-fosfato

Glicose 6-fosfato

NAD+

NAD+

NADH+H+

NADH+H+

(Ver Figs. 6.5 e 6-6)

6-Fosfogliconato NADH+H+

H20 (Ver Fig. 6.7)

Pentose 5-fosfato (Ver Fig. 6.238)

Triose fosfato

Piruvato NADH+H+

2 CH3COPO3 -

NAD+ NADH+H+

Lactato

Triase fosfato

o 11

ADP

NAD+

Acetil fosfato

NADH+H+

NADH+H+

ADP

(Ver Fig. 6.7) ATP

(Ver Fig. 6. 7) ATP

NADH+H+

ADP

ADP

ATP

ATP

Piruvato

Piruvato NADH+H+

Lactato

NADH+H+

Lactato

FIGURA 6.25 A via de Entner-Doudoroff. ADP, adenosina difosfato; ATP, adenosina trifosfato.

FIGURA 6.26 Fermentação heteroláctica da glicose. ADP, adenosi na difosfato; ATP, adenosina trifosfato.

crescimento são convertidos em metabólitos focais, que podem reduzir o NAD+ a NADH mediante a derivação de hexose-mo nofosfato (Fig. 6.7) ou o ciclo do ácido tricarboxílico (Fig. 6.11). Outros redutores podem ser gerados durante a degradação de alguns substratos de crescimento, como, por exemplo, os áci dos graxos (Fig. 6.10). Algumas bactérias, denominadas quimiolitotróficas, são capazes de utilizar redutores inorgânicos para a respiração. Es sas fontes de energia consistem em hidrogênio, ferro ferroso, bem como várias formas reduzidas de enxofre e nitrogênio. O ATP derivado da respiração e o NADPH gerado a partir dos redutores podem ser utilizados para impulsionar o ciclo de Calvin (Fig. 6.13). Podem ser utilizados compostos e outros íons, além do 02, como oxidantes terminais na respiração. Essa capacidade,

conhecida como capacidade de respiração anaeróbia, consti tui uma característica microbiana disseminada. Os aceptores apropriados de elétrons consistem em nitrato, sulfato e dió xido de carbono. O metabolismo respiratório dependente de dióxido de carbono como aceptor de elétrons é uma proprie dade encontrada entre os representantes de um grande grupo microbiano, as arqueobactérias. Por exemplo, os representan tes desse grupo têm a capacidade de reduzir o dióxido de car bono a acetato como mecanismo para a produção de energia metabólica.

Fotossíntese bacteriana Os organismos fotossintéticos utilizam a energia lumino sa para separar cargas eletrônicas, a fim de criar redutores

SEÇÃO 1

96

Fundamentos da Microbiologia

QUADRO 6.1

Fermentações microbianas baseadas na via de Embden-Meyerhof

Fermentação

Organismos

Produtos

Etanol

Alguns fungos (particularmente algumas leveduras)

Etanol, C02

Lactato (homofermentação)

Streptococcus

Lactato (contando com pelo menos 90% das fontes de energia do carbono)

Algumas espécies Lactobacillus Lactato (heterofermentação)

Enterobacter, Aeromonas, Bacillus polymyxa

Etanol, acetoína, 2,3-butileno glicol, C02, lactato, acetato, formato (total de ácidos = 21 molª)

Propio nato

Clostridium propionicum, Propionibacterium, Corynebacterium diphtheriae Algumas espécies Neisseria, Veillonella, Micromonospora

Propionato, acetato, succinato, C02

Ácidos mistos

Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus

Lactato, acetato, formato, succinato, H2, C02, etanol (total de ácidos = 159 molª)

Butanol-butirato

Butyribacterium, Zymosarcina maxima Algumas espécies Clostridium

Butanol, butirato, acetona, isopropanol, acetato, etanol, H2, C02

* Por 100 mol de glicose fermentada.

e oxidantes associados à membrana como resultado de um evento fotoquímico. A transferência de elétrons do redutor para o oxidante cria uma força motriz de prótons. Muitas bactérias utilizam um mecanismo fotossintético totalmente independente do oxigênio. A luz é utilizada como fonte de

Membrana 2H

- NADH + H+

Meio exterior

energia metabólica, e o carbono para o crescimento provém de compostos orgânicos (fotoeterotróficos) ou de uma com binação de redutor inorgânico (p. ex., tiossulfato) e dióxido de carbono (fotolitotróficos). Essas bactérias possuem um único fotossistema que, apesar de suficiente para fornecer a energia necessária à síntese do ATP e a geração de gradien tes iônicos transmembrana essenciais, não permite a redu ção altamente exergônica do NADP+ à custa de água. Esse processo, essencial à fotossíntese que envolve o oxigênio, baseia-se na energia aditiva proveniente do acoplamento de dois eventos fotoquímicos diferentes, impulsionados por dois sistemas fotoquímicos independentes. Entre os procariotos, essa característica só é encontrada nas cianobactérias (bac térias azul-esverdeadas). Entre os organismos eucarióticos, é compartilhada por algas e plantas cujo cloroplasto constitui a organela essencial que fornece energia.

Citoplasma

REGULAÇÃO DAS VIAS METABÓLICAS

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+ 2H' ADP + p1. ATP

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FIGURA 6.27 O acoplamento do transporte de elétrons na respira ção para a geração de adenosina trifosfato (ATP). Os movimentos de prótons e elétrons indicados são mediados por transportadores (flavo proteína, quinona, citocromos) associados à membrana. O fluxo de pró tons através de seu gradiente eletroquímico, via ATPase da membrana, fornece a energia para a geração de ATP a partir de adenosina difosfato (ADP) e fosfato inorgânico (P1). Analisar explicação no texto.

Em seu ambiente normal, as células microbianas geralmente re gulam suas vias metabólicas de modo que não haja a formação excessiva de qualquer intermediário. Cada reação metabólica é regulada não apenas com relação a todas as outras reações na célula, mas também com relação às concentrações de nutrien tes existentes no ambiente. Por conseguinte, quando uma fon te esporadicamente disponível de carbono se torna de repente abundante, as enzimas necessárias ao seu catabolismo aumen tam tanto em quantidade quanto em atividade; em contrapar tida, quando uma subunidade (p. ex., um aminoácido) torna-se subitamente abundante, as enzimas necessárias à sua biossíntese diminuem tanto em quantidade quanto em atividade. A regulação da atividade e da síntese das enzimas propor ciona tanto um controle aprimorado quanto um controle grosseiro das vias metabólicas. Assim, por exemplo, a inibição da atividade enzimática pelo produto final de uma via constitui um mecanismo de controle aprimorado, visto que o fluxo de carbono através dessa via é regulado instantaneamente e com

CAPÍTULO 6

precisão. No entanto, a inibição da síntese das enzimas pelo mesmo produto final constitui um mecanismo de controle grosseiro. As moléculas preexistentes de enzima continuam a funcionar até que sejam diluídas em consequência do cresci mento adicional, embora a síntese desnecessária de proteína cesse imediatamente. Os mecanismos pelos quais a célula regula a atividade enzi mática são discutidos na próxima seção. A regulação da síntese das enzimas é discutida no Capítulo 7.

Regulação da atividade enzimática A. Enzimas como proteínas alostéricas Em muitos casos, a atividade de uma enzima que catalisa uma etapa inicial de uma via metabólica é inibida pelo produto final dessa via. Entretanto, a referida inibição não pode depender da competição pelo local de ligação do substrato da enzima, visto que as estruturas do produto final e do intermediário inicial (substrato) em geral são muito diferentes. Na verdade, a inibi ção depende do fato de que as enzimas reguladas são alostéri cas: cada enzima possui não apenas um local catalítico, que se liga ao substrato, mas também um ou mais locais que se ligam a pequenas moléculas reguladoras, ou efetores. A ligação de um efetor ao seu local provoca uma alteração na configuração da enzima, de modo que a afinidade do local catalítico pelo substrato diminui (inibição alostérica) ou aumenta (ativação alostérica).

Metabolismo microbiano

97

Em geral, as proteínas alostéricas são oligoméricas. Em al guns casos, as subunidades são idênticas, e cada uma delas pos sui tanto um local catalítico quanto um efetor; em outros casos, as subunidades são diferentes, e um tipo tem apenas um local catalítico, enquanto o outro exibe somente um local efetor.

B. Inibição por retroalimentação (Feedback) O mecanismo geral que evoluiu nos microrganismos para re gular o fluxo de carbono através das vias de biossíntese é mais eficaz do que se possa imaginar. Em cada caso, o produto final inibe alostericamente a atividade da primeira - e apenas dela - enzima da via. Por exemplo, a primeira etapa na biossíntese da isoleucina que não envolva qualquer outra via consiste na conversão da L-treonina em ácido a-cetobutírico, catalisada pela treonina-desaminase, inibida alostericamente e de mo do específico pela L-isoleucina e por nenhum outro composto (Fig. 6.28); as outras quatro enzimas da via não são afetadas (embora sua síntese seja reprimida).

C. Ativação alostérica Em alguns casos, é vantajoso para a célula que o produto fi nal, ou um intermediário, possa ativar determinada enzima em vez de inibi-la. No processo de degradação da glicose por E. coli, por exemplo, a produção excessiva dos intermediários G6PD e fosfoenolpiruvato assinala o desvio de alguma glicose para a via de síntese do glicogênio; esse processo é efetuado

L-Treonina L-Treonina desaminase

�-----------------------------------------------------�

\ 1 1 1

a-Ceto butirato

a-Aceto-a hidroxibutirato

a,p-Di-hidroxi p-metilvalerato

a-Ceto-p metilvalerato

L-lsoleucina

Piruvato

a-Aceto lactato

a,p-Di-hidroxi isovalerato

a-Ceto isovalerato

L-Valina

t t t

FIGURA 6.28 Inibição por retroalimentação da L-treonina-desaminase pela L-isoleucina (linha tracejada). As vias de biossíntese da isoleucina e da vali na são mediadas por um conjunto comum de quatro enzimas, como representado na figura.

98

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia Glicose !

Glicose 1-fosfato

Glicose 6-fosfato !

---..

* *

Frutose 6-fosfato ,

- - ------ *

! * - - - - - ADP

-- - - - - - - - - - - - - - - - -

Frutose 1 ,6-difosfato

-

....

'

!

'

1 1 1 1 1 1 1 1 1 I

ADP - Glicose !

Glicogênio

3-Fosfoglicerato !

'- - - AMP

Fosfoenol-piruvato

- - - - -

e

! e

_

_

-

- - -

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T

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)

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Piruvato ! FIGURA 6.29 Regulação da utilização da glicose por uma combinação de ativação alostérica (e) e inibição alostérica (*). AMP, adenosina

monofosfato; ATP, adenosina trifosfato (Reproduzida, com autorização, de Stanier RY, Adelberg EA, lngraham JL: The Microbial World, 4th ed. Prentice-Hall, 1976.)

pela ativação alostérica da enzima que converte a glicose- 1fosfato em ADP-glicose (Fig. 6.29).

RESUMO DO CAPÍTULO *

D. Cooperatividade Muitas enzimas oligoméricas, por exibirem mais de um local de ligação de substrato, apresentam interações cooperativas de moléculas de substrato. A ligação do substrato por um local catalítico aumenta a afmidade dos outros locais por moléculas adicionais de substrato. O efeito final dessa interação consiste em aumento exponencial da atividade catalítica em resposta a um aumento aritmético na concentração do substrato.

E. Modificação covalente das enzimas As propriedades reguladoras de algumas enzimas são alte radas mediante a modificação covalente da proteína. Assim, por exemplo, a resposta da glutamina-sintetase a efetores metabólicos é alterada por adenilação, a fixação covalente do ADP a uma cadeia lateral de tirosil específica no interior de cada subunidade enzimática. As enzimas que controlam a adenilação também são controladas por modificação co valente. A atividade de outras enzimas é alterada pela sua fosforilação.

F. lnativação das enzimas A atividade de algumas enzimas é eliminada por sua hidrólise. Esse processo pode ser regulado e, às vezes, sinalizado por mo dificação covalente da enzima destinada a ser removida.

*

*

*

*

*

*

Metabolismo consiste em dois componentes, o catabolismo e o anabolismo. O catabolismo compreende processos de clivagem de diferentes compostos, produzindo energia que é usada para síntese de ATP. O anabolismo (ou biossínte se), consiste em processos que usam a energia estocada na molécula de ATP para sintetizar as subunidades das macro moléculas que formam as células. A origem biossintética das subunidades pode ser rastreada até os precursores denominados metabólitos focais. A biossíntese do peptidoglicano somente é encontrada em bactérias. Alguns antibióticos destroem seletivamente bacté rias, inibindo diferentes etapas da síntese dessa estrutura. As vias Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff e do hete rolactato são três vias usadas para o catabolismo da glicose em bactérias. O padrão dos produtos finais, uma caracterís tica usada na identificação bacteriana. Na ausência de respiração ou fotossíntese, bactérias são in teiramente dependentes da fosforilação de substrato para obtenção de energia. A assimilação redutiva do nitrogênio molecular (ou fixação do nitrogênio) é necessária para a manutenção da vida em nosso planeta. É um processo intensivo de energia realiza do por uma variedade de bactérias e pelas cianobactérias, usando um complexo enzimático nitrogenase. A regulação da atividade enzimática possibilita tanto um controle específico quanto geral das vias metabólicas, de modo que não haja o acúmulo de nenhum metabólito in termediário em excesso.

CAPÍTULO 6 Metabolismo microbiano

QUESTÕES DE REVISÃO 1. Qual dos seguintes componentes da célula tem sua síntese de pendente de um molde (template)? (A) (B) (C) (D) (E)

Lipopolissacarídeo Peptidoglicano Polissacarídeo capsular Acido desoxirribonucleico Fosfolipídeo

2. Qual dos seguintes componentes da célula tem sua síntese total mente determinada pela especificidade enzimática? (A) (B) (C) (D) (E)

DNA RNA ribossômico Flagelos Lipopolissacarídeo Proteína

3. As principais etapas da síntese do peptidoglicano ocorrem no ci toplasma, na membrana citoplasmática e no espaço extracelular. Que antibiótico inibe a etapa extracelular na biossíntese do pep tidoglicano? (A) (B) (C) (D) (E)

Ciclosserina Rifampicina Penicilina Bacitracina Estreptomicina

4. Os aminoácidos são encontrados nas proteínas, no peptidogli cano e na cápsula das bactérias. Qual dos seguintes aminoácidos é encontrado somente no peptidoglicano? (A) (B) (C) (D) (E)

L-Lisina Acido diaminopimélico D-Glutamato L-Alanina Nenhuma das opções anteriores

5. A capacidade de empregar outros compostos e íons além do oxi gênio como oxidante terminal na respiração é disseminada no trato microbiano. Esta capacidade é chamada: (A) (B) (C) (D) (E)

Fotossíntese Fermentação Respiração anaeróbia Fosforilação de substrato Fixação de nitrogênio

6. A rota primária da assimilação do carbono usado pelos orga nismos que usam o co2 como única fonte de carbono é: (A) (B) (C) (D) (E)

Via hexose monofosfato Via Entner-Doudoroff Via Embden-Meyerhof Ciclo Glioxilato Ciclo de Calvin

7. A biossíntese do peptidoglicano é de particular importância na medicina, uma vez que serve de base para o uso de antibióticos que atuam seletivamente. Todos os seguintes antibióticos inibem alguma etapa da síntese do peptidoglicano EXCETO: (A) (B) (C) (D) (E)

Cicloserina Vancomicina Bacitracina Estreptomicina Penicilina

99

8. A regulação da atividade enzimática resulta no controle das vias metabólicas. Qual dos seguintes mecanismos regulatórios for nece um controle da via biossintética? (A) (B) (C) (D) (E)

Repressão catabólica Indução Inibição por feedback (retroalimentação) Atenuação Nenhuma das respostas anteriores

9. A origem biossintética das subunidades das macromoléculas e coenzimas pode ser rastreada pelos poucos precursores denomi nados metabólitos focais. Qual das moléculas é um metabólito focal? (A) (B) (C) (D) (E)

a-cetoglutarato Oxaloacetato Fosfoenolpiruvato Glicose 6-fosfato Todas as alternativas acima

10. Qual das seguintes alternativas NÃO é um componente do pep tidoglicano? (A) (B) (C) (D) (E)

Acido N-acetil-murâmico N-acetil-glicosamina Lipídeo A Pentaglicina Acido diaminopimélico

Respostas 1. D

4. B

2. D

5.

3.

c

c

6. E

7. D 8.

10.

c

c

9. E

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RM,

Schaechter M, Ingraham JL, Neidhardt FC: Microbe. ASM Press, 2006.

C A P Í T U L O

Genética microbiana

A ciência da genética define e analisa a hereditariedade, na grande variedade de funções estruturais e fisiológicas que constituem as propriedades dos organismos. A unidade da hereditariedade é o gene, um segmento do ácido desoxirribo nucleico (DNA) que codifica, em sua sequência de nucleotí deos, a informação sobre determinada propriedade fisiológica. A abordagem tradicional da genética tem sido identificar os genes com base na sua contribuição para o fenótipo, isto é, as propriedades estruturais e fisiológicas coletivas de um organis mo. Uma propriedade fenotípica, seja ela a cor dos olhos ou a resistência a antibióticos em uma bactéria, é geralmente obser vada no nível do organismo. A base química para a variação no fenótipo consiste em alteração do genótipo, ou alteração na sequência de DNA dentro de um gene ou na organização dos genes. O DNA como o elemento fundamental da hereditarieda de foi sugerido na década de 1930 a partir de um experimento seminal, realizado por Frederick Griffith. Nesse experimento (Fig. 7.1), a inoculação de Streptococcus pneumoniae tipo 111-S virulento (que possui uma cápsula) mortos, em camun dongos junto com pneumococos vivos mas não virulentos do tipo 11-R (sem cápsula) resultou em uma infecção letal, da qual foram recuperados pneumococos vivos do tipo 111-S. A implicação foi que alguma entidade química havia transfor mado a cepa viva (não virulenta) no fenótipo virulento. Uma década mais tarde, Avery, MacLeod e McCarty descobriram que o agente transformante era o DNA, dando início à for mação da biologia molecular tal como a conhecemos hoje. Pesquisas subsequentes com bactérias revelaram a presença de enzimas de restrição, proteínas que clivam o DNA em locais específicos, dando origem a fragmentos de restrição de DNA. Os plasmídeos foram identificados como pequenos elementos genéticos portadores de genes e capazes de repli cação independente em bactérias e leveduras. A introdução de um fragmento de restrição do DNA em um plasmídeo permite que esse fragmento seja amplificado muitas vezes. A amplificação de regiões específicas do DNA também pode ser obtida com enzimas bacterianas, utilizando-se o método da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros méto dos de amplificação do ácido nucleico baseados em enzimas. O DNA amplificado por essas fontes e digerido com enzimas de restrição apropriadas pode ser inserido em plasmídeos. Os genes podem ficar sob o controle de promotores bacteria nos de alta expressão, que permitem a expressão de proteí nas codificadas em níveis aumentados. A genética bacteriana favoreceu o desenvolvimento da engenharia genética, não

somente em procariotos, mas também em eucariotos. Esta tecnologia é responsável pelos enormes avanços no campo da medicina nos dias atuais.

ORGANIZAÇÃO DOS GENES A estrutura do DNA e a do RNA A informação genética em bactérias é armazenada em forma de uma sequência de bases no DNA (Fig. 7.2). Em bacteriófagos e em vírus, a informação genética pode ser armazenada como sequências de bases no ácido ribonucleico (RNA) (Cap. 29). A maioria das moléculas de DNA é constituída por duas fitas entrelaçadas com bases complementares (A-T; G-C), pareadas por pontes de hidrogênio voltadas para o centro da molécula (Fig. 7.3). A orientação das duas fitas do DNA é antiparale la: uma fita é quimicamente orientada na direção 5'� 3', e sua fita complementar é orientada na direção 3'� 5'. A com plementaridade das bases permite que uma fita (fita-modelo) forneça a informação necessária à cópia ou expressão da infor mação na outra fita (a fita de codificação). Os pares de bases estão localizados no centro da dupla hélice do DNA (Fig. 7.2) e determinam sua informação genética. Cada circunvolução da hélice possui uma fenda principal e uma fenda menor. Algu mas proteínas têm a capacidade de se ligar ao DNA e regular a expressão gênica interagem predominantemente com a fenda principal, onde os átomos das bases estão mais expostos. Cada uma das quatro bases está ligada à fosfo-2'-desoxirribose para formar um nucleotídeo. O esqueleto fosfodiéster do DNA, car regado negativamente, fica voltado para o solvente. Em geral, o comprimento de uma molécula de DNA é expresso em milha res de pares de bases ou pares de quilobases (kbp). Enquanto um pequeno vírus pode conter uma única molécula de DNA de menos de 0,5 kbp, o genoma de Escherichia coli é formado por > 4.000 kbp. Em ambos os casos, cada par de base é separa do do par seguinte por uma distância de cerca de 0,34 nm, ou 3,4 x 10-7 mm, de modo que o comprimento total do cromosso mo de E. coli é de aproximadamente 1 mm. Como as dimensões globais da célula bacteriana são cerca de 1.000 vezes menores do que esse comprimento é evidente que uma quantidade signifi cativa de dobramentos, ou superespiral, contribui para a estru tura física da molécula in vivo. O RNA ocorre mais frequentemente em forma de fita sim ples. A base uracila (U) substitui a timina (T) no DNA, de modo que as bases complementares que determinam a estrutura do

102

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiolog ia Experimento A

o o

Injeção -... Camundongos Camundongos -morrem

Cepa A, viva, encapsulada Experimento B

o o

Injeção ... Camundongos Camundongos sobrevivem

Cepa A, morta, encapsulada Experimento e

o o

Injeção ... Camundongos Camundongos sobrevivem

Cepa B, viva, não encapsulada Experimento D

o o Cepa B, morta, encapsulada

+

o o

Injeção Camundongos

Cepa B, viva, não capsulada

>

Camundongos Bactérias vivas morrem isoladas dos camundongos mortos

t o o

_

Pneumococos encapsulados

FIGURA 7.1 Experimento de Griffiths mostrando a evidência do fator transformante, posteriormente identificado como o DNA. Em uma série

de experimentos, camundongos receberam injeção de Streptococcus pneumoniae, vivos ou mortos, encapsulados ou não encapsulados, como indi cam os experimentos A a D. O experimento-chave é o D, mostrando que a bactéria encapsulada morta poderia fornecer um fator que permitiria à bactéria não encapsulada matar os camundongos. Além de fornecer a chave da importância da cápsula para a virulência do pneumococo, o experi mento D também ilustra o princípio do DNA como a base fundamental da transformação genética. (Reproduzida, com autorização, de McClane and Mietzner, Microbial Pathogenesis: A Principles-Oriented Approach, Fence Creek Publishing, 1999.)

RNA são A-U e C-G. A estrutura global das moléculas de RNA de uma só fita é determinada pelo pareamento entre as bases dentro das fitas que formam alças, de modo que as moléculas de RNA de uma única fita assumem uma estrutura compacta capaz de expressar a informação genética contida no DNA. A função mais geral do RNA consiste na comunicação das sequências gênicas do DNA na forma de RNA mensageiro (RNAm) para os ribossomos. Esses processos são denomina dos transcrição e tradução. O RNAm (também referido como RNAss+) é transcrito como RNA complementar para codificar a fita de DNA. Esse RNAm é então traduzido pelos ribosso mos. Os ribossomos, que contêm RNA ribossômico (RNAr) e proteínas, traduzem essa mensagem na estrutura primária das proteínas via aminoacil-RNA de transferência (ou RNA transportador) (RNAt). O tamanho das moléculas de RNA varia desde as pequenas, que contêm menos de 100 bases, até os RNAm, capazes de transportar mensagens genéticas que se

estendem por alguns milhares de bases. Os ribossomos bacte rianos contêm três tipos de RNAr, com tamanhos respectivos de 120, 1.540 e 2.900 bases, juntamente com diversas proteínas (Fig. 7.4). As moléculas correspondentes de RNAr nos ribos somos eucarióticos são um pouco maiores. A necessidade de expressão de cada gene muda em resposta às demandas fisio lógicas, e as necessidades de expressão gênica flexível se refle tem na rápida renovação metabólica da maioria dos RNAm. Já os RNAt e os RNAr - associados à função universalmen te necessária de síntese proteica - tendem a ser estáveis e, juntos, são responsáveis por mais de 95% do RNA total em uma célula bacteriana. Comprovou-se que poucas molécu las de RNA atuam como enzimas (ribozimas). Por exemplo, o RNA 23S, na subunidade ribossômica SOS (Fig. 7.4), cata lisa a formação da ponte peptídea durante a síntese proteica. Recentemente, uma nova classe de moléculas de RNA, cha madas RNA de interferência (RNAi) foi descrita em plantas.

CAPÍTULO 7

3'

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103

HN-H ---------- 0 CH N 3 \\ / Hc,,f'7 � e - e/ T-G s\ N3 -H ---H ---Js _ s�N �g / \ 3 2 1 / 2 / (dR) e N=cH N ij \ O (dR)

5' A

Genética microbiana

H 0---------H-N N \ / / H �7 � f/5�1 - H ---------- Jft. /l'f-6\3 � 2 2e'-ct1:1 (dR) \ // NH H ----------0 (dR)

Ponte de hidrogênio

89

\

.co ·ctl "O e: ::::1 � cn ctl "O e: � ......

Esqueleto de açúcar-fosfato

C

G

FIGURA 7.3 Pareamento normal de bases no DNA. Em cima: par de adenina-timina (A-T). Embaixo: par de guanosina-citosina (G-C).

As pontes de hidrogênio estão indicadas por linhas pontilhadas. No tar que o par G-C compartilha três pontes de hidrogênio, enquanto o par A-T possui somente duas pontes. Consequentemente, as interações G-C são mais fortes do que as A-T. (dR, desoxirribose do esqueleto de açúcar e fosfato do DNA.)

Base R

T 3'

NAr

A 23S (2,9 kb)

5'

ss (0,12 kb)

FIGURA 7.2 Desenho esquemático da estrutura do DNA segundo o

modelo de Watson-Crick, mostrando o esqueleto de açúcar e fosfato helicoidal das duas fitas mantidas unidas por pontes de hidrogênio en tre as bases. (Redesenhada, com autorização, de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics ofBacteria, Washington,DC: ASM Press, 2nd ed. 2002.)

Os RNAi são moléculas de RNA de fita dupla, com 20 a 25 nu cleotídeos, que desempenham uma variedade de papéis em bio logia. Foi demonstrado que algumas atuam como reguladores pela ligação com a região terminal 5' de um RNAm, impedindo os ribossomos de traduzir a mensagem, ou pelo pareamento de bases diretamente com a fita de DNA próxima do promotor, prevenindo a transcrição.

Proteínas

e 3os)

SOS

?OS

O genoma eucariótico O genoma refere-se à totalidade da informação genética conti da em determinado organismo. Quase todo o genoma eucarió tico está contido em dois ou mais cromossomos, separados do citoplasma pela membrana do núcleo. As células eucarióticas diploides contêm dois homólogos (cópias evolutivas diver gentes) de cada cromossomo. As mutações ou alterações ge néticas frequentemente não podem ser detectadas nas células

-

21 (S 1 S21)

31 (L1-L31)

Subunidades

1 6S (1,54 kb)

N

FIGURA 7.4 Composição de um ribossomo que contém uma cópia de cada um dos R A 165, 235 e 55, bem como muitas proteínas. As proteínas da grande subunidade SOS são designadas como L1 a L31; as

proteínas da pequena subunidade 305 são designadas como 51 a 521. (Redesenhada, com autorização, de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics ofBacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed. 2002.)

104

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

diploides, visto que a contribuição de uma cópia gênica com pensa as alterações na função de sua homóloga. O gene que não consegue uma expressão fenotípica na presença de seu homó logo é recessivo, enquanto aquele que sobrepuja o efeito de seu homólogo é dominante. Os efeitos das mutações podem ser mais facilmente percebidos nas células haploides, que contêm uma única cópia da maioria dos genes. As leveduras (eucarió ticas) são frequentemente investigadas, visto que podem ser mantidas e analisadas no estado haploide. As células eucarióticas contêm mitocôndrias e, no caso das plantas, cloroplastos. No interior de cada uma dessas orga nelas encontra-se uma molécula circular de DNA que contém poucos genes cuja função está relacionada com a organela em questão. Entretanto, os genes associados à função da organela encontram-se, em sua ma1or1a, nos cromossomos eucar1ot1cos. Muitas leveduras contêm um elemento genético adicional, um círculo de 2 µm de replicação independente que contém cerca de 6,3 kbp de DNA. Esses pequenos círculos de DNA, denominados plasmídeos ou epissomas, são frequentemente associados com a genética de procariotos. O pequeno tamanho dos plasmídeos torna-os acessíveis à manipulação genética e, após sua alteração, possibilita sua introdução nas células. Por isso, os plasmídeos são geralmente utilizados na engenharia genética. O DNA repetitivo, que ocorre em grandes quantidades nas células eucarióticas, vem sendo cada vez mais identificado nos procariotos. Nos genomas eucarióticos, raramente está asso ciado a regiões de codificação e localiza-se principalmente em regiões extragênicas. Essas repetições de sequência curta (SSR) ou sequências curtas repetidas em série (STR) ocorrem em mi lhares de cópias dispersas por todo o genoma. A presença de SSR e STR procarióticas está bem documentada, algumas delas exibindo polimorfismos de longo comprimento. Acredita-se que tal variabilidade seja causada por pareamento inapropria do das fitas de DNA, constituindo um pré-requisito impor tante para a variação de fase e adaptação bacterianas. Muitos genes eucarióticos são interrompidos por íntrons, sequências intermediárias de DNA ausentes no RNAm processado quan do traduzido. Os íntrons têm sido observados em arqueobac térias, mas, com algumas raras exceções, não são encontrados nas eubactérias (ver Quadro 3.3). .

.

.

,

QUADRO 7.1

Comparação dos tamanhos dos genomas em alguns procariotos, bacteriófagos e vírus Organismo

Procariotos Arqueas

Eubactérias

.

O genoma procariótico Os genes procarióticos são, em sua maioria, transportados no cromossomo bacteriano. Com poucas exceções, os genes bac terianos são haploides. Os dados sobre a sequência do genoma de mais de 340 genomas microbianos demonstram que a maio ria (> 99%) dos genomas procarióticos consiste em uma única molécula de DNA circular contendo desde 580 kbp até mais de 5.220 kbp de DNA (Quadro 7.1). Um número pequeno de bactérias (p. ex., espécies de Brucella melitensis, Burkholderia pseudomallei e Vibrio cholerae) possui genomas que consistem em duas moléculas de DNA circular. Muitas bactérias contêm genes adicionais em plasmídeos, cujo tamanho varia desde vá rios pares de bases a 100 kbp. Os círculos de DNA covalentemente fechados (cromos somos bacterianos e plasmídeos), que contêm a informação genética necessária à sua própria replicação, são denominados réplicons. Uma vez que os procariotos não contêm núcleo, a

Tamanho (kbp)

Methanococcusjannaschii

1 .660

Archaeoglobus fulgidus

2.180

Mycoplasma genitalium

580

Mycoplasma pneumoniae

820

Borre/ia burgdorferi

910

Chlamydia trachomatis

1 .040

Rickettsia prowazekii

1 .1 1 2

Treponema pallidum

1 .140

Chlamydia pneumoniae

1 .230

Helicobacter pylori

1 .670

Haemophilus influenzae

1 .830

Francisella tularensis

1 .893

Coxiella burnetii

1 .995

Neisseria meningitidis

2.180

sorogrupo A Neisseria meningitidis

2.270

sorogrupo B Bruce/la melitensisa

2. 1 1 7 + 1 .1 78

Mycobacterium tuberculosis

4.410

Escherichia coli

4.640

Bacillus anthracis

5.227

Burkholderia pseudomalle1'a

4. 126 + 3. 182

Bacteriófago

Lambda

48

Vírus

Ebola

19

Varíola (principal)

186

Vacínia

1 92

Citomegalovírus

229

ª Organismos com dois cromossomos circulares diferentes.

membrana não separa os genes bacterianos do citoplasma, co mo ocorre nos eucariotos. Algumas espécies bacterianas são eficientes para causar doença em organismos superiores, pois possuem genes espe cíficos para determinantes patogênicos. Tais genes estão fre quentemente agrupados no DNA, sendo conhecidos como ilhas de patogenicidade. Esses segmentos de genes podem ser bastante grandes (até 200 kbp) e codificar uma coleção de genes de virulência. As ilhas de patogenicidade ( 1) possuem diferentes quantidades G + C do restante do genoma; (2) estão intimamente ligadas no cromossomo a genes do tRNA; (3) são flanqueadas por repetições diretas; e (4) contêm diversos genes importantes para a patogênese, incluindo resistência a antibió ticos, adesinas, invasinas e exotoxinas, bem como outros genes que podem estar envolvidos na mobilização genética. Os genes essenciais ao crescimento bacteriano (frequen temente chamados "housekeeping") estão localizados no cro mossomo, enquanto os plasmídeos contêm genes associados a funções especializadas (Quadro 7.2). Muitos plasmídeos tam bém codificam sequências genéticas (p. ex. aquelas que codi ficam para pili sexuais) que medeiam sua transferência de um

CAPÍTULO 7 Genética microbiana

QUADRO 7.2

Exemplos de atividades metabólicas determinadas por plasmídeos

Degradação de cânfora, tolueno, octano e ácido salicíl ico

Bacillus stearothermophi/us

a-Amilase

Alcaligenes eutrophus

Utilização de H2 como fonte de energia oxidável

Escherichia coli

Captação e metabolismo de sacarose, captação de citrato

Klebsiella spp.

Fixação de nitrogênio

Streptococcus

Utilização de lactose, sistema galactose fosfotransferase, metabolismo de citrato

(grupo N)

plasmídeos são transferidos entre as células bacterianas. Além disso, a inserção de transpósons nesses plasm.ídeos é um veículo que resulta na sua disseminação em uma população bacteriana.

Atividade

Organismo

Pseudomonas spp.

105

Rhodospirillum rubrum

Síntese de pigmento fotossintético

Flavobaderium spp.

Degradação de náilon

microrganismo para outro, bem como outros genes associados à aquisição genética ou rearranjo do DNA. Por isso, genes de origens evolutivas independentes podem ser assimilados por plasmídeos amplamente disseminados entre as populações bacterianas. A consequência desses eventos genéticos tem sido observada na rápida propagação, entre populações bacterianas, da resistência a antibióticos transmitida por plasmídeos após o uso indiscriminado de antibióticos nos hospitais. Tanspósons são elementos genéticos que contêm vários ge nes, inclusive aqueles necessários para sua migração de um locus genético para outro. Ao fazê-lo, criam mutações de inserção. O envolvimento de transpósons relativamente curtos (0,75 a 2,0 kbp de comprimento), conhecidos como elementos de in serção, produz a maioria das mutações de inserção. Esses ele mentos de inserção (também conhecidos como sequências de inserção [IS]) transportam unicamente os genes até as enzimas necessárias para promover sua própria transposição para outro locus genético, mas não pode replicar em seu próprio locus. Quase todas as bactérias possuem elementos de IS, e cada espécie abriga seus próprios elementos característicos. Às vezes, podem ser en contrados elementos de IS relacionados em diferentes bactérias, o que significa que em algum ponto da evolução eles cruzaram a barreira das espécies. Os plasmídeos também transportam ele mentos de IS importantes na formação de cepas recombinantes de alta frequência (Hfr) (ver adiante). Os transpósons com plexos contêm genes para funções especializadas, como para a resistência a antibióticos, e são flanqueados por sequências de inserção. Contudo, não carreiam as informações genéticas ne cessárias para acoplar sua própria replicação à divisão celular, sendo sua propagação dependente da sua integração física a um réplicon bacteriano. Essa associação, estimulada por enzimas, confere aos transpósons a capacidade de se reproduzirem várias vezes. Essas enzimas podem permitir que transpósons se inte grem a um mesmo réplicon ou a um réplicon independente. A especificidade da sequência no local da integração é geralmente baixa. Assim, essa inserção é frequentemente aleatória, porém há uma tendência a regiões codificadoras para RNAt. Muitos

O genoma virai Os vírus são capazes de sobreviver, mas não de crescer, na au sência de uma célula hospedeira. A replicação do genoma virai depende da energia metabólica e da maquinaria macromole cular da síntese do hospedeiro. Com frequência, essa forma de parasitismo genético resulta em debilitação ou morte da célula hospedeira. Por conseguinte, a propagação bem-sucedida do vírus exige ( 1) uma forma estável que possibilite ao vírus so breviver na ausência de seu hospedeiro, (2) um mecanismo de invasão de uma célula hospedeira, (3) a informação genética necessária à replicação dos componentes virais no interior da célula e (4) informações adicionais que possam ser necessárias ao acondicionamento dos componentes virais e à liberação dos vírus resultantes da célula hospedeira. Frequentemente, são feitas distinções entre vírus associa dos a eucariotos e vírus associados a procariotos, sendo os últimos denominados bacteriófagos ou fagos. Com mais de 5.000 isolados com morfologia conhecida, os fagos constituem o maior dos grupos virais. Grande parte do conhecimento a respeito dos vírus - na verdade, muitos conceitos fundamen tais de biologia molecular - surgiu da pesquisa sobre os bac teriófagos. Os bacteriófagos ocorrem em mais de 140 gêneros bacte rianos e em diferentes habitats. A molécula de ácido nuclei co dos bacteriófagos é circundada por um envelope proteico. Observa-se considerável variabilidade no ácido nucleico dos fagos. Muitos fagos contêm DNA de fita dupla, outros contêm RNA de fita simples, e alguns possuem DNA de fita simples; outros, ainda, contêm RNA de fita dupla, RNA de fita simples ou DNA de fita simples. Algumas vezes, são encontradas bases incomuns, como a hidroximetilcitosina, no ácido nucleico do fago. Os bacteriófagos exibem ampla variedade de morfologias. Muitos fagos contêm estruturas especializadas semelhantes a seringas (i. e., caudas), que se ligam a receptores sobre a super fície da célula e injetam o ácido nucleico para o interior de uma célula hospedeira (Fig. 7.5). Os fagos podem ser distinguidos com base no seu modo de propagação. Os fagos líticos produzem muitas cópias de si mesmos à medida que matam a célula hospedeira. Entre

--

Cabeça (presença de ácido nucleico)

-- Bainha (expandida) -......._

Placa basal

. vazia --

Bainha (contraída)

- Fibras da cauda

FIGURA 7.5 Ilustrações do fago T2 com e sem ácido nucleico. Note que, quando o fago contém ácido nucleico, toma uma forma diferente do que quando o ácido nucleico está ausente. Estes diagramas foram redesenhados a partir de observações de microscopia eletrônica.

106

SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia

os fagos líticos mais extensamente estudados, os fagos T pa res (p. ex., T2, T4) de E. coli demonstraram necessidade de expressão precisamente cronometrada dos genes virais pa ra coordenar os eventos associados à sua formação. Os fagos temperados são capazes de assumir um estado de pró-fagos não lítico (inseridos no cromossomo bacteriano), em que a re plicação do seu ácido nucleico está ligada à replicação do DNA da célula hospedeira. As bactérias que transportam pró-fagos são denominadas lisogênicas, visto que um sinal fisiológico pode deflagrar um ciclo lítico, resultando em morte da célula hospedeira e liberação de inúmeras cópias do fago. O fago tem perado mais bem caracterizado é o À (lambda) da E. coli. Os genes que determinam a resposta lítica ou lisogênica à infecção À foram identificados, e suas complexas interações foram estu dadas em detalhe. Os fagos filamentosos, exemplificados pelo fago M13 da E. coli, que foi bem estudado, são excepcionais em vários as pectos. Seus filamentos ou fitas contêm DNA de fita simples, formando complexo com proteínas, e são expelidos de seus hospedeiros, que se mostram debilitados, mas que não são mortos pela infecção do fago. A engenharia do DNA no fago M13 proporcionou fitas simples que constituem fontes valiosas para a análise e a manipulação do DNA.

REPLICAÇÃO O DNA de fita dupla é sintetizado por replicação semicon servativa. À medida que a dupla hélice original se abre, cada fita funciona como molde (i. e., como fonte de informação da sequência) para a replicação do DNA. As novas fitas são sin tetizadas com suas bases em ordem complementar à das fitas preexistentes. Concluída a síntese, cada molécula-filha contém uma fita original e uma fita recém-sintetizada.

DNA bacteriano A replicação do DNA bacteriano começa em um ponto e pros segue em ambas as direções (i. e., replicação bidirecional). No processo, as duas fitas antigas de DNA são separadas e utili zadas como modelos para a síntese de novas fitas (replicação semiconservativa). A estrutura em que as duas fitas são sepa radas e na qual ocorre a nova síntese é denominada forqui llia de replicação. A replicação do cromossomo bacteriano é rigorosamente controlada, e o número de cada cromossomo (quando mais de um está presente) por célula em crescimento varia de 1 a 4. Alguns plasmídeos bacterianos podem apresen tar até 30 cópias em uma célula bacteriana, e as mutações que provocam a redução do controle da replicação dos plasmídeos podem resultar em 10 vezes mais esse número. A replicação do DNA bacteriano circular de fita dupla co meça no locus ori e envolve interações com várias proteínas. Em E. coli, a replicação cromossômica termina em uma região denominada ter. A origem (ori) e os locais de terminação (ter) para replicação estão localizados em pontos opostos no DNA circular cromossômico. Os dois cromossomos-filhos são separados antes da divisão celular, de modo que cada progê nie adquire um dos DNA-filhos. Isso é feito com o auxílio da recombinação e das topoisomerases, enzimas que alteram o superenrolamento do DNA de fita dupla. (Em superespiral a

molécula do DNA enrola-se como um fio de telefone, o que acarreta um encurtamento da molécula.) As topoisomerases atuam cortando transitoriamente uma ou ambas as fitas do DNA para relaxar o enrolamento e estender a molécula de DNA. Como as topoisomerases bacterianas são essenciais e únicas, elas são alvo dos antibióticos (p. ex., quinolonas). Pro cessos semelhantes levam à replicação do DNA de plasmídeo, exceto quanto ao fato de que, em alguns casos, a replicação é unidirecional.

Fago Os bacteriófagos exibem considerável diversidade no que con cerne à natureza de seu ácido nucleico, e essa diversidade se reflete em diferentes modos de replicação. Os fagos líticos e os temperados exibem estratégias de propagação fundamental mente diferentes. Os fagos líticos produzem muitas cópias de si mesmos em um único surto de crescimento; os fagos tempe rados se estabelecem como pró-fagos, tornando-se parte de um réplicon estabelecido (cromossomo ou plasmídeo) ou forman do um réplicon independente. O DNA de fita dupla de muitos fagos líticos é linear, e o pri meiro estágio de sua replicação consiste na formação de DNA circular. Esse processo depende de extremidades coesivas, as quais consistem em caudas de fita simples complementares de DNA que sofrem hibridização. A ligação, formação de uma li gação fosfodiéster entre as regiões 5' e 3' do DNA, origina o DNA fechado e circular ligado de modo covalente, que pode sofrer replicação de maneira semelhante à utilizada por outros réplicons. A clivagem dos círculos produz DNA linear, acondi cionado em envelope proteicos, formando fagos-filhos. O DNA de fita simples de fagos filamentosos é convertido em uma forma replicativa circular de fita dupla. Uma fita da for ma replicativa é utilizada como modelo em um processo contí nuo que produz DNA de fita simples. O modelo consiste em um círculo de rotação, e o DNA de fita simples produzido é clivado e acondicionado com uma proteína para extrusão extracelular. Os fagos de RNA de fita simples estão entre as menores par tículas extracelulares que contêm informação capaz de permitir sua própria replicação. Por exemplo, o RNA do fago MS2 con tém (em menos de 4.000 nucleotídeos) três genes que podem atuar como RNAm após infecção. Um gene codifica a proteína do envelope, enquanto outro codifica uma RNA-polimerase que produz uma forma replicativa de RNA de fita dupla. O RNA de fita simples, produzido a partir da forma replicativa, é o cerne de novas partículas infecciosas. Alguns bacteriófagos temperados, exemplificados pelo fago Pl da E. coli, podem se estabelecer em um estado de pró-fago como plasmídeos. O DNA de fita dupla de outros bacteriófa gos temperados estabelece-se como pró-fago pela sua inserção no cromossomo do hospedeiro. O local de inserção pode ser muito específico, conforme exemplifica a integração do fago À da E. coli em um único locus int no cromossomo bacteriano. A especificidade da integração é determinada pela identidade da sequência de DNA compartilhada pelo locus cromossômico int e uma região correspondente no genoma do fago. Outros fagos temperados, como o Mu da E. coli, integram-se em qual quer um de uma ampla variedade de locais cromossômicos, e nesse aspecto assemelham-se aos transpósons.

CAPÍTULO 7

Os pró-fagos contêm genes necessários à replicação lítica (também denominada replicação vegetativa), e a expressão desses genes é reprimida durante a manutenção do estado de pró-fago. Uma manifestação de repressão é que um pró-fago estabelecido frequentemente confere imunidade celular con tra a infecção lítica por um fago semelhante. Uma cascata de interações moleculares deflagra a desrepressão (liberação da repressão), de modo que o pró-fago sofre replicação vegetativa, resultando na formação de muitas partículas infecciosas. Cer tos estímulos artificiais, como a luz ultravioleta (UV), podem causar a desrepressão do pró-fago. A mudança entre a lisoge nia - propagação do genoma do fago com o hospedeiro e o crescimento do fago vegetativo à custa da célula pode ser determinada, em parte, pelo estado fisiológico da célula. Uma bactéria que não se encontra em fase de replicação não irá sus tentar o crescimento vegetativo do fago, porém uma célula em crescimento ativo contém energia e subunidades formadoras suficientes para sustentar a rápida replicação do fago.

TRANSFERÊNCIA DE DNA Poder-se-ia presumir que a natureza haploide do genoma bac teriano limita a plasticidade do genoma de uma bactéria. No entanto, a ubiquidade de bactérias diversas no ambiente forne ce um conjunto abundante de genes que contribui para a sua notável diversidade genética, através de mecanismos de troca de material genético. A troca genética bacteriana é exemplifica da pela transferência de um fragmento relativamente pequeno de um genoma doador para uma célula receptora, seguida de recombinação genética. A recombinação genética bacteriana é um tanto diferente da fusão dos gametas observada com euca riotos. Ela exige que esse DNA doador seja replicado no mi crorganismo recombinante. A replicação pode ser obtida pela integração do DNA doador no cromossomo do receptor ou pelo estabelecimento do DNA do doador como réplicon in dependente.

Genética microbiana

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estritamente relacionado de bactérias. Outros, exemplificados por alguns plasmídeos de resistência a fármacos, replicam-se em uma ampla faixa de gêneros bacterianos. Em alguns casos, dois ou mais plasmídeos podem coexistir de modo estável em uma célula, porém outros pares irão interferir na replicação ou na divisão. Se tais plasmídeos forem introduzidos na mes ma célula, um deles será perdido a uma taxa maior do que o normal quando a célula sofrer divisão. Esse fenômeno é denominado incompatibilidade dos plasmídeos; dois plas mídeos incapazes de coexistir de modo estável pertencem ao mesmo grupo de incompatibilidade (Inc), e dois plasmídeos capazes de exibir coexistência estável pertencem a grupos lnc diferentes.

Mecanismos de recombinação O DNA doador que não transporta a informação necessária à sua própria replicação precisa recombinar-se com o DNA receptor para se estabelecer em uma cepa receptora. A recom binação pode ser homóloga, uma consequência da estreita se melhança nas sequências do DNA doador e do DNA receptor, ou não homóloga, constituindo o resultado da recombinação enzimaticamente catalisada entre sequências diferentes de DNA. A recombinação homóloga quase sempre envolve uma troca entre genes que compartilham uma ancestralidade co mum. O processo exige um conjunto de genes designados rec. A recombinação não homóloga depende de enzimas codifica das pelo DNA integrado, sendo mais claramente exemplificada pela inserção do DNA em um receptor para formar uma cópia de um transpóson doador. O mecanismo de recombinação mediado pelos produtos gênicos rec é recíproco: a introdução de uma sequência doa dora em um receptor se reflete pela transferência da sequência homóloga do receptor no DNA do doador. As atenções cien tíficas estão sendo cada vez mais dirigidas para o papel de sempenhado pela conversão de genes - a transferência não recíproca de sequências de DNA do doador para o do receptor - na aquisição da diversidade genética.

Restrição e outras limitações na transferência de genes

Mecanismos de transferência de genes

As enzimas de restrição (endonucleases de restrição) proporcio nam às bactérias um mecanismo para distinguir em seu próprio DNA daquele de outras fontes biológicas e hidrolisam (clivam) o DNA em locais de restrição determinados por sequências espe cíficas de DNA que variam de 4 a 13 bases. Cada cepa bacteriana que possui um sistema de restrição tem a capacidade de mas carar esses locais de reconhecimento no seu próprio DNA ao modificá-los mediante a metilação de um resíduo de adenina ou citosina dos mesmos. Tais sistemas de modificação de restrição podem ser divididos em duas grandes classes: os sistemas tipo I, em que as atividades de restrição e modificação são combinadas em uma única proteína de inúmeras subunidades; e os sistemas tipo li, que consistem em endonucleases e metilases distintas. Uma consequência biológica direta da restrição pode consistir na clivagem do DNA doador antes de ter a oportunidade de se estabelecer como parte de um réplicon recombinante, tornando a bactéria "imune" a esse DNA. Alguns plasmídeos exibem limitada variedade de hospe deiros e são capazes de se replicar unicamente em um grupo

A composição do DNA dos microrganismos é extraordinaria mente fluida. O DNA pode ser transferido de um organismo para outro e incorporado de modo estável no receptor, alte rando permanentemente sua composição. Esse processo é cha mado de transferência horizontal de genes, para diferençiá-lo da herança de genes parentais, um processo chamado herança vertical. Três mecanismos principais são responsáveis pelo movimento eficiente do DNA entre as células - conjugação, transdução e transformação. A conjugação requer o contato da célula doadora com a cé lula receptora para transferir apenas uma fita de DNA (Fig. 7.6). O receptor completa a estrutura do DNA de fita dupla sinte tizando a fita que complementa aquela adquirida a partir do doador. Na transdução, o DNA do doador é transportado em um envelope de fago e transferido para o receptor pelo meca nismo utilizado na infecção por fagos. A transformação, que se refere à captação direta do DNA "nu" do doador pela célula receptora, pode ser natural ou forçada. A transformação for çada é induzida em laboratório, em que, após tratamento com

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SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia Doador

Receptor

Formação de pares de acasalamento

Entalhe da fita simples em oriT e deslocamento da fita

Doador

A. Conjugação

Os plasmídeos são frequentemente transferidos por conju gação. As funções genéticas necessárias à transferência são codificadas pelos genes tra, transportados por plasmídeos autotransmissíveis. Alguns plasmídeos autotransmissíveis são capazes de mobilizar outros plasmídeos ou porções do cromos somo para a transferência. Em alguns casos, a mobilização é obtida pelo fato de os genes tra fornecerem as funções necessá rias à transferência de um plasmídeo que, de outro modo, não seria transmissível (Figs. 7.7 e 7.8). Em outros casos, o plasmí deo autotransmissível integra-se ao DNA de outro réplicon e, como extensão de si próprio, transporta uma fita desse DNA para uma célula receptora.

Transferência da fita e replicação

Plasmídeo autotransmissível codifica funções tra que possibilitam o contato entre as células

Separação do par de acasalamento

Entalhe efetuado na oriTdo plasmídeo mobilizável

Transconjugante

FIGURA 7.6 Mecanismo de transferência do DNA durante a con jugação. A célula doadora produz um pilus, codificado pelo plasmí deo, e estabelece contato com uma célula receptora potencial que não contém o plasmídeo. A retração do pilus determina um estreito contato entre as células, e forma-se um poro nas membranas celu lares contíguas. A formação do par de acasalamento constitui o sinal para que o plasmídeo inicie a transferência a partir de um entalhe da fita simples na oriT. O entalhe é feito por funções tra codificadas pelo plasmídeo. A extremidade 5' de uma fita simples do plasmídeo é transferida para o receptor através do poro. Durante a transferência, o plasmídeo no doador é replicado, sendo a síntese do DNA iniciada pela 3' OH do entalhe oriT. A replicação da fita simples no receptor prossegue por um mecanismo diferente com primers de RNA. Nesse estágio, ambas as células contêm plasmídeos de fita dupla, e o par de acasalamento separa-se. (Redesenhada, com autorização, de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics ofBacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed. 2002.)

alta concentração de sal e choque térmico, muitas bactérias tornam-se competentes para a captação dos plasmídeos ex tracelulares. A capacidade de forçar bactérias a incorporarem plasmídeos extracelulares por transformação é fundamental na engenharia genética.

Plasmídeo mobilizável é transferido

Plasmídeo mobilizável é replicado no receptor

FIGURA 7.7 Mecanismo de mobilização de plasmídeos. A célula doadora transporta dois plasmídeos, um autotransmissível, F, o qual codifica as funções tra que promovem o contato entre as células e a transferência do plasmídeo, bem como um plasmídeo mobilizável. As funções mob codificadas pelo plasmídeo mobilizável efetuam um entalhe da fita simples em oriT na região mob. Em seguida, ocorrem a transferência e a replicação do plasmídeo mobilizável. O plasmídeo autotransmissível também pode ser transferido. (Redesenhada, com autorização, de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics of Bacteria, Washington, DC: ASM Press, 2nd ed., 2002.)

CAPÍTULO 7 Genética microbiana *

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FIGURA 7.8 "Célula-macho" e "célula-fêmea" unidas por um pilus F (pilus sexual). (8) Pares acasalados de células de E. coli. As células Hfr são alongadas. (C) Micrografia eletrônica de um corte fino de um par em acasalamento. As paredes celulares das bactérias acasaladas estão em íntimo contato na área da "ponte". (A fotografia [A] foi cortesia de Carnahan J e Brinton C. As fotografias [BJ e [CJ foram reproduzidas, com autorização, de Gross JD and Caro LG: DNA transfer in bacterial conjugation. J Mo/ Bío/ 1966;16:269.)

A análise genética da E. eoli progrediu enormemente com a elucidação dos fatores de fertilidade transportados por um plasmídeo denominado f+. Esse plasmídeo confere determina das características do doador às células, como um pilus sexual, uma proteína de extrusão multimérica extracelular que liga as células doadoras aos microrganismos receptores que carecem do fator de fertilidade. Uma ponte entre as células possibilita que uma fita do plasmídeo f+, sintetizado pelo doador, passe para o receptor, onde a fita complementar de DNA é formada. O fator de fertilidade f+ pode integrar-se em inúmeros Zoei no cromossomo das células doadoras. O fator de fertilidade inte grado cria doadores de alta frequência de recombinação (Hfr) a partir dos quais o DNA cromossômico é transferido (do local de inserção) em uma direção determinada pela orientação da inserção (Fig. 7.9). A taxa de transferência cromossômica das células Hfr é constante, e a compilação dos resultados de muitos experimen tos de conjugação possibilitou a preparação de um mapa gené tico da E. eoZi, em que as distâncias entre os Zoei são medidas em número de minutos necessários para que ocorra a trans ferência na conjugação. Um mapa semelhante foi construído para a SalmoneZZa typhimurium, uma bactéria coliforme (tipo E. eoZi) relacionada, onde a comparação entre os dois mapas mostra padrões relacionados de organização gênica entre as duas espécies bacterianas. Procedimentos análogos com outros plasmídeos possibi litaram aos pesquisadores mapear os cromossomos circula res de membros de gêneros bacterianos distantes; assim, por exemplo, os plasmídeos de resistência a fármacos, denomi nados fatores R, podem promover a transferência cromossô mica de diferentes bactérias, como espécies de Pseudomonas. A comparação dos mapas cromossômicos de Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida mostra que a divergência dessas duas espécies estreitamente relacionadas foi acom panhada de um número pequeno, embora significativo, de rearranjos genéticos. Os mapas da Pseudomonas têm pouco em comum com os mapas das bactérias coliformes biologica mente distantes.

A integração do DNA cromossômico em um plasmídeo conjugativo pode produzir um réplicon recombinante - um prime F (fertilidade) ou um prime R (resistência), dependendo do plasmídeo - no qual o DNA cromossômico integrado pode ser replicado no plasmídeo independentemente do cromosso mo, o que ocorre quando o plasmídeo integrado (p. ex., F) é flanqueado por duas cópias de um elemento de IS. As bacté rias que transportam cópias de genes, um conjunto completo no cromossomo e um conjunto parcial em um prime, são di ploides parciais ou merodiploides, e mostram-se úteis para estudos de complementação. Com frequência, um gene do ti po selvagem complementa seu homólogo mutante, e a seleção do fenótipo do tipo selvagem pode possibilitar a manutenção de merodiploides em laboratório. Tais cepas podem tornar possível a análise das interações entre diferentes alelos, isto é, variantes genéticas do mesmo gene. Com frequência, os mero diploides são geneticamente instáveis, visto que a recombina ção entre o plasmídeo e o cromossomo homólogo pode resultar em perda ou troca de alelos mutantes ou do tipo selvagem. Esse problema pode frequentemente ser evitado pela manutenção de merodiploides em uma base genética em que o gene reeA, necessário à recombinação entre segmentos homólogos de DNA tenha sido inativado. Os genes homólogos de diferentes microrganismos podem ter divergido a ponto de impedir a recombinação homóloga en tre eles, mas sem alterar a capacidade de um gene complemen tar a atividade ausente do outro. Por exemplo, é improvável que a origem genética de uma enzima necessária à biossíntese dos aminoácidos influencie a atividade catalítica no citoplasma de um hospedeiro biologicamente distante. Um merodiploi de que transporte um gene para essa enzima também trans portaria genes flanqueadores provenientes do microrganismo doador. Por conseguinte, a genética microbiana convencional, baseada na seleção de plasmídeos iniciais, pode ser utilizada para isolar genes de microrganismos exigentes na E. eoZi ou na P. aeruginosa. A importância dessa tecnologia reside na sua capacidade de simplificar ou evitar os procedimentos relativa mente dispendiosos exigidos pela engenharia genética.

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SEÇÃO 1 Fundamentos da Microbiologia Hfr

O plasm ídeo F codifica funções tra, incluindo pili

Um entalhe em oriT inicia a transferência

A replicação ocorre no doador com a transferência de uma fita

O fragmento transferido sofre recombinação no receptor

Hfr Transferência do DNAcromossômico por um plasmídeo integrado. A formação de pares acasalados, o entalhamento ou corte da sequência oriT de F e a transferência da extremidade 5' de uma fita simples de DNA do F prosseguem como na transferência do plasmídeo F. A transferência de um DNA cromossômico ligado covalentemente também ocorrerá enquanto o par acasalado for estável. A transferência cromossômica completa raramente ocorre, de modo que a célula re ceptora permanece F- mesmo após o acasalamento. Em geral, a trans ferência do DNA é acompanhada de replicação no doador. Além disso, pode ocorrer alguma replicação da fita simples transferida. Uma vez no interior da célula receptora, o DNA transferido pode se recombinar com sequências homólogas no cromossomo receptor. (Redesenhada, com autorização, de Snyder L, Champness W: Molecular Genetics ofBacteria Washington, DC: ASM Press 2nd ed. 2002.) FIGURA 7.9

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B. Transdução A transdução é a recombinação genética mediada por fagos nas bactérias. Em termos mais simples, uma partícula trans dutora pode ser considerada o ácido nucleico bacteriano em um envelope de fago. Mesmo uma população de fagos líticos pode conter algumas partículas nas quais o envelope do fago circunda o DNA proveniente da bactéria, e não do fago. Essas populações têm sido utilizadas para transferir genes de uma

bactéria para outra. Os fagos temperados são os veículos pre feridos para a transferência de genes, visto que a infecção de bactérias receptoras em condições que favorecem a lisogenia minimiza a lise celular e, por isso, favorece a sobrevida das cepas recombinantes. De fato, uma bactéria receptora, trans portando um pró-fago apropriado, pode formar um repressor, tornando a célula imune a infecção lítica; tais células podem, ainda, captar o DNA bacteriano de partículas transdutoras. Em condições que favorecem o ciclo dos fagos líticos, é pos sível preparar misturas transdutoras transportando DNA do doador. Em geral, o tamanho do DNA nas partículas transdutoras não ultrapassa certa porcentagem do cromossomo bacteriano, de modo que a cotransdução - transferência de mais de um gene de uma vez - limita-se aos genes bacterianos ligados. Es se processo é de grande valia no mapeamento dos genes situa dos muito próximos uns dos outros para serem colocados em ordem pelo método de transferência por conjugação. As ilhas de patogenicidade são frequentemente transpor tadas por fagos. Por exemplo, dois fagos transportam ilhas de patogenicidade responsáveis pela conversão de uma forma benigna do Vibrio cholerae na forma patogênica responsável pela cólera epidêmica (ver Cap. 17). Esses fagos codificam ge nes para a toxina do cólera (responsável pelos sintomas) e dos pili bfp (Bunble forming pili) formadores de tufos responsáveis pela aderência. A velocidade com que os fagos se combinam e se replicam fez com que eles se tornassem objeto central para o estudo desses processos, tendo surgido muitas generalizações acerca dos mecanismos subjacentes a partir da genética dos fagos. A capacidade dos fagos de efetuar rápidas réplicas de seu DNA torna-os valiosos para a engenharia genética. De especial va lor são os fagos recombinantes elaborados por engenharia que contêm inserções de DNA de outras fontes biológicas. O DNA inserido pode ser replicado com a velocidade que carac teriza o DNA do fago e recuperado em uma forma útil para manipulação.

C. Transformação A captação direta do DNA do doador por bactérias receptoras depende de sua competência para transformação. A competên cia natural dessa propriedade é pouco comum entre bactérias, sendo algumas dessas cepas passíveis de transformação apenas na presença de fatores de competência produzidos unicamen te em um ponto específico do ciclo de crescimento. Outras cepas sofrem transformação natural facilmente, mostrando-se esses microrganismos promissores para a engenharia genética devido à facilidade com que incorporam o DNA modificado em seus cromossomos. Bactérias passíveis de transformação e naturalmente competentes são encontradas em diversos gêne ros, como o Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumo niae. Os fragmentos de DNA contendo genes desses micror ganismos podem ser facilmente identificados com base na sua capacidade de transformar células mutantes no tipo selvagem. Tais técnicas representam um substancial avanço com relação aos procedimentos trabalhosos utilizados por Avery e seus co legas para demonstrar que o princípio de transformação do pneumococo era o DNA (ver Fig. 7.1).

CAPÍTULO 7

A transformação genética é reconhecida como uma das forças principais na evolução microbiana. A transformação natural é um processo ativo que exige proteínas específicas produzidas pela célula receptora. Para Neisseria e espécies de Haemophilus, são necessárias sequências de DNA específicas (sequências de captação) para a captação do DNA. Essas se quências de captação são específicas da espécie, o que restringe a troca genética a uma única espécie. O DNA não incorporado pode ser degradado e usado como fonte de nutrientes de apoio ao crescimento microbiano. As bactérias são, em sua maior parte, incapazes de sofrer transformação natural. Nesses casos, a transformação pode ser forçada mediante tratamento com cloreto de cálcio e choque térmico. A transformação com plasmídeos recombinantes, obtidos por engenharia genética por esse processo, constitui a pedra angular da biologia molecular moderna, visto que possi bilita que o DNA de diversas fontes biológicas seja estabelecido como parte de réplicons bacterianos bem caracterizados.

MUTAÇÃO E REARRANJO DE GENES Mutações espontâneas Em geral, as mutações espontâneas para determinado gene em uma situação normal (gene selvagem) geralmente ocorrem a uma frequência de 10-6 a 10-s em uma população provenien te de uma única bactéria (dependendo da espécie bacteriana e das condições usadas para identificar a mutação). As mutações consistem em substituições, deleções, inserções e rearranjos de bases. As substituições de bases podem surgir em decorrên cia do emparelhamento incorreto entre bases complementares durante a replicação. Em E. coli, esse processo ocorre cerca de uma vez a cada 1010 vezes em que o microrganismo incorpora um nucleotídeo; trata-se de um processo notavelmente raro. A ocorrência de bases não pareadas é minimizada por enzimas associadas ao reparo de combinação imprópria, mecanismo que essencialmente efetua a revisão de uma fita recém-sinteti zada para assegurar que seja perfeitamente complementar ao seu molde. As enzimas de combinação imprópria distinguem a fita recém-sintetizada da fita preexistente com base na me tilação da adenina nas sequências GATC da fita preexistente. Quando o dano ao DNA é grande, um sistema de reparo espe cial do DNA, a resposta SOS, recupera as células cujo DNA foi danificado. A resposta SOS é uma pós-replicação do sistema de reparo do DNA que possibilita que a replicação do DNA burle as lesões ou erros no DNA. Muitas substituições de base escapam à detecção no nível fenotípico porque não alteram significativamente a função do produto gênico. Por exemplo, as mutações de sentido errado (missense), que resultam na substituição de um aminoácido por outro, podem não ter efeito fenotípico discernível. As mu tações sem sentido (nonsense) interrompem a síntese das pro teínas e, por isso, resultam em uma proteína truncada no local da mutação. Os produtos gênicos das mutações sem sentido em geral são inativos. Os rearranjos são o resultado de deleções que removem grandes porções ou mesmo grupos de genes. Essas grandes deleções envolvem recombinação entre sequências diretamen te repetidas (p. ex., elementos de IS) e quase nunca sofrem

Genética microbiana

111

reversão. Outras mutações provocam a duplicação, frequen temente em série, de comprimentos comparáveis de DNA. Em geral, essas mutações são instáveis e revertem facilmente. Outras mutações podem inverter sequências longas de DNA ou transferi-las para novos Zoei. Mapas genéticos comparati vos de cepas bacterianas relacionadas têm mostrado que tais rearranjos podem ser fDCados nas populações naturais. Essas observações apontam para o fato de que a separação linear de fragmentos de DNA não elimina por completo as possibilida des de interação física e química entre eles.

Mutágenos A frequência de mutação é grandemente aumentada pela ex posição das células a mutágenos. A luz ultravioleta é um mutá geno físico que danifica o DNA pela ligação de bases timinas vizinhas formando dímeros. Erros de sequência podem ser in troduzidos durante o reparo enzimático desse dano genético. Os mutágenos químicos podem atuar ao alterarem a estrutura química ou a estrutura física do DNA. As substâncias químicas reativas alteram a estrutura das bases no DNA. Por exemplo, o ácido nitroso (HN02) substitui grupos hidroxila por grupos amino. O DNA resultante apresenta atividade de modelo al terada durante os ciclos subsequentes de replicação. As mu tações por deslocamento - introdução ou remoção de um único par de bases do DNA - são causadas por deslizamento leve das fitas de DNA, favorecido por exposição aos corantes de acridina (p. ex., laranja de acridina), que podem intercalar se entre as bases. Em geral, os efeitos diretos dos mutágenos químicos ou fí sicos constituem danos ao DNA. As mutações resultantes são introduzidas pelo processo de replicação e escapam das enzi mas descritas anteriormente. As mutações que modificam a atividade de replicação ou reparo dessas enzimas podem tor nar uma bactéria mais suscetível a mutágenos biológicos, e são designadas como uma cepa mutadora.

Reversão e supressão A recuperação de uma atividade perdida em consequência da mutação, denominada reversão fenotípica, pode ou não resul tar da restauração da sequência original do DNA, como seria exigido pela reversão genotípica. Com frequência, uma muta ção em um segundo locus, denominado mutação supressora, restaura a atividade perdida. Na supressão intragênica, após a mutação primária ter modificado a estrutura de uma enzi ma com a consequente perda de sua atividade, a ocorrência de uma segunda mutação em local diferente no gene da enzima restaura a estrutura necessária à atividade. A supressão extra gênica é produzida por uma segunda mutação fora do gene originalmente afetado.

EXPRESSÃO GÊNICA A enorme separação evolutiva observada entre os genomas eucarióticos e procarióticos é ilustrada quando se comparam seus mecanismos de expressão gênica, que compartilham so mente um pequeno subgrupo de propriedades. Em ambos os grupos, a informação genética é codificada no DNA, transcrita

112

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

no RNAm e traduzida nos ribossomos pelo tRNA em estrutura de proteínas. Os códons de nucleotídeos triplos, utilizados na tradução, são, em geral, compartilhados, e muitas enzimas as sociadas à síntese das macromoléculas nos dois grupos biológi cos exibem propriedades semelhantes. O mecanismo pelo qual a sequência de nucleotídeos, em determinado gene, estabelece a sequência de aminoácidos em uma proteína é muito similar em eucariotos e procariotos, como se segue:

1. A RNA polimerase forma uma única fita de polirribonu cleotídeo, denominado RNA mensageiro (RNAm), utili zando o DNA como modelo; esse processo denomina-se transcrição. O RNAm possui uma sequência de nucleotí deos complementar a uma fita-modelo na dupla hélice de DNA (lido na direção de 3-5'). Desse modo, um RNAm é orientado na direção 5'-3'. 2. Os aminoácidos são ativados enzimaticamente e transfe ridos para moléculas adaptadoras específicas de RNA, de nominadas RNA de transferência (RNAt). Cada molécula adaptadora possui uma tríade de bases (anticódon) com plementar a uma tríade de bases no RNAm e, em uma das extremidades do seu aminoácido específico. A tríade de ba ses no RNAm é denominada códon para esse aminoácido. 3. O RNAm e o RNAt juntam-se na superfície do ribossomo. À medida que cada RNAt encontra sua tríade de nucleo tídeos complementares no RNAm, o aminoácido que ele transporta é colocado em uma ligação peptídea com o ami noácido da molécula de RNAt anterior (vizinho). A enzima peptidiltransferase (na verdade, o RNA 23S, i. e., uma ribo zima) catalisa a formação da ligação peptídea. O ribossomo move-se ao longo do RNAm, com crescimento sequencial do polipeptídeo até que toda a molécula de RNAm tenha si do traduzida em uma sequência correspondente de amino ácidos. Esse processo, denominado tradução, é apresentado em forma de diagrama na Figura 7.10. Em procariotos, genes associados a funções relacionadas estão normalmente agrupados em óperons. Uma vez que não há núcleo, a transcrição e a tradução são acopladas, o que significa que o RNAm produzido liga-se a um ribossomo e é traduzido ao mesmo tempo em que é transcrito. Esse sistema acoplado de transcrição e tradução possibilita uma resposta rápida a mudanças no ambiente. Da mesma forma, o RNAm é rapidamente revertido, passando a ter uma meia-vida da or dem de segundos a minutos. Em eucariotos, esse tipo de agrupamento entre genes re lacionados é incomum. As sequências ativadoras são regiões de DNA eucariótico que aumentam a transcrição, podendo es tar localizadas a certa distância do gene transcrito. Os genes eucarióticos transportam íntrons, inserções de DNA que não são encontradas nos genes procarióticos. Os íntrons separam os éxons, isto é, as regiões de codificação dos genes eucarió ticos. Os íntrons transcritos são removidos das transcrições eucarióticas durante o processamento do RNA por uma série de reações enzimáticas que ocorrem no núcleo. O RNAm dos eucariotos é poliadenilado no final 3', protegendo-o das exo nucleases e podendo, dessa forma, atravessar a membrana nu clear para o citosol, onde os ribossomos estão localizados; nesse caso, a tradução é desacoplada da transcrição. Devido a essa poliadenilação, os RNAms eucarióticos possuem meia-vida da ordem de horas ou dias.

Os ribossomos eucarióticos e procarióticos diferem em muitos aspectos. Os ribossomos eucarióticos são maiores, apresentando coeficiente de sedimentação de SOS em com paração com o coeficiente de sedimentação de 70S dos ri bossomos procarióticos. As subunidades ribossômicas 40S e 60S dos eucariotos são maiores do que as correspondentes subunidades ribossômicas 30S e SOS dos procariotos, e os ribossomos eucarióticos são relativamente ricos em proteí na. Diferenças significativas são inerentes à sensibilidade das atividades ribossômicas aos antibióticos (p. ex., tetraci clina), muitos dos quais inibem seletivamente a síntese das proteínas no citoplasma procariótico, mas não no eucariótico (ver Cap. 9). Entretanto, é preciso lembrar que os ribosso mos mitocondriais dos eucariotos assemelham-se aos dos procariotos.

Regulação da expressão gênica procariótica Proteínas específicas, produtos de genes reguladores, determi nam a expressão dos genes estruturais que codificam enzimas. A transcrição do DNA em RNAm começa no promotor, a sequência de DNA que se liga à RNA polimerase. O nível de expressão gênica é determinado pela capacidade do promotor de se ligar à polimerase, e a eficácia intrínseca dos promotores difere amplamente. Outros controles da expressão gênica são exercidos por proteínas reguladoras que podem se ligar a re giões do DNA próximas aos promotores. Muitos genes estruturais procarióticos, que codificam uma série de reações metabólicas relacionadas, são agrupados em óperons. Essas séries contíguas de genes são expressas em for ma de um único RNAm transcrito, e a expressão da transcrição pode ser regida por um único gene regulador. Por exemplo, cinco genes associados à biossíntese do triptofano estão agru pados no óperon trp da E. coli. A expressão gênica é regida por atenuação, conforme descrita adiante, e também é controlada por repressão. A ligação do aminoácido triptofano por uma proteína repressora fornece a este uma configuração que pos sibilita sua fixação ao operador trp, uma curta sequência de DNA que ajuda a regular a expressão gênica. A ligação da pro teína repressora ao operador impede a transcrição dos genes trp, uma vez que a bactéria percebe com essa ligação que já existe triptofano suficiente para seu metabolismo normal. A repressão pode ser encarada como um mecanismo de contro le em curso, um enfoque tipo tudo-ou-nada para a regulação gênica. Essa forma de controle independe da atenuação, um mecanismo de sintonia fina que também é utilizado para de terminar a expressão dos genes trp. A atenuação é um mecanismo regulador de algumas ro tas de biossíntese (p. ex., a via biossintética do triptofano) que controlam a eficiência da transcrição depois que ela ti ver se iniciado mas antes que a síntese do RNAm dos genes do óperon ocorra, especialmente quando o produto final da via esteja estocado em pequena quantidade. Por exemplo, em condições normais de crescimento, a maior parte dos RNAm do trp transcritos termina antes de alcançarem os ge nes estruturais do óperon trp. Entretanto, durante os perío dos de grave escassez de triptofano, o término prematuro da transcrição é abolido, possibilitando a expressão do ópe ron em níveis 10 vezes mais altos do que em condições nor mais. A explicação para este fenômeno baseia-se na sequência

CAPÍTULO 7

®1

NH NH2 1 1 AA1 AA2 1 1 C=OC=O 1 1

1

1 11 I

IAA11

1 C=O 1 o

-

o

Local B \

'

'

- -

- Anticódon 2

\ '

'

1

'

-

' '

1

o

\

1

'

1

'

1

' '

1

1 1

RNAm Códon

1

1

1

1

2

1

1

L - ...1

3

RNAm

4

1

1

2

®1

I 1

RNAt1

>$�

I I

0/ o,.,. \\ o

1

1 1

I

1

1 1

- -

OH \

'

1

- Anticódon 3

'

'

1

'

1

'

' '

L - ...1

RNAm

1

'

'

1

'

'

'

1

NH2 1 AA1 1 C=O 1 NH 1 AA2 1 C=O 1

I I

�

o

\

4

I 1

NH 1 AA2 1 C=O 1

I

3

®1

NH 1 AA1 1 C=O

o�

\

'

'

'

'

113

®1

NH

Local A

Genética microbiana

\

o

'

1

1

1

1

'

1 1 1 1

1

1

\

1

1 1 1 1 1 1 1

Ili Ili Ili Ili 1 2 4 3

FIGURA 7.10 Quatro estágios no alongamento de uma cadeia polipeptídea sobre a superfície de um ribossomo 705. Em cima, à esquerda: Molécula de RNAt transportando o anticódon complementar ao códon 1 em uma das extremidades e AA.,. Na outra, liga-se ao local A. AA., está ligado ao RNAt através do seu grupo carboxila; o nitrogênio amino apresenta um grupo formil (F). Em cima, à direita: Molécula de RNAt, trans portando AA2, liga-se ao local B; seu anticódon é complementar ao códon 2. Embaixo, à direita: Complexo enzimático catalisa a transferência de AA., para o grupo amino de AA2, formando uma ligação peptídea. (Observe que a transferência na direção oposta é bloqueada pela formilação prévia do grupo amino de AA1 .) Embaixo, à esquerda: O ribossomo move-se para a direita, a fim de que os locais A e B fiquem agora opostos aos códons 2 e 3; no processo, o RNAt1 é deslocado, e o RNAt2 move-se para o local A. O local B novamente está desocupado e pronto para aceitar o RNAt3 transportando AA3* (Quando o peptídeo se encontra completo e é liberado, o grupo formil é removido enzimaticamente.) (Redesenha da e reproduzida, com autorização, de Stanier RY, Doudoroff M, Adelberg EA: The Microbial Wor/d, 3rd ed. Copyright © 1970. Prentice-Hall, lnc., Englewood Cliffs, NJ.)

regulatória de 162 pb, situada à frente dos genes estruturais trp (Fig. 7.11), conhecidos como sequência-líder ou trpL. A sequência-líder trp pode ser transcrita no RNAm e traduzida subsequentemente em um polipeptídeo de 14 aminoácidos com dois resíduos de triptofano adjacentes, uma ocorrência muito rara. No final do trpL e posterior aos sinais regulatórios que controlam a tradução dos genes estruturais trp, encontra se um terminador Rho-independente. A sequência do DNA dessa região sugere que o RNAm codificado tem alta proba bilidade de formar estruturas secundárias em forma de alça, nomeadas alça de pausa ( 1 :2), alça de terminação (3:4) e alça de antiterminação (2:3). A atenuação do óperon trp usa a

estrutura secundária do RNAm para sentir a quantidade de triptofano na célula (como RNAt-trp), conforme o modelo mostrado na Figura 7 . 1 1 . A prevenção da transcrição por uma proteína repressora é denominada controle negativo. A forma oposta de regulação da transcrição - a iniciação da transcrição em resposta à liga ção de uma proteína ativadora - chama-se controle positivo. Ambas as formas de controle são exercidas sobre a expressão do óperon lac, genes associados à fermentação da lactose na E. coli. O óperon contém três genes estruturais. O transporte de lactose para o interior da célula é mediado pelo produto do gene lacY. A �-galactosidase, a enzima que hidrolisa a lactose

114

SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia Terminador Rho-independente P1 o

RBS

� p

trpL

RBS

AUG

trpE

AUG

RNA polimerase

DNA

Passo 1 AUG

Passo 2 1

2

AUG

Passo 3

2

UGGUGG Passo 4 1 3

4

UGGUGG Passo alternativo 4 4 2

3

UGGUGG Passo alternativo 5 4 2

3

RBS

trpE

UGGUGG FIGURA 7.11 Predições do modelo de atenuação. (Passo 7) A transcrição/tradução ocorre como para qualquer gene bacteriano. (Passo 2) A RNA polimerase para, e ocorre a formação de uma alça na posição 1:2. (Passo 3) Interrupção do ribossomo na alça 1:2 e encontro de dois códons trp. (Passo 4) Se existe triptofano em quantidade suficiente, os RNAt-trp correspondentes serão apresentados, e os ribossomos irão traduzir trpl. Isso levará a uma parada da RNA polimerase no terminador Rho-independente, composto por uma alça em 3:4. (Passo alternativo 4) Se o triptofano é limitante (ausência de RNAt-trp), o ribossomo para em dois códons trp, enquanto a RNA polimerase continua. Forma-se uma alça na posição 2:3. (Passo alternativo 5) O terminador 3:4 pode não se formar, e a RNA polimerase continua a transcrição dos genes estruturais trp. Isso expõe o local de ligação do ribossomo (RBS) acima de trpE, possibilitando a tradução. (Reproduzida, com autorização, de Trun N, Trempy J: Fundamental Bacterial Genetics. Blackwell Science Ltd., 2004.)

em galactose e glicose, é codificada pelo gene lacZ. O produto do terceiro gene (lacA) é uma transacetilase, cuja função fisio lógica ainda não foi claramente elucidada. Como subproduto de sua função normal, a �-galactosidase produz alolactose, um isômero estrutural da lactose. A própria

lactose não influi na regulação transcricional; em vez disso, es sa função é exercida pela alolactose, o indutor do óperon lac, uma vez que é o metabólito que evoca mais diretamente a ex pressão gênica. Na ausência de alolactose, o repressor lac, um produto do gene lacl controlado independentemente, exerce

CAPÍTULO 7 Genética microbiana controle negativo sobre a transcrição do óperon lac ao ligar-se ao operador lac. Na presença do indutor, o repressor é liberado do operador, e ocorre a transcrição. A expressão do óperon lac e de muitos outros óperons as sociados à geração de energia é intensificada pela ligação da proteína de ligação do AMP cíclico (CAP, na sigla em inglês) a uma sequência específica do DNA situada próximo ao pro motor do óperon regulado. A proteína exerce controle positivo pelo aumento da atividade da RNA polimerase. O metabóli to que desencadeia o controle positivo pela ligação à CAP é o 3',5'-AMP cíclico (AMPc). Esse composto, formado em cé lulas privadas de energia, atua através da CAP para aumentar a expressão das enzimas catabólicas que produzem energia metabólica. O AMP cíclico não é o único na sua capacidade de exercer controle sobre os genes não ligados na E. coli. Vários genes di ferentes respondem ao nucleotídeo ppGpp (em que "p" deno ta fosfodiéster, e "G", guanina) como um sinal de escassez de aminoácidos, e os genes não ligados são expressos como parte da resposta SOS ao dano ao DNA. Outro conjunto de genes não ligados também atua na resposta ao choque térmico.

ENGENHARIA GENÉTICA A engenharia é a aplicação da ciência às necessidades sociais. Nas últimas quatro décadas, a engenharia baseada na genética bacteriana transformou a biologia. É possível isolar e ampli ficar fragmentos específicos de DNA, e seus genes podem ser expressos em altos níveis. A especificidade de nucleotídeos ne cessária à clivagem por enzimas de restrição possibilita a liga ção (ou incorporação) de fragmentos que contenham genes ou partes de genes em plasmídeos ("vetores"), que podem, por sua vez, ser usados para transformar células bacterianas. As colô nias bacterianas, ou clones que transportam genes específicos, podem ser identificadas por hibridização do DNA ou do RNA com sondas marcadas (semelhante ao que se vê na Fig. 3.4). Ou então, os produtos proteicos codificados pelos genes po dem ser reconhecidos pela atividade enzimática ou por meio de técnicas imunológicas. Estes últimos procedimentos têm si do facilitados pela notável seletividade com que os anticorpos monoclonais (Cap. 8) se ligam a determinantes antigênicos específicos nas proteínas. Assim, as técnicas de engenharia ge nética podem ser utilizadas para isolar praticamente qualquer gene, e muitos deles podem ser expressos como uma proprie dade reconhecível bioquimicamente, que pode ser estudada ou explorada. Os genes isolados podem ser utilizados para uma varie dade de propósitos. A mutagênese sítio-dirigida para o local pode identificar e alterar a sequência do DNA de um gene. Em seguida, resíduos de nucleotídeos essenciais à função do gene podem ser determinados e, se for desejável, alterados. Pe las técnicas de hibridização, o DNA pode ser utilizado como sonda para reconhecer os ácidos nucleicos correspondentes à sequência complementar de seu próprio DNA. Por exemplo, um vírus latente em um tecido animal pode ser detectado com uma sonda de DNA, mesmo na ausência de uma infecção vi ral evidente. Os produtos proteicos de genes virais isolados mostram-se muito promissores para uso como vacinas, vis to que podem ser preparados sem os genes que codificam a

115

replicação do ácido nucleico viral. Além disso, certas proteí nas que desempenham funções úteis, como a insulina, podem ser preparadas em grandes quantidades a partir de bactérias que expressam genes clonados.

Preparação de fragmentos de DNA com enzimas de restrição A diversidade genética das bactérias reflete-se na sua extensa variedade de enzimas de restrição disponíveis, que exibem considerável seletividade, que possibilita o reconhecimento de regiões específicas do DNA para clivagem. As sequências de DNA reconhecidas pelas enzimas de restrição são predo minantemente palindrômicas (repetições de sequências in vertidas). Uma sequência palindrômica típica, reconhecida pela enzima de restrição frequentemente utilizada EcoRl, é GAATTC; a repetição invertida, inerente à complementari dade dos pares de bases G-C e A-T, resulta na sequência 5' TTC, refletida como AAG na fita 3'. O comprimento dos fragmentos de DNA produzidos por enzimas de restrição varia enormemente, devido à individuali dade das sequências de DNA. O comprimento médio do frag mento de DNA é determinado, em grande parte, pelo número de bases específicas reconhecidas por uma enzima. As enzimas de restrição reconhecem, em sua maioria, 4, 6 ou 8 sequências de bases; entretanto, outras enzimas de restrição reconhecem 10, 11, 12 ou 15 sequências de bases. O reconhecimento de quatro bases produz fragmentos com comprimento médio de 250 pares de bases (pb) e, por conseguinte, é geralmente útil para a análise ou manipulação de fragmentos de genes. Genes completos são frequentemente abrangidos por enzimas de res trição que reconhecem 6 bases e produzem fragmentos com tamanho médio de cerca de 4 kbp. As enzimas de restrição que reconhecem 8 bases produzem fragmentos com tamanho típi co de 64 kbp e mostraram-se úteis para a análise de grandes re giões genéticas. As enzimas de restrição que reconhecem mais de 1 O bases são úteis à construção de um mapa físico e tipagem molecular por eletroforese em gel em campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE).

Separação física de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos Grande parte da simplicidade subjacente às técnicas de enge nharia genética reside no fato de que a eletroforese em gel pos sibilita a separação de fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho (Fig. 7.12): quanto menor o fragmento, mais rápida a velocidade de sua migração. A velocidade global de migração e a faixa de tamanho ótima para separação são determinadas pela natureza química do gel e pela quantidade de ligações cruzadas. Os géis com grande quantidade de ligações cruzadas otimizam a separação de pequenos fragmentos de DNA. O corante bro meto de etídio forma um complexo fluorescente brilhante ao ligar-se ao DNA, possibilitando que pequenas quantidades de fragmentos separados de DNA possam ser visualizadas nos géis (Fig. 7.12A). Fragmentos específicos de DNA podem ser reconhecidos pelo uso de sondas contendo sequências comple mentares (Figs. 7.12B e C). A eletroforese em gel em campo pulsado possibilita a separação de fragmentos de DNA contendo até 100 kbp que

116

SEÇÃO 1

Fu nda mentos da Microbiologia

A. Fragmentos de restrição

Tamanho do fragmento (kbp)

C. Hibridização dos fragmentos de restrição

Enzimas E

E/H

E/S

E/H/S

Tamanho do fragmento (kbp)

4

4

3

3

2

2

1

1

0,5

0,5

Enzimas E

E/H

E/S

E/H/S

B. Sítios de restrição

Comprimento (kbp) Sítio enzimático

--1

E

1

l

-----....

2

4

----.1----.1

---r------.---

-

H

3

S

\

E Sonda

FIGURA 7.12 (A). Separação de fragmentos de DNA, com base no seu tamanho, por eletroforese em gel. Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os fragmentos grandes, e, dentro de uma faixa determinada pelas propriedades do gel, a distância de migração é aproximada mente proporcional ao logaritmo do tamanho do fragmento. Os fragmentos de DNA podem ser visualizados com base na sua fluorescência após coloração. (8) O tamanho dos fragmentos de restrição é determinado pelo espaço onde ficam os locais de restrição no DNA. Neste exemplo, um fragmento de 4,0 quilobases de pares (kbp), formado pela enzima de restrição fcoR1 (E), contém sítios para as enzimas de restrição Hindlll (H) e Sall (S), em posições que correspondem a 1,0 e 3,5 kbp. O modelo eletroforético em A revela que a enzima de restrição E não corta o fragmento de 4,0 kbp (primeira coluna); a clivagem com a enzima de restrição H produz fragmentos de 3,0 a 1,0 kbp (segunda coluna); a clivagem com a enzima de restrição S produz fragmentos de 3,5 a 0,5 kbp (terceira coluna); a clivagem com H e S forma fragmentos de 2,5 1,0 e 0,5 kbp (quarta coluna). O fragmento de 0,5 kbp, situado entre os locais S e E, foi selecionado como sonda para determinar o DNA com sequências de hibridização (con forme ilustrado em C). (C) Identificação de fragmentos hibridizados. Os fragmentos de restrição foram separados como em A. O procedimento de hibridização revela os fragmentos que hibridizaram com a sonda de 0,5 kbp e inclui o fragmento de 4,0 kbp, formado pela enzima de restrição E, o fragmento de 3,0 kbp situado entre os locais E e H, bem como o fragmento de 0,5 kbp, situado entre os locais S e H.

são separados em géis de poliacrilamida de alta resolução. A caracterização desses fragmentos grandes possibilitou a cons trução de um mapa físico para os cromossomos a partir de várias espécies bacterianas e tem sido inestimável na tipa gem de isolados bacterianos associados a surtos de doenças infecciosas.

Clonagem dos fragmentos de restrição do DNA Muitas enzimas de restrição clivam assimetricamente o DNA, produzindo fragmentos com extremidades coesivas (aderen tes) que podem hibridizar entre si. Esse DNA pode ser utiliza do como doador com receptores de plasmídeos para formar plasmídeos recombinantes geneticamente modificados. Por exemplo, a clivagem do DNA com EcoRl produz DNA conten do a sequência final 5' AATT e sequência final 3' complemen tar TTAA (Fig. 7.13). A clivagem de um plasmídeo (porção circular de DNA) com a mesma enzima de restrição produz um fragmento linear com extremidades coesivas idênticas en tre si. A remoção enzimática dos grupos fosfato livres dessas

extremidades assegura que eles não serão ligados para formar o plasmídeo circular original. A ligação na presença de outros fragmentos de DNA contendo grupos fosfato livres produz plasmídeos recombinantes, que contêm fragmentos de DNA como inserções no DNA circular fechado por ligações covalen tes. Os plasmídeos devem encontrar-se na forma circular para sofrer replicação em um hospedeiro bacteriano. Os plasmídeos recombinantes podem ser introduzidos em um hospedeiro bacteriano, frequentemente a E. coli, por transformação. Alternativamente, a eletroporação é um pro cesso desenvolvido para a introdução do DNA em bactérias, com o uso de um gradiente elétrico. As células transformadas podem ser selecionadas com base em um ou mais fatores de resistência a fármacos codificados por genes do plasmídeo. A população bacteriana resultante contém uma biblioteca de plasmídeos recombinantes contendo vários fragmentos de res trição inseridos clonados, derivados do DNA doador. Técnicas de hibridização podem ser utilizadas para identificar colônias bacterianas contendo fragmentos específicos de DNA, ou, se o plasmídeo expressa o gene inserido, as colônias podem ser verificadas quanto ao produto gênico (Fig. 7.14).

CAPÍTULO 7

Genética microbiana

117

Vetor receptor ampR

DNA

5'

doador

EcoR1 Sítio de restrição

EcoR1 Sítio de restrição

GAATTC

GAATTC

---

CTTAAG

--

---

----

3' --- CTTAAG

EcoR1 Sítio de restrição ------�GAArrc=-----

------- CTTAAG -----

3' 5'

RESTRIÇÃO RESTRIÇÃO

5' 3'

---

---

p AATTC

G CTTAA P ..

G

--

3'

---

5'

G CTTA p A

+ p AATTC

G

G ----

CTTAA p

p AATTC

G

Fosfatase _.,_ p. 1

HIBR IDIZAÇÃO DAS EXTREMIDADES COESIVAS ------ G ------ CTTAA

G

P A ATT-

e� .....

1TAA

c G

-- G

ATP

c

AAT'f

-TTA

AATTC -----G L----

___ e

?

_...... G

LIGAÇÃO amp R

Plasmídeo recombinante (ou quimé rico)

FIGURA 7.13 Formação de um plasmídeo recombinante ou quimérico a partir do DNA de doador e de um vetor receptor. O vetor, um plasmídeo que transporta um local de restrição fcoR1, é clivado pela enzima e preparado para ligação pela remoção dos grupos fosfato terminais. Essa etapa impede a ligação das extremidades coesivas do plasmídeo na ausência de uma inserção. O DNA do doador é tratado com a mesma enzima de res trição, e formam-se círculos fechados por ligações covalentes. Pode-se utilizar um marcador de resistência a fármacos, indicado por ampR no plas mídeo, para se selecionarem os plasmídeos recombinantes após sua transformação dentro da Escherichia coli. As enzimas da bactéria hospedeira completam a ligação covalente do DNA circular e intermedeiam sua replicação.

118

SEÇÃO 1

Fu nda mentos da Microbiologia

o

o

o

Transferência

o

o

o

o

para o filtro

o

0

0

o

o

o

o

Fixação do DNA Adição da sonda 1

-

de DNA marcado

1

, ,,

*

t

-

t

-

1

, ..,

1

, ..,

1

-

t

-

1

, ..,

1

, ..,

1

-

1

1

1

-

1

, ,,

1

1

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, ..,

-

-

\

, ,,

,

,

,

1

-

1

t

-

1

, ..,

, ,,

r

Lavagem da sonda não ligada

Autorradiografia

FIGURA 7.14 Uso de sondas para a identificação de clones que contenham um fragmento específico de DNA. As colônias podem ser transferidas para um filtro e tratadas para que as células sofram lise e o DNA possa ser aderido ao filtro. Em seguida, o filtro pode ser tratado com uma solução contendo uma sonda de DNA adequadamente marcada, a qual hibridiza especificamente com os clones desejados. A autorradiografia subsequente do filtro identifica esses clones (círculos escuros). Como alternativa, pode-se efetuar uma sondagem dos clones com anticorpos para determinar se sintetizaram um produto proteico específico.

CARACTERIZAÇÃO DO DNA CLONADO Mapeamento de restrição A manipulação do DNA clonado exige o conhecimento da se quência dos ácidos nucleicos. A preparação de um mapa de restrição constitui a primeira etapa para se adquirir esse co nhecimento. Um mapa de restrição é construído, de modo muito semelhante a um quebra-cabeça, a partir de fragmen tos produzidos por digestões únicas, as quais são preparadas com enzimas de restrição individuais, e por digestões duplas, obtidas com pares de enzimas de restrição. Os mapas de restri ção também constituem a etapa inicial para o sequenciamento do DNA, uma vez que identificam fragmentos que fornecerão subclones (fragmentos relativamente pequenos de DNA) que podem ser objeto de análise mais rigorosa, podendo envolver o sequenciamento do DNA. Além disso, os mapas de restrição fornecem informações básicas altamente específicas que pos sibilitam que fragmentos de DNA, identificados em função do seu tamanho, sejam associados a funções gênicas específicas.

Sequenciamento do DNA O sequenciamento do DNA exibe a estrutura dos genes, possibi litando aos pesquisadores deduzir a sequência de aminoácidos dos produtos gênicos. Tal informação possibilita a manipula ção dos genes para compreensão ou alteração de suas funções. Além disso, a análise da sequência do DNA revela regiões regu ladoras que controlam a expressão gênica e "pontos quentes" (hot-spots) genéticos particularmente suscetíveis à mutação. A comparação das sequências do DNA revela relações evolutivas que formam uma base para a classificação não ambígua dos

microrganismos e vírus. Essas comparações podem facilitar a identificação de regiões conservadas, que podem ser especial mente úteis como sondas de hibridização específicas na detec ção dos microrganismos ou vírus em amostras clínicas. Os dois métodos geralmente empregados na determinação da sequência do DNA são a técnica de Maxam-Gilbert, que se baseia na suscetibilidade química relativa de diferentes ligações nucleotídeas, e o método de Sanger (terminação didesoxi), que interrompe o alongamento das sequências do DNA pela incorporação de didesoxinucleotídeos nas sequências. Ambas as técnicas produzem um conjunto de oligonucleotídeos que se iniciam a partir de uma única origem e acarretam a separação sobre um gel de sequenciamento de fitas de DNA, diferencian do-se entre si pelo aumento de um único nucleotídeo. O gel de sequenciamento (poliacrilamida) separa as fitas que diferem no seu comprimento a partir de uma a algumas centenas de nucleo tídeos e revela sequências de DNA de comprimento variável. Quatro colunas paralelas no mesmo gel revelam o compri mento relativo do filamento ou fitas submetidos à interrupção didesoxi na adenina, na citidina, na guanidina e na timidina. A comparação das quatro colunas contendo misturas de rea ção que diferem apenas no método de interrupção da cadeia possibilita que se determine a sequência do DNA pelo méto do de Sanger (Fig. 7.15). A relativa simplicidade do método de Sanger levou a seu uso mais generalizado; entretanto, a técnica de Maxam-Gilbert é amplamente utilizada, uma vez que pode expor regiões do DNA protegidas por proteínas de ligação es pecíficas contra modificações químicas. A determinação da sequência do DNA é enormemente facilitada pela manipulação genética do bacteriófago M13 da E. coli, que contém DNA de fita simples. A forma replicativa do DNA do fago consiste em um círculo fechado por ligações

CAPÍTULO 7

Terminação em A

e

G

T

Sequência: CACGTG FIGURA 7.15 Determinação de uma sequência de DNA pelo méto do de Sanger (terminadores de cadeia ou método didesoxi). O alonga mento enzimático do DNA é interrompido pela inclusão de análogos didesoxi dos trinucleotídeos correspondentes a A, C, G e T separada mente, em misturas de reações paralelas. Os grupos resultantes de fila mento alongados interrompidos são separados sob um gel de sequen ciamento, e a sequência pode ser deduzida por observação da base correspondente a cada aumento do comprimento da cadeia. O gel de sequenciamento é lido a partir da extremidade superior; cada banda corresponde ao aumento de uma base.

covalentes do DNA de fita dupla manipulado por engenharia genética para conter um local de clonagem múltipla que per mite a integração de fragmentos específicos de DNA previa mente identificados por mapeamento de restrição. As bactérias infectadas com a forma replicativa secretam fagos modificados que contêm, no interior de seu revestimento proteico, DNA de fita simples que inclui a sequência inserida. Esse DNA serve de molde para as reações de alongamento. A origem do alonga mento é determinada por um primer (sequência iniciadora) de DNA, que pode ser sintetizado por máquinas altamente auto matizadas para a síntese química dos oligonucleotídeos. Essas máquinas, que são capazes de produzir fitas de DNA contendo 75 ou mais oligonucleotídeos em uma sequência predetermi nada, são essenciais para determinar o sequenciamento e para modidifação do DNA por mutagênese sítio-dirigida. Os oligonucleotídeos quimicamente sintetizados podem servir como primers para a PCR, procedimento que possibilita a amplificação e o sequenciamento do DNA situado entre os primers. Por isso, em muitos casos o DNA não precisa ser clo nado para ser sequenciado ou ficar disponível para engenharia genética. O estudo da biologia foi radicalmente modificado pelo de senvolvimento da tecnologia que possibilita a determinação da sequência e a análise de genomas completos, desde os de ví rus, microrganismos procarióticos unicelulares e eucarióticos até os de seres humanos. Isso tem sido facilitado pelo proce dimento conhecido como tiro de espingarda (shotgunning), em que o DNA é rompido em fragmentos aleatórios menores para se criar uma "biblioteca" de fragmentos. Esses fragmentos desordenados têm a sua sequência determinada por sequencia dores de DNA automáticos, e são reunidos na ordem correta pelo uso de um poderoso software. Um número suficiente de

Genética microbiana

119

fragmentos é sequenciado para assegurar uma cobertura ade quada do genoma, de modo que, quando forem reunidos, a maior parte do genoma esteja representada sem que haja um número excessivo de lacunas. (Para obter isso, o genoma com pleto é coberto 5 a 8 vezes, deixando cerca de 0,1 % do DNA to tal sem sequenciamento.) Depois que os fragmentos aleatórios são reunidos por áreas de sequência superpostas, as lacunas remanescentes podem ser identificadas e fechadas. Um avan çado processamento dos dados permite a anotação dos dados da sequência, em que supostas regiões de codificação, óperons e sequências reguladoras são identificados. Até o momento, foram sequenciados os genomas de vários microrganismos im portantes. A análise contínua dos dados das sequências obtidas a partir de patógenos humanos importantes, combinada com estudos de patogênese molecular, facilitará nossa compreensão de como esses microrganismos causam doenças e, em última instância, possibilitará o desenvolvimento de vacinas e melho res estratégias terapêuticas.

MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA A síntese química dos oligonucleotídeos permite aos pesquisa dores efetuar a introdução controlada de substituições de bases em uma sequência de DNA. A substituição específica pode ser utilizada para explorar o efeito de uma mutação predeterminada sobre a expressão do gene, examinar a contribuição de um ami noácido substituído na função das proteínas ou - com base em informações prévias sobre resíduos essenciais para função - ina tivar um gene. Os oligonucleotídeos de fitas simples que contêm a mutação específica são sintetizados quimicamente e hibridiza dos com DNA de bacteriófago de fita simples, a qual transporta a sequência do tipo selvagem em forma de inserção (Fig. 7.16). O DNA de fita dupla parcialmente resultante é convertido enzima ticamente na forma replicativa de filamento duplo ou fita dupla. Esse DNA, que contém a sequência do tipo selvagem em uma das fitas e a sequência mutante na outra, é utilizado para infec tar um hospedeiro bacteriano por transformação. A replicação resulta em segregação do DNA do tipo selvagem e mutante, e o gene mutante de fita dupla pode ser isolado e subsequentemente clonado a partir da forma replicativa do fago.

ANÁLISE COM DNA CLONADO: SONDAS DE HIBRIDIZAÇÃO As sondas de hibridização (Southern blotting, Fig. 3.4) são uti lizadas rotineiramente na clonagem do DNA. A sequência dos aminoácidos de uma proteína pode ser utilizada para se dedu zir a sequência do DNA, a partir da qual uma sonda pode ser construída e empregada para detectar uma colônia bacteriana contendo o gene clonado. O DNA complementar, ou DNAc, codificado pelo RNAm, pode ser utilizado para detectar o gene que codificou esse RNAm. A hibridização do DNA em RNA por Northern blots pode fornecer informações quantitativas sobre a síntese do RNA. Sequências específicas de DNA nos fragmen tos de restrição separados sobre géis podem ser reveladas por Southern blots, método que utiliza a hibridização do DNA em DNA. Tais manchas (blots) podem ser empregadas para a detec ção de fragmentos de restrição superpostos. A clonagem desses

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SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

Primer com

�

mutação

C CGTG G\G 0�c GTGc..q Sequência selvagem Molde

-

Replicaçã o do motde

._

Heterodúplex replicativo

Forma replicativa mutante

Transformação na bactéria hospedeira

Forma replicativa selvagem

FIGURA 7.16 Mutagênese sítio-dirigida. Um primer quimicamente sintetizado, contendo a mutação G (no quadrado), é hibridizado com uma sequência do tipo selvagem inserida no DNA de um fago de fita simples. Reações de polimerização são utilizadas para formar o heterodúplex de fita dupla, transportando a mutação em uma das fitas. A introdução do heterodúplex em uma bactéria hospedeira, seguida de segregação, produz cepas de derivação que transportam formas replicativas com a inserção do tipo selvagem ou uma inserção que adquiriu a mutação quimicamente produzida.

fragmentos possibilita o isolamento de regiões flanqueadoras de DNA por uma técnica conhecida como migração cromossômi ca. Com o Western blot, outra técnica de detecção utilizada com frequência, anticorpos são usados para detectar genes clonados pela ligação a seus produtos proteicos. As sondas podem ser utilizadas em uma ampla variedade de procedimentos analíticos. Algumas regiões do DNA huma no exibem substancial variabilidade na distribuição dos locais de restrição. Essa variabilidade é denominada polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição, ou RFLP, si gla da expressão em inglês. As sondas dos oligonucleotídeos que hibridizam com fragmentos de DNA do RFLP podem ser utilizadas para identificar o doador humano do DNA de uma pequena amostra. Por conseguinte, a técnica mostra-se valiosa para a ciência forense. As aplicações do RFLP em medicina in cluem a identificação de regiões genéticas estreitamente ligadas a genes humanos com disfunções acopladas a doenças genéti cas. Essa informação tem sido e continuará sendo valiosa no aconselhamento genético. As sondas de DNA oferecem a promessa de técnicas para a rápida identificação de microrganismos exigentes em amostras clínicas, que dificilmente crescem em um laboratório de micro biologia. Além disso, extensões de tal técnica oferecem oportuni dade para a identificação rápida e direta de agentes patogênicos em tecidos infectados. Kits para a identificação de muitos pató genos bacterianos e virais estão disponíveis comercialmente. A aplicação de sondas diagnósticas de DNA exige uma avaliação (1) das próprias sondas, (2) dos sistemas emprega dos para detecção das sondas, (3) dos alvos (o DNA com o qual as sondas hibridizam) e (4) das condições de hibridiza ção. As sondas podem consistir em fragmentos de restrição relativamente grandes, provenientes de DNA clonado ou de

oligonucleotídeos que correspondem a uma região específica do DNA. As sondas maiores podem proporcionar maior exa tidão, visto que são menos sensíveis a alterações de uma única base no DNA-alvo. Já as reações de hibridização ocorrem mais rapidamente com sondas pequenas, podendo ser planejadas contra regiões conservadas do DNA nas quais a ocorrência de substituições de bases é improvável. A amplificação de um alvo por PCR, seguida da detecção do produto amplificado após hi bridização com uma sonda, tem-se mostrado mais sensível do que os métodos de detecção direta. Recentemente, ocorreram melhorias significativas nos méto dos de diagnóstico molecular, especialmente entre os que usam tecnologias de amplificação dos ácidos nucleicos, tais como a PCR. Vários instrumentos comerciais que combinam a ampli ficação por PCR de um alvo de DNA com a detecção dos ampli cons no mesmo recipiente fechado tornaram-se disponíveis. Por meio desta tecnologia, conhecida como PCR em tempo real, os amplicons da reação provocada pela PCR podem ser detectados em tempo real. Atualmente, o "tempo real" refere-se à detecção de amplicons após cada ciclo de PCR. Os formatos das sondas de detecção envolvem a detecção de fluoróforos. Os resultados são semiquantitativos e podem ser obtidos em um tempo consi deravelmente menor do que os alcançados pelos testes conven cionais de PCR.

MANIPULAÇÃO DO DNA CLONADO As técnicas de engenharia genética permitem a separação e a expressão totalmente independentes de genes associados a pa tógenos. As vacinas preparadas com genes manipulados por en genharia genética oferecem medidas de segurança previamente

CAPÍTULO 7 Genética microbiana inatingíveis. Por exemplo, pode-se preparar uma vacina con tra uma proteína do envelope viral produzida na ausência de quaisquer genes associados às funções de replicação do vírus; assim, a inoculação dessa vacina não estaria associada a risco algum de introdução de vírus funcionais. As dificuldades po tenciais no desenvolvimento dessas vacinas decorrem da faci lidade com que as mutações virais podem produzir variantes genéticas não reconhecidas pelo sistema imunológico de defesa de um indivíduo vacinado. Finalmente, hoje (e no futuro) as vacinas contêm uma variedade de proteínas que antecipam a resposta genética de patógenos.

Cepas recombinantes no meio ambiente Os maiores avanços científicos têm, algumas vezes, provoca do reações adversas do público, de modo que é prudente con siderar as possíveis consequências da engenharia genética. A preocupação mais imediata está relacionada com patógenos conhecidos que sofreram modificação genética relativamente leve, os quais têm sido e devem ser investigados em laborató rios especialmente preparados para abrigá-los. A necessidade de contenção diminui após a separação dos genes envolvidos em funções específicas, como o envelope proteico, dos genes associados à replicação ou à toxicidade de determinado patóge no. Na maioria das vezes, devem ser observadas as precauções padronizadas associadas aos laboratórios de microbiologia, a fim de criar hábitos valiosos a serem empregados quando um patógeno potencial entra no laboratório. São exceções interessantes a essa regra geral os micror ganismos manipulados por engenharia genética que podem proporcionar benefício social se forem introduzidos no meio ambiente. Muitos provêm de bactérias não patogênicas de ocorrência natural, com uma frequência de até 105/g do solo. As evidências disponíveis sugerem que a predação e a compe tição eliminam rapidamente as cepas bacterianas obtidas por engenharia genética após sua introdução no meio ambiente. Por conseguinte, o principal desafio parece ser, em condições ideais, a manutenção dos microrganismos biologicamente be néficos obtidos por engenharia genética no meio ambiente em vez da sua eliminação. Entretanto, isto não ocorre sem uma consequência social. Entre os exemplos de microrganismos obtidos por engenharia genética estão as cepas de Pseudomo nas que produzem uma proteína que favorece a formação de cristais de gelo. O valor desses microrganismos do tipo selva gem é apreciado por proprietários de pistas de esqui que deli beradamente introduziram as bactérias no meio ambiente sem suscitar qualquer preocupação do público. Um efeito colateral prejudicial da introdução desses microrganismos é que os cris tais de gelo assim produzidos podem afetar safras sensíveis, tais como as de alface durante estações em que podem ocorrer gea das. Bactérias mutantes que não formam cristais de gelo foram elaboradas por microbiologistas que esperavam que os micror ganismos mutantes pudessem proteger as plantações de alface, ocupando temporariamente os nichos normalmente habitados pelas cepas formadoras de gelo; entretanto, as tentativas de uti lizar microrganismos mutantes em estudos de campo foram alvo de protestos significativos, e os estudos só foram condu zidos após adiamentos legais prolongados e dispendiosos. Os precedentes legais que surgiram desses procedimentos, e mais recentemente, de aplicações correlacionadas estabelecerão

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diretrizes para o uso progressivo e benéfico das técnicas de en genharia genética, facilitando a determinação de situações em que se justifica extrema cautela.

OBJETIVOS 1. Descrever a estrutura básica de um nucleotídeo, dos pares de base e da estrutura linear e tridimensional da dupla fita do DNA. 2. Compreender as diferenças entre o RNA e o DNA com re lação a sua estrutura, complexidade e tamanhos relativos. 3. Conhecer as funções do RNA (RNAm, RNAr e RNAt) e das ribozimas. 4. Ser capaz de detalhar as diferenças básicas entre o cromos somo procariótico e o eucariótico. 5. Explicar os termos associados à recombinação bacteriana, transpósons, conjugação, transdução e transformação. 6. Descrever os mecanismos de mutação bacteriana e rear ranjo genético. 7. Ser capaz de compreender os fundamentos pelos quais os genes bacterianos são transcritos, incluindo os conceitos de transcrição acoplada e tradução, ativador, repressor e atenuação. 8. Compreender as diferenças entre os ribossomos proca rióticos e eucarióticos e descrever as etapas da tradução ribossomal procariótica. 9. Compreender o conceito de engenharia genética e dis cutir sobre as importantes ferramentas envolvidas nesse processo (p. ex., enzimas de restrição, ligação, clonagem e expressão). 10. Descrever as ferramentas envolvidas na caracterização do DNA (mapeamento de restrição, sequenciamento, muta gênese, hibridização e outros métodos de detecção). 11. Ser capaz de avaliar os benefícios e os possíveis aspectos negativos da recombinação bacteriana no ambiente.

QUESTÕES DE REVISÃO 1. As mutações em bactérias podem ocorrer por qual dos seguintes mecanismos? (A) (B) (C) (D) (E)

Substituição de bases Deleções Inserções Rearranjos Todas as alternativas anteriores

2. A forma de troca genética na qual o DNA doado é introduzido no receptor por um vírus bacteriano é a (A) (B) (C) (D) (E)

Transformação Conjugação Transfecção Transdução Transferência horizontal

3. A forma de troca genética em bactérias mais suscetíveis à atividade de desoxirribonuclease durante o processo de captação do DNA é a (A) (B) (C) (D) (E)

Transformação Conjugação Transfecção Transdução Todas as alternativas anteriores

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SEÇÃO 1

Fundamentos da Microbiologia

4. Qual a replicação em que o elemento requer integração física com o réplicon bacteriano? (A) (B) (C) (D) (E)

Bacteriófago de DNA de fita simples Bacteriófago de DNA de fita dupla Bacteriófago de RNA de fita simples Plasmídeo Transpóson

5. A formação de um cruzamento durante o processo de conjuga ção na Escherichia coli requer (A) (B) (C) (D) (E)

A lise do doador Um pilus sexual A transferência das duas fitas do DNA Uma endonuclease de restrição A integração de um transpóson

Respostas 1. E

3. A

2. D

4. E

5. B

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C A P Í T U L O

Imunologia

INTRODUÇÃO A difícil função do sistema imunológico é garantir proteção. Ele serve como um sistema de defesa do hospedeiro contra do enças infecciosas e contra antígenos externos (nonselj). Para atingir esse objetivo, o sistema imune apresenta um mecanis mo de resposta rápida e específica, além de uma grande adap tabilidade e de uma intrincada rede regulatória e de memória imunológica. Nas últimas décadas, grandes progressos foram alcançados no campo da imunologia, tendo como consequência avanços significativos não somente no campo da pesquisa básica, mas também na área de diagnóstico e clínico. Esses avanços per mitiram melhor compreensão de como o sistema imunoló gico funciona, e sobre variedade de distúrbios imunológicos, tais como doenças infecciosas, alergias, doenças autoimunes imunodeficiências, câncer e transplantes. Essas informações proporcionaram um melhor diagnóstico, novas estratégias de tratamento e melhorias na conduta clínica de pacientes com esses distúrbios. Este capítulo apresenta os princípios básicos da imunolo gia, em particular ao que se refere à resposta contra infecção. Discussões mais detalhadas sobre vários aspectos do sistema imunológico estão disponíveis na seção de referência.

A resposta imune Quando o sistema imunológico defende o hospedeiro contra um determinado patógeno, ele usa diferentes mecanismos de reconhecimento, visando de forma eficiente eliminar o patóge no invasor ou seus fatores de virulência. A resposta gerada con tra um patógeno em potencial é denominada resposta imune.

A primeira linha de defesa contra o patógeno invasor é deno minada resposta imune inata. Essa resposta é inespecífica e é, rapidamente, mobilizada para o sítio inicial da infecção, porém não produz memória imunológica. Já o segundo sistema de de fesa é denominado resposta imune adaptativa e é específica, podendo conferir imunidade protetora contra uma reinfecção pelo mesmo patógeno. A resposta adaptativa pode, especi ficamente, reconhecer e destruir um patógeno, uma vez que os linfócitos apresentam receptores celulares especícifos para o reconhecimento antigênico, além de produzirem anticorpos específicos contra os antígenos. Uma proteína produzida em resposta a um patógeno específico é denominada anticorpo, e uma substância que induz a produção de anticorpos é deno minada antígeno. Em resumo, a resposta imune inata é efetiva e crítica na eliminação da maioria dos patógenos. Contudo, se esse mecanismo inicial falhar, a resposta imune adaptativa ini cia uma resposta mais específica e direcionada ao patógeno in vasor. Assim, ambos os sistemas interagem e colaboram entre si para alcançar o objetivo final de destruir o patógeno.

IMUNIDADE INATA A imunidade inata é uma resposta imediata contra um patóge no que não confere proteção duradora ou memória imunoló gica. É um sistema de defesa inespecífico, que inclui barreiras contra agentes infecciosos, tais como a pele (epitélio) e muco sas. Também é composta por vários componentes importantes da resposta imune adaptativa incluindo macrófagos, células NK (natural killer, células matadoras naturais), receptores do tipo toll (Toll-like receptors TLRs), citocinas e o sistema complemento. -

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SEÇÃO li

Imunologia

Barreiras fisiológicas A. Pele

Poucos microrganismos são capazes de penetrar através da pele íntegra, mas muitos podem penetrar pelas glândulas su doríparas ou sebáceas e pelos folículos pilosos, estabelecendo se nesses locais. As secreções sudoríparas e sebáceas - em virtude de seu pH ácido e da presença de certas substâncias químicas (particularmente ácidos graxos) - têm propriedades antimicrobianas que tendem a eliminar os microrganismos patogênicos. A lisozima, uma enzima que desestabiliza as pare des celulares de algumas bactérias, é encontrada na pele e pode ajudar a proteger o hospedeiro contra esses microrganismos. Também está presente na lágrima, bem como nas secreções respiratórias e cervicais. Além disso, a pele produz uma va riedade de agentes antimicrobianos, incluindo a proteína com atividade antibacteriana denominada psoriasina*. Assim, tan to a pele quanto esses agentes antimicrobianos fornecem uma barreira fisiológica contra a entrada de patógenos.

B. Mucosas

A superfície das vias respiratórias é recoberta por uma película de muco constantemente impelida para cima por células cilia das em direção aos orifícios naturais. As bactérias tendem a aderir a essa película. Além disso, tanto o muco quanto a lágri ma contêm lisozima e outras substâncias dotadas de proprieda des antimicrobianas. Para alguns microrganismos, a primeira etapa no processo infeccioso consiste na sua fixação a células epiteliais superficiais através de proteínas adesivas da superfí cie bacteriana (p. ex., os pili dos gonococos e Escherichia coli). Se essas células possuírem anticorpos IgA em sua superfície um mecanismo de resistência do hospedeiro -, a fixação do microrganismo poderá ser impedida. (O microrganismo pode vencer tal mecanismo de resistência ao degradar o anticorpo com uma protease.) Quando determinado microrganismo penetra no corpo através das mucosas, tende a ser capturado por fagócitos e transportado em vasos linfáticos regionais para os linfonodos. Os fagócitos atuam como barreiras contra a disseminação pos terior de grandes números de bactérias. O aparelho mucociliar para a remoção de bactérias nas vias respiratórias é auxiliado por macrófagos pulmonares. Os mecanismos protetores espe ciais, encontrados nas vias respiratórias, incluem os pelos das narinas e o reflexo da tosse, que impede a aspiração. No trato gastrintestinal (GI), existem diversos sistemas que atuam para inativar as bactérias: a saliva contém inúmeras en zimas hidrolíticas; a acidez do estômago destrói muitas bac térias ingeridas (p. ex., Vibrio cholerae); e o intestino delgado possui muitas enzimas proteolíticas e macrófagos ativos, que destroem microrganismos no intestino delgado. É preciso lembrar que a maioria das mucosas do organis mo possui a microbiota normal e constante, que se opõe ao estabelecimento de microrganismos patogênicos (interferência * N. de R.T. Os peptídeos antimicrobianos presentes na pele (defensinas: HNPI3, catelicidinas: 1137, lisozimas, ubiquitina e psoriasinas) têm im portante papel, como efeito na imunidade inata, principalmente nas rea ções de defesa do neonato devido a sua imaturidade imunológica.

bacteriana ou efeito de barreira), desempenhando, assim, im portantes funções fisiológicas. Por exemplo, na vagina da mu lher adulta, o pH ácido é mantido por lactobacilos normais, inibindo, desse modo, o estabelecimento de leveduras, anaeró bios e bactérias gram-negativas.

Mecanismos da imunidade inata Embora a resposta imune inata não estabeleça uma imunida de direcionada e protetora, dependente do reconhecimento específico de determinado patógeno, ela fornece uma pode rosa linha de defesa. Esse sistema apresenta diferentes tipos celulares, como os leucócitos polimorfonucleares neutrofilicos (polymorphonuclear neutrophilic leukocytes [PMNs]), macró fagos e células NK, que são a primeira linha de defesa contra os microrganismos. A interação dessas células com os patógenos desencadeia a liberação de diferentes citocinas, quimiocinas e a ativação das proteínas do sistema complementar. Muitas dessas citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-1 (in terleukin-1 [IL-1]), fator de necrose tumoral a (tumor necrosis factor-a [TNF-a]), IL-6 e interferon-gama (IFN-y), são induzi das via interação com moléculas de TLRs, iniciando assim uma resposta contra os patógenos invasores. A. Sensores microbianos

Quando um patógeno entra em contato com a pele é con frontado com os macrófagos e outras células fagocíticas, que possuem "sensores microbianos". Há três principais grupos de sensores microbianos: (1) TLRs, (2) NOD-like receptors (Nucleotide-binding oligomerization domain receptors, recep tores de domínio de oligomerização ligador de nucleotídeo) e (3) RIG-1-like helicases (retinoic acid-inducible gene I-like helicases, helicases do tipo RIG-1 [gene induzível por ácido retinóico-1]) e MDA-5 (Melanoma differentiation-associated protein 5 [proteína associada à diferenciação do melanoma 5]). Entre esses três grupos de sensores, os TLRs são os mais estudados e conhecidos. Os TLRs são uma importante familia de receptores de reconhecimento-padrão conservados evoluti vamente (Pattem Recognition Receptors [PRRs]), que reconhe cem diferentes padrões moleculares associados a patógenos (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs] ), sendo a principal linha de defesa contra uma variedade de microrga nismos e desempenhando assim, um papel crítico no início da resposta imune inata. Os TLRs são proteínas transmembranas do tipo 1 constituídas por um domínio extracelular, uma única a-hélice transmembrana e um domínio citoplasmático. O re conhecimento dos padrões microbianos pelos TLRs leva a uma cascata de transdução de sinais, que resulta em uma rápida e intensa resposta inflamatória marcada por ativação celular e liberação de citocinas. Até o momento, 10 moléculas de TLRs humanas foram identificadas, sendo que cada uma dessas moléculas reconhe ce um único grupo de moléculas microbianas. Por exemplo, TLR2 reconhece vários ligantes (p. ex., ácido teicoico) expres sados por bactérias gram-positivas, enquanto TLR3 se liga a RNA de fita dupla na replicação viral. O TLRl e o TLR6 re conhecem múltiplos peptídeos diacil (p. ex., Mycoplasma). Já o TLR4 é específico para lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas. O TLRS, por outro lado, é capaz de reconhecer

CAPÍTULO 8

flagelina bacteriana e o TLR7 e TLR8 interagem com RNA de fi ta simples viral. O TLR9 é responsavel pelo reconhecimento do DNA bacteriano. Em relação ao TLRlO, sua função permanece desconhecida. Outra grande família de receptores da resposta inata são os receptores do tipo NOD, que estão localizados no citoplasma e servem como sensores intracelulares para produ tos microbianos. Eles ativam a via do fator nuclear potenciador da cadeia leve kappa das células ativadas B (Nuclear factor ka ppa beta [NF-KB]). O terceiro grupo de sensores microbianos é constituído pelas helicases do tipo RIG-1 e pelo MDA-5, sen do sensores citoplasmáticos para o RNA de fita simples viral. O reconhecimento do RNA de fita simples por esses sensores desencadeia a produção de interferon do tipo 1 (IFN-1 ), que são inibidores altamente eficazes da replicação viral. B. Fagocitose

Durante o processo infeccioso, o número de células fagocíti cas circulantes, frequentemente, aumenta. As funções princi pais dessas células fagocíticas incluem quimiotaxia, migração, ingestão (fagocitose) e destruição microbiana. Os microrga nismos e outros antígenos exógenos que entram através da barreira epitelial nos linfonodos, pulmão ou circulação sanguí nea são englobados por uma variedade de células fagocíticas. Os fagócitos do sistema imune consistem em ( 1) monócitos e macrófagos; (2) granulócitos, incluindo polimorfonuclea res (PMNs), eosinófilos e basófilos; e (3) células dendríticas. Os monócitos são pequenos leucócitos, que circulam na cor rente sanguínea e que se diferenciam em macrófagos, os quais estão presentes na maioria dos tecidos. Por exemplo, eles são denominados células de Kupffer no fígado e células microgliais no tecido nervoso. Os macrófagos são células críticas na fago citose e na destruição de patógenos, no processamento e apre sentação de antígenos e na regulação da resposta imunológica, pela produção de citocinas e quimiocinas. Os granulócitos são leucócitos que contêm grânulos den samente corados. Os PMNs apresentam uma meia-vida curta e são importantes células fagocitárias, que destroem patógenos presentes em vesículas intracelulares. Os eosinófdos e basófi los são menos abundantes, mas importantes na defesa contra parasitos. Essas células apresentam grânulos que contêm enzi mas e proteínas tóxicas, que são liberadas durante a ativação dessas células. As células dendríticas também são células fago citárias, porém sua principal função é a ativação de linfócitos T, durante a resposta imune adaptativa, funcionando como células apresentadoras de antígeno (antigen presenting cells [APCs]) e na produção de citocinas regulatórias. Os elementos-chave na eficiência da imunidade inata são a rapidez, a inespecificidade e a curta duração da resposta. Essas características são a marca registrada do processo fagocitário. A fagocitose é um processo em que a célula fagocitária, espe cialmente os PMNs, reconhecem, englobam e destroem os pa tógenos fagocitados. É um processo realizado em várias etapas, que se inicia com o rolamento dos PMNs ao longo das paredes do capilares venulares. Caso o patógeno invada os tecidos, os PMNs migram para o sítio infeccioso, sendo esse processo de pendente da liberação de sinais quimiotáticos produzidos pe las células do hospedeiro ou pelo próprio patógeno. Uma das substâncias quimiotáticas é a IL8, potente quimiocina que atrai os PMNs. Na etapa inicial da migração, os PMNs se aderem a

Imunologia

125

células endoteliais por meio de moléculas de adesão, tais como as P-selectinas. Os PMNs são atraídos por essas quimiocinas e migram da circulação para os tecidos, através do endotélio, em que o patógeno invasor é reconhecido, fagocitado pela forma ção de uma vesícula endocítica denominada de fagossomo e, finalmente, destruído no interior do fagócito. Há vários mecanismos antibacterianos usados pelos fagó citos. Por exemplo: ( 1) acidificação do fagossomo. O pH do fagossomo é entre 3,5 a 4,0, produzindo, assim, um ambiente bactericida; (2) produtos tóxicos derivados do oxigênio mo lecular, incluindo superóxido (02- ), peróxido de hidrogênio (H202) e radicais hidroxila (OH- ); (3) óxidos de nitrogênio com o óxido nítrico (NO); e (4) peptídeos antimicrobianos. Os macrófagos produzem catelicidinas e peptídeos deriva dos de elastase, enquanto os PMNs são ricos em a.-defensina, �-defensinas, catelicidinas e lactoferrinas. Todos esses meca nismos são ulilizados pelos fagócitos para destruir os patóge nos. Quando os PMNs completam a sua função, entram em apoptose. Como mencionado anteriormente, a fagocitose ocorre sem a necessidade da presença de anticorpos. Contudo, esse processo é mais eficiente na presença dessas imunoglobulinas, que recobrem a superfície das bactérias e facilitam sua ingestão pelos fagócitos. Esse processo é denominado de opsonização, podendo ocorrer por três mecanismos: (1) o anticorpo em si pode atuar como opsonina; (2) o anticorpo ligado ao antígeno pode ativar o complemento através da via clássica, produzindo opsonina (C3b); e (3) pode haver a produção da opsonina C3b através da via alternativa (Fig. 8.8). Os macrófagos possuem receptores em suas membranas para a porção Fc do anticorpo e para o componente C3b do complemento, que ajudam a fa gocitose de partículas recobertas por anticorpos. C. Células matadoras naturais - células NK

As células NK são linfócitos grandes granulares morfologica mente relacionados com as células T, representando cerca de 10 a 15% dos leucócitos na circulação sanguínea. As células NK contribuem para a imunidade inata, fornecendo proteção contra infecções virais e outros patógenos intracelulares. Essas células apresentam a capacidade de reconhecer e destruir cé lulas infectadas e tumorais. As células NK possuem dois tipos de receptores de superfície: (1) receptores do tipo lectina de células NK (lectin-like NK cell receptors), que se ligam a pro teínas e não a carboidratos e (2) receptores matadores do tipo imunoglobulina (Killer immunoglobulin-like receptors [KIRs]), que reconhecem moléculas do complexo de histocompati bilidade principal classe 1 (major histocompatibility complex [MHC]), o antígeno leucocitário humano B (human leukocyte antigen B [HLA-B] ) e o HLA-C. Esses receptores apresentam tanto características de ativação quanto de inibição. As célu las NK podem lisar células-alvo que sofreram transformação malígna e desempenhar um papel na vigilância imunológica contra o estabelecimento de tumores. Elas têm a capacidade de destruir as células infectadas por vírus com níveis altera dos de moléculas MHC de classe 1. A ação lítica das células NK é intensificada pela presença de altos níveis de granzimas e perforinas. Além disso, quando a produção de anticorpos é iniciada durante a resposta imune adaptativa, células NK exer cem um papel crítico na citotoxicidade celular dependente de

126

SEÇÃO li

Imunologia

anticorpo (antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]). Nesse processo, anticorpos específicos se ligam à superfície da célula-alvo, enquanto as células NK expressam receptores para fração Fc dos anticorpos aderidos. Após essa ligação, as granzimas e perforinas são liberadas, promovendo a lise da célula-alvo. Essa propriedade permite que as células NKs ini bam a replicação viral ou de outros patógenos intracelulares. Essas células e o sistema de interferon (IFN) interagem entre si e são parte integral da resposta imune inata. As células NK são fontes primárias de IFN-y, uma potente citocina antivira! e imunorreguladora. A atividade lítica das células NK também é aumentada por IFN do tipo 1, IFN-a e IFN-�, que são induzi das durante a infecção viral. Finalmente, a molécula de MHC classe 1, que medeia a morte celular pelas células NK, é estimu lada por IFNs.

D. Complemento O sistema complemento é outro componente-chave da respos ta imune inata. É formado por 30 proteínas encontradas no soro ou na membrana de determinadas células. Esse sistema promove a destruição do microrganismo invasor mediada, por lise, através da formação de poros em sua membrana celular ou por opsonização, resultando em melhor fagocitose pelos PMNs ou pelos macrófagos. Há três vias para ativação do comple mento: clássica, alternativa e lectínica. Mesmo tendo diferentes mecanismos de ativação, essas três vias podem resultar em lise do agente invasor, após uma cascata de reações bioquímicas desencadeada durante sua ativação. Outra consequência da ativação do complemento é a liberação de fragmentos que po dem interagir diretamente com linfócitos T e B. Durantes esses eventos, os linfócitos produzem e liberam diferentes citocinas pró-inflamatórias. Por exemplo, a via alternativa é importante como primeira linha de defesa contra a infecção por micror ganismos. Conforme ilustra a Figura 8.8, essa via pode ser ati vada na superfície do microrganismo, ocorrendo na ausência de anticorpos. As proteínas do complemento exibem várias propriedades antimicrobianas que contribuem para a defesa do hospedeiro, como opsonização, lise de bactérias e amplifi-

QUADRO 8.1

cação das respostas inflamatórias por meio das anafilatoxinas CSa e C3a. Contudo, alguns microrganismos desenvolveram mecanis mos para interferir no sistema do complemento e, dessa ma neira, escapar da resposta imunológica, como, por exemplo, o vírus vacínia, que codifica uma proteína solúvel que funciona como uma proteína reguladora do complemento, bloqueando ambas as vias principais de ativação do complemento pela li gação a C3b e C4b.

E. Mediadores de inflamação: citocinas Qualquer lesão de um tecido, como a que ocorre após o esta belecimento e a multiplicação de microrganismos, induz uma resposta inflamatória. A resposta imunológica inata dos macró fagos consiste na liberação de citocinas, como a ILI e o TNFa. Os outros mediadores liberados pelos macrófagos ativados são as prostaglandinas e os leucotrienos. Esses mediadores de in flamação começam a induzir alterações nos vasos sanguíneos locais. Essa ação começa com a dilatação das arteríolas e dos capilares locais, a partir dos quais ocorre o extravasamento do plasma. Há acúmulo de líquido de edema na área da lesão e a fibrina forma uma rede, causando a oclusão dos vasos linfá ticos e limitando assim a disseminação dos microrganismos. Outro efeito dos mediadores consiste em induzir alterações na expressão de várias moléculas de adesão, sobre as células endoteliais e os leucócitos. As moléculas de adesão, como as selectinas e as integrinas, permitem a fixação dos leucócitos às células endoteliais dos vasos sanguíneos, promovendo, assim, seu movimento através da parede do vaso. Por conseguinte, os PMNs aderem às paredes e, em seguida, migram para fora dos capilares (extravasamento), em direção ao agente irritante. Es sa migração (quimiotaxia) é estimulada por substâncias exis tentes no exsudato inflamatório, inclusive alguns polipeptídeos pequenos, denominados quimiocinas. As quimiocinas, que pertencem à família das citocinas, estimulam a mobilização de PMNs e são sintetizadas por diferentes tipos celulares, incluin do os macrófagos e as células endoteliais. A IL8 é um exem plo de quimiocina (Quadro 8.2). Essas quimiocinas atuam,

Propriedades das imunoglobulinas humanas lgG

lgA

lgM

lgD

lgE

Símbolo da cadeia pesada

"(

µ

Valência

2

5

2

2

1 43.000-1 60.000

159.000-447.000ª

900.000

1 77.000-1 85.000

150

8 a 16

1,4 a 4,0

0,4 a 2,0

0,03

Traços

Meia-vida sérica (dias)

21b

7

7

2

2

Porcentagem do total de imunoglobulinas no soro

80

15

5

0,2

0,002

Sim (+)

Não

Sim (++)

Não

Não

Massa molecular (daltons) Concentração sérica (mg/ml) (adulto)

Ativação do complemento Transferência para o feto via placentac

+

ª E m secreções, por exemplo, saliva, leite e lágrima, bem como em secreções dos tratos respiratório, intestinal e genital, a lgA, geralmente, é encontrada como dímero ou tetrâmero, e no soro ela existe principalmente como um monômero. b Subclasses 1, 2, 4. Subclasse 3 apresenta meia-vida de 7 dias. e

Principalmente, os isotipos lgG1 e lgG3, porém todos os isotipos já foram detectados.

CAPÍTULO 8 Imunologia principalmente, no recrutamento de monócitos e neutrófilos do sangue circulante para os locais de infecção. Os fagócitos ingerem os microrganismos e começam a digestão intracelu lar. Em seguida, o pH da área inflamada torna-se mais ácido e as proteases celulares induzem a lise dos leucócitos. Grandes macrófagos mononucleares chegam ao local e ingerem restos leucocitários, bem como microrganismos, preparando o cami nho para a resolução do processo inflamatório local. A febre constitui a manifestação sistêmica mais comum da resposta inflamatória, representando um sintoma essencial de doença infecciosa. O regulador final da temperatura corporal é o centro ter morregulador localizado no hipotálamo. Entre as substâncias capazes de induzir febre (pirogênios), destacam-se as endoto xinas das bactérias gram-negativas e as citocinas liberadas das células linfoides, como a ILI. Diversos ativadores podem atuar sobre os fagócitos mono nucleares e outras células, induzindo a liberação de ILI. Entre esses ativadores, destacam-se os micróbios e seus produtos; as toxinas (inclusive as endotoxinas), os complexos antígeno-an ticorpo, os processos inflamatórios entre outros. A ILI é trans portada pela corrente sanguínea até o centro termorregulador no hipotálamo, em que são iniciadas as respostas fisiológicas que resultam em febre (p. ex., aumento da produção de calor, redução da perda de calor). Os outros efeitos da ILI são men cionados adiante. Os interferons (IFNs) são citocinas críticas que exercem um papel-chave na defesa contra infecções virais e diferentes microrganismos intracelulares, como o Toxoplasma gondii. Embora essas moléculas tenham sido identificadas, na década de I957, como proteínas antivirais, somente hoje elas são re conhecidas como proteínas imunorreguladoras fundamentais capazes de alterar vários processos celulares, tais como cres cimento celular, diferenciação, transcrição e tradução gênica. A família dos IFNs consiste em três grupos: Os IFNs do tipo I, que comprendem diferentes genes e primariamente incluem o IFN-a e IFN-�; os IFNs do tipo li, que consistem em um único gene codificando para a síntese do IFN-y; e o IFN-À, que é o terceiro grupo recentemente descoberto. A infecção viral desencadeia a produção dos IFNs do tipo 1, geralmente via TLR-3, 7 ou 9. O IFN-yé produzido por células NK ativadas na resposta imune inata e por células T, sensibilizadas na resposta imune específica. Além disso, citocinas com a IL-2 e IL-I2 tam bém desencadeiam a produção de IFN-ypelas células T. O sistema IFN consiste em uma série de eventos, que re sultam na proteção da célula e no bloqueio da replicação vi ral. Os IFNs se ligam aos seus receptores celulares e ativam os transdutores e tradutores de sinais da família JAK (quinase Janus) e da família STAT (signal transducer and activator of transcription [transdutores de sinal e ativadores da transcri ção]). Esse processo desencadeia a ativação de genes respon sáveis pela transcrição dos IFNs. Além disso, alguns desses genes iniciam a produção de proteínas inibidoras da replicação virai. Os diferentes IFNs apresentam múltiplas e redundantes funções biológicas, como atividade antivirai, antiproliferativa e imunorregulatória (Quadro 8.2). Contudo, funções não re dundantes e específicas também existem. Por exemplo, IFN-� é usado com sucesso no tratamento de pacientes com esclero se múltipla, enquanto o IFN-y parece exacerbar os sintomas da doença. Essas potentes funções dos IFNs e os avanços da

127

biotecnologia têm sido de grande relevância na clínica médi ca. De fato, muitos IFNs foram aprovados pela U.S Food and Drug Administration (FDA), para o tratamento de infecções, neoplasias, doenças autoimunes e imunodeficiências. Em adi ção, as citocinas e os derivados do ácido araquidônico, como as prostaglandinas e os leucotrienos, são mediadores da respos ta inflamatória. Os fármacos que inibem a síntese das prosta glandinas (ao bloquear a enzima ciclo-oxigenase) atuam como anti-inflamatórios.

IMUNIDADE ESPECÍFICA A resposta imune adaptativa pode ser mediada por anticorpos (humoral), de base celular (celular) ou ambos. Ao contrário da resposta inata, a resposta adaptativa é altamente específica, apresenta memória imunológica e responde de forma rápida e intensa a uma segunda exposição ao mesmo antígeno. Uma vi são mais detalhada dos componentes da resposta imune adap tativa é apresentada a seguir.

Bases celulares da resposta imune adaptativa Durante o desenvolvimento embrionário, os precursores das células sanguíneas (células-tronco hematopoiéticas) são en contrados no fígado e em outros tecidos fetais; na vida pós-na tal, as células-tronco localizam-se na medula óssea. No fígado e na medula óssea, as células-tronco podem diferenciar-se em células mieloides ou células da série linfoide. As células pro genitoras linfoides evoluem em duas populações principais de linfócitos: as células B e as células T. As células B são linfócitos que se desenvolvem na medu la óssea dos mamíferos. Nas aves, desenvolvem-se na bolsa de Fabricius, um apêndice do intestino. As células B fazem rear ranjo de seus genes de imunoglobulinas e expressam um único receptor para o antígeno em sua superfície celular. Nessa etapa, migram para um órgão linfoide secundário (p. ex., o baço) e podem ser ativadas pelo contato com um antígeno, transfor mando-se em plasmócitos secretores de anticorpos. As células T são linfócitos oriundos da medula óssea na forma de células precursoras, que migram para o timo, onde se diferenciam e amadurecem. Após o rearranjo do TCR e as seleções positivas e negativas*, estas células se diferenciam em subclasses, com funções específicas (células T CD4+ e células T * N. de R.T. No microambiente especializado do timo, as células T sofrem

dois tipos de seleção: positiva e negativa, as quais verificam as n i terações do TCR com os peptídeos próprios, associados às moléculas do MHC próprias na superfície das células tímicas. Na seleção positiva, as células T, cujos receptores e correceptores reconhecem moléculas de MHC pró prias nas células epiteliais do córtex tímico, continuam sua maturação. Já na seleção negativa, as células apresentadoras de antígenos profissionais, principalmente as células dendríticas e os macrófagos derivados da me dula óssea, deletam as células T, cujos receptores reconhecem comple xos peptídeo próprio-MHC próprio. Isso assegura a autotolerância por meio da criação de um repertório de células T maduras que não reage com os complexos peptídeo-MHC das células normais próprias. As cé lulas T maduras, que sobrevivem à seleção, saem do timo para o sangue e circulam através dos órgãos linfoides periféricos, em que encontram o antígeno específico, são ativadas e se diferenciam em células T efetoras de diferentes tipos.

128

SEÇÃO li

Imunologia Célula T

o

Timo

Célula-tronco da medula ossea ,

o

Interação antígeno específica

o

Célula T

o

)l

Citocinas

)l

)o

Citocinas

)lo

Ativação dos macrófagos

Célula T

"x

Citocinas

)lo

o

Inflamação via PMN, etc.

Célula T Célula apresentadora de antígeno (APC, como, p. ex., um macrófago)

ô

o

)o

Citocinas

)o

Diferenciação das células T citotóxicas

Célula T

Célula B

Interação antígeno específica

o

Citocinas ,.... Anticorpos Plasmócito

FIGURA 8.1 Diagrama esquemático das interações celulares na resposta imunológica.

CDS+). A Figura S.l apresenta uma visão geral da diferencia ção e das interações dos linfócitos. Os dois braços da resposta imune, a resposta de base celular e a mediada por anticorpos, se desenvolvem concomitantemente. No braço mediado por anticorpos, os linfócitos T auxilia res (CD4) reconhecem os antígenos do patógeno em comple xo com proteínas MHC da classe li, sobre a superfície de uma célula apresentadora de antígeno (macrófago ou célula B) e, em seguida, produzem citocinas que ativam a expressão de an ticorpos pelas células B, que se ligam especificamente ao antí geno. As células B sofrem proliferação clonal e diferenciam-se para formar plasmócitos que, em seguida, produzem imuno globulinas específicas (anticorpos). As principais funções de defesa dos anticorpos no hospedeiro são a neutralização de toxinas e vírus, ADCC e a opsonização do patógeno, que ajuda a sua captação pelas células fagocíticas. A defesa mediada por anticorpos é importante contra os patógenos que produzem toxinas (p. ex., Clostridium tetani), ou possuem cápsulas de polissacarídeos que interferem na fagocitose (p. ex., pneumo cocos). Aplica-se principalmente a patógenos extracelulares e suas toxinas. No braço mediado pelas células, o complexo antígeno MHC da classe II é reconhecido pelos linfócitos T auxiliares

(CD4), enquanto o complexo antígeno-MHC da classe 1 é re conhecido pelos linfócitos T citotóxicos (CDS). Cada classe de células T produz citocinas, as quais se tornam ativadas e so frem expansão por proliferação clonal. A atividade das células T auxiliares (CD4), além de esti mular a produção de anticorpos pelas células B, promove o desenvolvimento da hipersensibilidade tardia e, portanto, atua também na defesa contra agentes intracelulares, como as bac térias intracelulares (p. ex., micobactérias), fungos, protozoá rios e alguns vírus. A atividade das células T citotóxicas (CDS) é principalmente orientada para a destruição de células em enxertos teciduais (transplantes), células tumorais ou células infectadas por vírus. Assim, o resultado efetivo, das duas imu nidades em conjunto (humoral e celular), possibilita que um indivíduo, na maioria das vezes, resista a diferentes patógenos e antígenos externos em seu organismo.

Antígenos Um antígeno é uma substância de diferentes naturezas capaz de induzir uma resposta imune, com a produção de anticorpos específicos. Diferentes características determinam sua imuno genicidade:

CAPÍTULO 8

1. Natureza externa (diferença do próprio "self'): em geral,

as moléculas reconhecidas como "próprias" (selj) não são imunogênicas; para haver imunogenicidade, as moléculas devem ser reconhecidas como "não próprias" (non selj). 2. Tamanho molecular: os imunógenos mais potentes geral mente são grandes proteínas. Em geral, as moléculas com massa molecular inferior a 10.000 dáltons são fracamente imunogênicas, Enquanto as moléculas muito pequenas (p. ex., aminoácidos) não são imunogênicas. Determinadas moléculas pequenas (p. ex., haptenos) só se tornam imuno gênicas, quando ligadas a uma proteína transportadora. 3 . Complexidades química e estrutural: é necessário haver certo grau de complexidade química - por exemplo, os homopolímeros dos aminoácidos são menos imunogêni cos que os heteropolímeros que contêm dois ou três ami noácidos diferentes. 4. Constituição genética do hospedeiro: dois animais da mesma espécie podem responder de modo diferente ao mesmo antígeno, devido à diferente composição dos genes da resposta imunológica, como, por exemplo, diferentes alelos de MHC. 5. Dosagem, via de administração e momento de adminis tração do antígeno: como o grau da resposta imunológica depende da quantidade administrada de antígeno, a res posta imunológica pode ser otimizada ao se definir cui dadosamente a dosagem (inclusive o número de doses), a via de administração e o momento de sua administração (inclusive os intervalos entre as doses). É possível aumentar a imunogenicidade de uma substância ao misturá-la com um adjuvante. Os adjuvantes são substân

cias que estimulam a resposta imunológica, como, por exemplo, ao facilitar a captação nas células apresentadoras de antígeno.

Moléculas de reconhecimento antigênico Para que o sistema imunológico responda a antígenos não pró prios, isto é, externos, foi necessário o desenvolvimento de um sistema de reconhecimento capaz de distinguir com precisão o antígeno próprio do não próprio. A próxima seção deste ca pítulo trata das moléculas utilizadas para o reconhecimento dos antígenos estranhos (não próprios). Em primeiro lugar, é feita uma revisão da estrutura molecular do complexo de his tocompatibilidade principal (major histocompatibility complex [MHC]) para a apresentação antigênica, seguida por uma vi são geral da estrutura e função dos anticorpos. Finalmente, é apresentada uma discussão sobre alguns receptores de antíge nos ligados à membrana (p. ex., o receptor de antígeno para as células B [imunoglobulina de membrana, "surface membrane immunoglobulin, Smlg"] e o receptor de antígeno para as célu las T [receptor de célula T, T cell receptor, TCR).

O complexo principal de histocompati bilidade O complexo principal de histocompatibilidade (MHC) foi de tectado, pela primeira vez, como o locus que codifica as molé culas de glicoproteína (antígenos de transplante) responsáveis pela rápida rejeição de enxertos de tecidos transplantados entre indivíduos geneticamente não idênticos. Na atualidade,

Imunologia

129

sabe-se que as moléculas MHC ligam-se a antígenos peptídi cos, apresentando-os às células T. Por conseguinte, tais antíge nos de transplante desencadeiam o reconhecimento antigênico mediado pelo TCR. Nesse aspecto, o TCR difere do anticorpo. As moléculas do anticorpo interagem diretamente com o antí geno; o TCR só reconhece os pepitídeos antigênicos apresen tados por moléculas MHC presentes na APC. Embora o TCR seja específico a um determinado antígeno, é necessária a apre sentação dele por uma molécula do MHC própria. O TCR tam bém é específico para a molécula MHC. Caso o antígeno seja apresentado por outra forma alélica da molécula MHC in vitro (normalmente, apenas em situação experimental), não haverá reconhecimento pelo TCR. Esse fenômeno é conhecido como restrição do MHC. Nos seres humanos, o MHC é um conjunto de genes exten samente estudado, que se localiza no cromossomo 6. Entre os inúmeros genes importantes do MHC humano, também co nhecidos como antígenos leucocitários humanos (human leu kovyte antigens [HLA]), há os que codificam as proteínas MHC das classes 1, II e III. Conforme indica o Quadro 8.3, as prote ínas da classe 1 são codificadas pelos genes HLA-A, HLA-B e HLA-C. Essas proteínas são constituídas de duas cadeias: (1) uma glicoproteína transmembrana com MM de 45.000 dál tons, associada, de forma não covalente, a (2) um polipeptí deo não codificado pelo MHC, com MM de 12.000 dáltons, conhecido como �2 -microglobulina. As moléculas da classe 1 são encontradas em praticamente todas as células nucleadas do corpo, com exceção das células da retina e do cérebro. As proteínas da classe II são codificadas pela região HLA-D. Conforme indica o Quadro 8.3, existem três famílias principais: as moléculas codificadas por DP, DQ e DR. Esse locus mantém o controle da capacidade de resposta imunológica e diferentes formas alélicas de tais genes, que conferem notáveis diferenças na capacidade de deflagrar uma resposta imunológica contra determinado antígeno. As proteínas codificadas pelo locus HLA-D são constituídas de duas glicoproteínas transmembrana, associadas de modo não covalente, com MM de cerca de 33.000 e 29.000 dáltons. Diferentemente das proteínas da classe I, têm distribuição teci dual restrita e são encontradas principalmente em macrófagos, células dendríticas, células B e outras APCs. Contudo, sua ex pressão em outras células, como células endoteliais e epiteliais, pode ser induzida pelo IFN-y. O locus MHC da classe II também inclui genes que codi ficam proteínas envolvidas no processamento do antígeno, como, por exemplo, os transportadores associados ao proces samento de antígenos (transporters associated with antigen processing [TAP]) (Fig. 8.2). O locus MHC da classe III codifica proteínas do complemento e várias citocinas. Os genes do MHC exibem notável variabilidade genética. O MHC é poligênico, visto que existem vários genes para cada classe de molécula. O MHC também é polimórfico. Por conse guinte, existe um grande número de alelos na população para cada um dos genes. Cada indivíduo herda dos pais um conjun to restrito de alelos. Os conjuntos de genes MHC tendem a ser herdados como bloco ou haplótipo, por ser relativamente rara a ocorrência de eventos de relação cruzada nesse locus. Muito se sabe acerca da organização estrutural e da sequên cia dos genes e das proteínas do MHC. Entretanto, talvez a informação mais importante tenha sido obtida da análise

130

SEÇÃO li

QUADRO 8.2

Imunologia

Algumas citocinas importantes: Produção e Função

Família das citocinas

Principal fonte celular

Algumas funções biológicas

lnterferons Alfa

Leucócitos

Antivirai, imunorreguladora (aumenta a expressão de MHC 1 e ativa NK), antiproliferativa

Beta

Fibroblastos, células epiteliais

Antivirai, imunorreguladora (aumenta a expressão de MHC 1 e ativa NK), antiproliferativa

Gama

Células T e células NK

Antivirai, imunorreguladora (aumenta a expressão de MHC 1, li e ativa macrófagos), antiproliferativa

Alfa

Macrófagos e linfócitos

Ativa macrófagos e células citotóxicas, induz caquexia e a produção de proteínas de fase aguda e citocinas (IL-1, IL6)

Beta

Células T

Ativa macrófagos e induz a produção de citocinas (IL-1, IL6)

IL-1

Diferentes tipos celulares: macrófagos e células dendríticas

Induz inflamação, febre e sepse, induz liberação de TNF-cx.

IL-2

Células T

Induz proliferação e maturação de células T

IL-6

Diferentes tipos celulares

Ativa células B, mediador de reação de fase aguda

IL-1 O

Células T, monócitos/macrófagos

Inibe a produção de IFN-ye de IL-12

IL-11

Células estromais da medula óssea, células mesenquimais

Efeito sinérgico sobre a hematopoiese e a trombopoiese, efeito citoprotetor em células epiteliais, induz imunossupressão

IL-12

Células do estroma de medula óssea

Induz a produção de IFN-y, TNF-cx. e IL-2 por células T e NK

IL-15

Células T, astrócitos, micróglia, fibroblastos, células epiteliais

Atividade biológica semelhante a IL-2, induz proliferação de células mononucleares de sangue periférico e maturação de células NK (IL-1, IFN-y, TNF-cx.)

IL-17 (6 membros) (IL-17 A-F)

Células Thl 7

Estimula células epiteliais, endoteliais e fibroblastos a produzir IL-6, IL-8, G-CSF e ICAM-1

IL-23

Macrófagos, células dendríticas

Similar a IL-12 (induz IFN-y), ajuda na diferenciação de células T CD4+ em Th1 7

M-CSF (fator de estimulação das colônias de macrófagos)

Monócitos

Proliferação células precursoras de macrófagos

G-CSF (fator de estimulação das colônias de granulócitos)

Macrófagos

Proliferação, diferenciação e ativação de neutrófilos

GM-CSF (fator de estimulação das colônias de granulócitos e macrófagos)

Células T, macrófagos

Proliferação células precursoras de granulócitos e de macrófagos

SCF (Fator de célula-tronco)

Células estromais de medula óssea, fibrobrastos, células hepáticas fetais

Proliferação e diferenciação de células linfoides e mieloides

TGF-� (fator de transformação de crescimento beta)

Diversas células

VEGF-A (fator de crescimento endotelial vascular A)

Diversas células

Atividade anti-inflamatória, diferenciação de células Tem células Tr s' na presença de IL-6 diferencia células T CD4+ em Th 1 7 eg Estimulação da vasculogênese e da angiogênese

11-8 (CXCL8)

Diversas células

Ativação de neutrófilos e quimiotaxia

Rantes (CCLS)

Diversas células

Quimiotático para células T, monócitos, eosinófilos e basófilos

CXCL9, CXCL1 O, CXCL1 1

Diversas células

Quimiotático para células Thl (célula T CXR3 positivo) e induzida por IFNs

ICAM-1 (molécula de adesão intercelular-1)

Células endoteliais

Adesão e migração

VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular-1)

Leucócitos

Adesão e migração

E-selectina

Células endoteliais

Adesão e migração

TNF

lnterleuci nas

Fatores de crecimento

Quimiocinas

Moléculas de adesão

CAPÍTULO 8

Im u nolog ia

131

Proteína virai intacta

ettii � rn

'

-

"

Síntese de proteínas virais

----

Via de processamento do MHC classe li

Proteassomo

Núcleo

MHC classe li

Pepyídeos endogenos

li

cxj3

Transportador peptídico (TAP)

�

� () � ()

Via de processamento do MHC classe 1

RER

Vesícula exocítica

J

Golgi

------

Fusão das vesículas

classe 1

J Para a superfície celular

Vesícula Peptídeos

J

Endossomo

J superfície Para a

celular

Processamento

Complexo MHC classe li-antígeno

Antígeno exógeno

Complexo MHC classe Superfície celular !-antígeno

FIGURA 8.2 Vias de processamento antigênico. (MHC classe 1 e classe li). (Modificada e reproduzida, com autorização, de Parslow TG et ai. [edi tors]: Medical lmumunology, 1 Oth ed. McGraw-Hill, 2001. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

radiográfica dos cristais de proteínas MHC. Esses elegantes estudos ajudaram a explicar a função das proteínas MHC. A análise radiográfica (Fig. 8.3) mostra que os domínios da mo lécula MHC da classe I, mais afastados da membrana, são cons tituídos de duas hélices a paralelas, acima de uma plataforma criada por uma lâmina � pregueada. Sem dúvida, toda a estru tura assemelha-se a uma fenda, cujo, os lados são formados pelas hélices a, tendo como soalho as lâminas �· A análise ra diográfica também mostrou que a fenda era ocupada por um peptídeo. Em essência, portanto, o receptor de células T situa se diante do antígeno peptídico ligado em uma fenda formada pela proteína MHC. A Figura 8.4A mostra um diagrama sim plificado dessa interação. As proteínas do MHC exibem ampla especificidade para os antígenos peptídicos e muitos peptídeos podem ser apre sentados por qualquer alelo MHC (com ligação de um peptí deo de cada vez). As hélices a que formam a fenda de ligação

constituem o local dos resíduos de aminoácidos polimórficos nas proteínas MHC (i.e., os que variam entre alelos). Isso signi fica que diferentes alelos podem ligar-se a diferentes antígenos peptídicos e apresentá-los. Por todos esses motivos, o polimor fismo MHC exerce importante efeito no reconhecimento dos antígenos. A análise da função das células T, em que concerne à inte ração com moléculas MHC, revela que os antígenos peptídicos associados a moléculas MHC da classe I são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos CDS-positivos, enquanto os antígenos peptídicos associados às moléculas MHC da classe II são reco nhecidos por células T auxiliares CD4-positivas.

Processamento e apresentação antigênica O processamento e a apresentação do antígeno significam a maneira pela qual os antígenos se associam às próprias

132

SEÇÃO li

Imunologia

a2

Hélice a

Fenda de ligação peptídica i--?'�'--" �

a1

Oito lâminas �-pregueadas

a3

FIGURA 8.3 Diagrama estrutural da molécula de HLA de classe 1. (Re produzida, com autorização, de Bjorkman PJ et ai. Structure of the hu man class 1 histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature 1987; 329:506)

moléculas do MHC para a apresentação de células T com re ceptores apropriados. As proteínas de antígenos exógenos, co mo as bactérias, são internalizadas por vesículas endocíticas no interior das APCs, como os vários tipos de células dendríticas e os macrófagos. Em seguida, conforme ilustra a Figura 8.2, são expostas a proteases celulares existentes nas vesículas intrace lulares. São produzidos peptídeos de cerca de 10 a 30 resíduos

de aminoácidos em vesículas endossômicas. As vesículas en dossômicas então se fundem com vesículas exocíticas conten do moléculas MHC da classe II. Como outras glicoproteínas da membrana, as moléculas MHC da classe II são sintetizadas no retículo endoplasmático rugoso e, em seguida, processadas através do aparelho de Gol gi. Um terceiro polipeptídeo, a cadeia invariante (li), protege o local de ligação do dímero a� da classe li, até que o pH redu zido do compartimento criado, após a fusão com uma vesícula endossômica, provoque a dissociação da cadeia II. Depois, o complexo MHC da classe II-antígeno peptídico é transportado até a superfície celular para sua exibição e reconhecimento por um receptor de células T de uma célula T CD4. As células T CD4 podem agora ativar outras células T e B. A interação dos antígenos endógenos, no interior de uma célula infectada por um vírus e as moléculas de MHC classe I, está ilustrada na Figura 8.2. Resumidamente, as proteínas cito sólicas são degradadas por um complexo proteolítico conhe cido como proteassomo. Os peptídeos citosólicos têm acesso a moléculas MHC da classe I, nascentes no retículo endoplas mático rugoso através de sistemas transportadores de peptídeo TAPs. Os genes do TAP também são codificados no MHC. No interior do lúmen do retículo endoplasmático, os antígenos peptídicos com comprimento de cerca de 8 a 10 resíduos for mam complexos com proteínas MHC da classe 1 nascentes e cooperam com a �2-microglobulina para criar um complexo antígeno-peptídeo MHC da classe 1 estável e totalmente do brado, transportado, em seguida, até a superfície celular para exibição e reconhecimento por células T citotóxicas. O sulco de ligação da molécula da classe 1 é mais limitado do que o da molécula da classe II, e, por essa razão, são encontrados peptídeos mais curtos nas moléculas da classe 1 do que nas mo léculas MHC da classe II. Uma vez que as células T citotóxicas reconheçam o peptídeo antigênico via molécula MHC classe I, elas podem destruir as células infectadas por um vírus. Diversos vírus tentam vencer a resposta imunológica ao in terferir nas vias de processamento dos antígenos. Por exemplo, a proteína Tat do HIV é capaz de inibir a expressão das molé culas MHC da classe 1. Uma proteína do herpes-vírus liga-se a TAPs, impedindo o transporte dos peptídeos virais para o

APC ou célula-alvo

APC

MHC classe

MHC classe li

---+--

Peptídeo antigênico

Super--+- antígeno

Célula T A

Célula T B

FIGURA 8.4 Ligação do antígeno ao MHC e ao receptor de célula T. (A) um modelo de interação entre o peptídeo antigênico, o MHC e o TCR, é mostrado. As regiões Vª e v13 do TCR interagem com as hélices a, que formam o sítio de ligação ao peptídeo do MHC. (8) um modelo de interação entre um superantígeno, o MHC e o TCR, é mostrado. O superantígeno interage com a região v13 do TCR e com a região externa do sítio de ligação ao antígeno da molécula de MHC classe li. (Adaptada, com autorização, do Stites DG et ai. [editors]: Medical lmmunology, 9th ed. McGraw-Hill, 1997. © The McGraw-Hill Companies, lnc.)

CAPÍTULO 8 Imunologia retículo endoplasmático, em que estão sendo sintetizadas mo léculas da classe 1. Uma consequência de tais mecanismos ini bitórios é o não reconhecimento das células infectadas pelos linfócitos citotóxicos. Alguns superantígenos são capazes de ligar-se a moléculas MHC fora da fenda de ligação de peptídeo. Uma das consequên cias é que, enquanto um peptídeo em complexo com uma mo lécula MHC, normalmente, irá estimular apenas uma peque na porcentagem das células T no indivíduo, os superantígenos produzem a ativação inespecífica de até 10% das células T. São exemplos de superantígenos certas toxinas bacterianas, como as enterotoxinas estafilocócicas, a toxina da síndrome do choque tóxico e a exocitose A pirogênica de estreptococos do grupo A. Esses antígenos ligam-se à parte "externa" da proteína MHC e ao receptor de células T (Fig. 8.4B). Eles se mostram ativos em con centrações muito baixas (10-9 mol/L) e fazem com que as células T, que expressam sequências V� particulares, sejam estimuladas, liberando grandes quantidades de citocinas, como a IL 1 e o TNF. A liberação de grandes quantidades de citocinas (tempestade de citocinas [cytokine storm]), em decorrência da estimulação de um grande número de linfócitos T, é o que explica em grande parte a patogênese das doenças causadas por microrganismos que expressam superantígenos. A compreensão mais detalhada dos mecanismos de proces samento antigênico ajudou a elucidar as funções das células Tem diferentes etapas da resposta imune, como, por exemplo, a falta de resposta das células T a carboidratos, que pode ser explicada, em parte, pela incapacidade desses antígenos em se encaixarem, com grande afinidade ao sítio de ligação ao antígeno do TCR. Já, a necessidade de antígenos proteicos passarem por um proces so proteolítico, seria devido a essas células somente reconherem determinantes antigênicos lineares. Assim, o tipo do MHC que irá apresentar o antígeno dependerá da natureza do próprio an tígeno e como ele é processado do interior da APC.

Células B e anticorpos A imunidade humoral é mediada por anticorpos que são pro duzidos pelas células B do sistema imunológico. Cada indiví duo apresenta grande grupo de linfócitos B diferentes (�1011), com uma vida útil de dias ou semanas. São encontrados na me dula óssea, nos linfonodos e nos tecidos linfoides, associados a mucosas (mucosa associated lymphoid tissue [MALT]), (p. ex., tecido linfoide associado ao intestino [GALT], tonsilas e apêndice). A. Receptor antigênico em célula B

As células B expressam uma única molécula de imunoglobulina ( 105 cópias por célula) em sua superfície. Essa imunoglobulina funciona como receptor para célula B (B-cell receptors [BCRs]) a um único antígeno específico. Logo, cada célula B responde a somente um antígeno ou a grupos de antígenos molecularmente semelhantes. Todas as células B imaturas expressam imunoglo bu1inas da classe IgM ou IgD. Essas células também expressam, em sua superfície, receptores para fração Fc de imunoglobulinas e para diversas moléculas do sistema complemento. Um antígeno interage com o clone do linfócito B, que ex pressa o BCR que melhor se ajusta a ele. Com a ligação do an tígeno ao BCR, a célula B entra em mitose (expansão clonai). �

133

Esse clone se diferencia em plasmócito, que começa a secretar anticorpos. Uma vez que cada indivíduo pode apresentar 1011 moléculas de anticorpos diferentes, há um sítio de ligação na superfície da célula B, para praticamente qualquer determinan te antigênico. O passo inicial na produção de anticorpos se inicia com a ligação do antígeno à molécula BCR na superfície da célula B, que é seguida por diferentes etapas: (1) o complexo antígeno BCR é internalizado pela célula B e o antígeno é degradado em pequenas moléculas, que são expressas na superfície celular via molécula de MHC classe II. (2) O complexo peptídeo-MHC classe II na célula B é reconhecido pela célula T CD4 específica para o antígeno apresentado. Essas células T, geralmente, já in teragiram previamente com células dendríticas e se tornaram ativadas em resposta ao mesmo patógeno. Além disso, a intera ção das células B com as células T ocorre devido à migração dos antígenos nas áreas de fronteira desses dois tipos celulares nos orgãos linfoides secundários. (3) Quimiocinas como a CXCL13 e seu receptor (CXCR5) exercem um papel importante nessa interação. (4) O ligante de CD40 (CD40L) na superfície das cé lulas T se ligam ao CD40 expressado na superfície das células B (molécula coestimulatória) e a célula T produz diferentes cito cinas, tais como IL-4, IL-5, e IL-6, que induzem a proliferação das células B. (5) Finalmente, as células B ativadas migram para os folículos e se proliferam, formando os centros germinativos, em que ocorre a hipermutação somática e a troca de classe da molécula de anticorpo. As células B nesses centros germinati vos se diferenciam em plasmócitos produtores de anticorpos e em células B de memória. Detalhes sobre esse processo podem ser encontrados em Murphy et al. (2011). Deve-se ressaltar que alguns antígenos bacterianos podem estimular diretamente a produção de anticorpos, e não neces sitam de ajuda das células T para a ativação das células B. Esses antígenos são, geralmente, polissacarídeos e lipopolissacaríde os, sendo denominados antígenos timo independentes e indu zindo uma resposta de célula B, com limitada troca de classe e sem indução de memória imunológica. B. Estrutura do anticorpo e função efetora

Os anticorpos são imunoglobulinas, que reagem especifi camente com o antígeno que induziu a sua produção. Eles correspondem a cerca de 20% das proteínas plasmáticas. Os anticorpos produzidos em um animal em resposta a um único antígeno são heterogêneos, pois são formados a partir de di ferentes clones, cada um expressando um anticorpo capaz de interagir com um determinante antigênico diferente (anticor pos policlonais). As imunoglobulinas produzidas a partir de um único clone, como, por exemplo, uma célula plasmática tu moral (mieloma), são homogêneos e denominados anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser produ zidos a partir da fusão de uma célula de mieloma com um lin fócito produtor de anticorpos. Tal hibridoma pode produzir uma quantidade ilimitada de anticorpos monoclonais in vitro. O estudo dos anticorpos monoclonais forneceu importantes informações sobre a estrutura e a função dos anticorpos. As moléculas de imunoglobulinas (Ig) compartilham carac terísticas estruturais em comum, por exemplo, todas as imuno globulinas são compostas de uma cadeia polipeptídica leve e pesada. Os termos, leve e pesado referem-se ao peso molecular

134

SEÇÃO li

Imunologia

Sítio de ligação ao antígeno

Cadeia

Região aminoterminal

Cadeia pesada

Q)

-

e co êi) e o ü

Q)

Q)

§

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Q)

-

e co êi) e o ü êi) e o ü -'------' -

Região de dobradiça Carboidrato

Ativa complemento e fagocitose

§

êi) e o ü

Região carboxiterminal

Pontes de S-S FIGURA 8.5 Representação esquemática de uma molécula de lgG, indicando as regiões constantes e variadas das cadeias leves e pesadas. O fragmento Fab contém o sítio de ligação ao antígeno e o fragmento Fc é região cristalizável.

- isto é, as cadeias leves têm massa molecular de cerca de 25.000 dáltons, enquanto as cadeias pesadas têm massa mo lecular de aproximadamente 50.000 dáltons. Cada molécula Ig consiste em duas cadeias leves (L) e duas idênticas cadeias pesadas (H) ligadas por pontes dissulfeto. As cadeias leves per tencem a um de dois tipos: K (capa) ou À (lambda); a classifi cação baseia-se nas diferenças de aminoácidos observadas em regiões constantes (Fig. 8.5). Ambos os tipos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgM, lgA, IgE e IgD), mas qualquer molécula de imunoglobulina contém apenas um tipo de cadeia L. A porção aminoterminal de cada cadeia L con tém parte do local de ligação do antígeno. As cadeias pesadas (heavy, H) são diferentes para cada uma das cinco classes de imunoglobulinas e denominam-se y (gama), µ (mu), a (alfa), ô (delta) e E (épsilon) (Quadro 8.3). A porção aminoterminal de cada cadeia H participa no local de ligação do antígeno; a outra porção carboxiterminal forma o fragmento Fc (Fig. 8.5), que

QUADRO 8.3

exerce várias atividades biológicas (p. ex., ativação do comple mento e ligação dos receptores de superfície celular). Assim, uma molécula de anticorpo sempre consiste em ca deias H e L idênticas. A molécula de anticorpo mais simples tem a forma de um Y (Fig. 8.5) e consiste em quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias H e duas L. As quatro cadeias estão ligadas de modo covalente por ligações dissulfeto. Se uma molécula de anticorpo for tratada com uma enzima proteolítica (p. ex., papaína), ocorrerá a ruptura das ligações peptídicas na região da dobradiça. Essa ruptura produz dois fragmentos Fab idênticos, que mantêm o sítio de ligação do an tígeno, e um fragmento Fc, envolvido na transferência placen tária, na fixação do complemento, na ligação a várias células e em outras atividades biológicas. As cadeias L e H são subdivididas em regiões variáveis e regiões constantes. As regiões são constituídas de segmen tos repetidos dobrados tridimensionalmente, denominados

Características importantes de alguns produtos gênicos do MHC humano classe 1 e classe li Classe li

Classe 1

Loci genéticos (lista parcial)

HLA-A, HLA-B e HLA-C

HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR

Composição polipeptídica

MM de 45.000 + �2M (MM de 12.000)

Cadeia a (MM de 33.000), cadeia � (MM de 29.000), cadeia li (MM de

Distribuição celular

A maioria das células somáticas

Células apresentadoras de antígenos (macrófagos, células B, etc.), células T humanas ativadas por IFN-y

Apresentação de antígenos peptídicos para

Células T CDS

Células T CD4

Tamanho do peptídeo ligado

8 a 1 O aminoácidos

1 O a 30 ou mais aminoácidos

30.000)

nucleadas com exceção das células neurológicas e da retina

CAPÍTULO 8 Imunologia domínios, cuja estrutura foi determinada com alta resolução por cristalografia de raios X. A cadeia L consiste em um domínio variável (V1) e um domínio constante (C1). A maioria das cadeias H consiste em um domínio variável (VH) e três ou mais domínios constantes (CH). Cada domínio possui cerca de 110 aminoácidos de com primento. As regiões variáveis são responsáveis pela ligação do antígeno, enquanto as regiões constantes respondem pelas funções biológicas descritas adiante. No interior das regiões variáveis das cadeias L e H encon tram-se sub-regiões, que consistem em sequências de aminoá cidos extremamente variáveis (hipervariáveis), que formam o local de ligação do antígeno. As regiões hipervariáveis formam a área da molécula do anticorpo complementar em estrutura ao determinante antigênico ou epítopo, e, por isso, também são conhecidas como regiões de determinantes da complementari dade (complementarity-deterrnining regions [CDR]). Apenas 5 a 1O aminoácidos em cada região hipervariável constituem o local de ligação do antígeno. A ligação do antígeno não é covalente e envolve forças de Van der Waals, forças eletrostáticas e outras forças fracas, bem como pontes de hidrogênio e outras ligações.

Classes das imunoglobulinas A. lgG Cada molécula de IgG consiste em duas cadeias L e duas ca deias H ligadas por pontes de dissulfeto (forma molecular H2L2). Como possui dois sítios idênticos de ligação do antí geno, é denominada divalente. Existem quatro subclasses de IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), com base em as diferenças das sequências de aminoácidos da região constante da cadeia pesa da, o número e localização das pontes de dissulfeto. A IgG 1 re presenta 65% da IgG total. A IgG2 é dirigida contra antígenos

135

polissacarídicos e pode representar uma importante defesa do hospedeiro contra as bactérias encapsuladas. A IgG3 é mais efetiva como ativador de complemento, em virtude de sua re gião de dobradiça mais rígida, enquanto a IgG4 não ativa com plemento devido a sua estrutura mais compacta. A IgG é o anticorpo predominante nas respostas secundárias e constitui uma importante defesa contra as bactérias e os ví rus. Trata-se do único anticorpo que atravessa a placenta, sendo, por isso, a imunoglobulina mais abundante nos recém-nascidos. Esta classe também media o processo de opsonização por meio da ligação do complexo antígeno-anticorpo aos receptores Fc na superfície dos macrófagos e de outros tipos celulares.

B. lgM É a principal imunoglobu1ina produzida no início da resposta imunológica primária. A IgM é encontrada na superfície de pra ticamente todas as células B não comprometidas. É constituída de cinco unidades H2L2 (cada qual semelhante a uma unidade da IgG) e uma molécula da cadeia J (junção) (Figura 8.6). O pentâmero (MM de 900.000 dáltons) possui um total de 10 lo cais idênticos de ligação de antígeno e, portanto, uma valência de 10. Trata-se da imunoglobulina mais eficiente nas reações de aglutinação, fixação do complemento e outras reações antígeno anticorpo, e é também importante na defesa contra as bactérias e os vírus. Pode ser produzida por um feto que esteja sofrendo uma infecção. Como a sua interação com determinado antígeno pode envolver os 10 sítios de ligação, é, entre todas as imunoglo bu1inas, a que apresenta maior avidez. Além disso, a presença de IgM no soro pode ser útil no diagnóstico de diferentes doen ças infecciosas, uma vez que essa classe de imunoglobu1ina não atravessa a barreira placentária. Assim, sua presença no feto ou neonato é uma evidência de infecção ativa e intrauterina. C. lgA

S-S Cadeia J

s-s

s-s

FIGURA 8.6 Diagrama esquemático da estrutura pentamérica da molécula de lgM humana. Os monômeros de lgM são conectados entre si e na cadeia J por pontes de dissulfeto.

Consiste na principal imunoglobulina encontrada em secre ções como o leite, a saliva e a lágrima, bem como nas secreções das vias respiratórias e dos tratos intestinal e genital. Protege as mucosas contra o ataque de bactérias e vírus. Cada molécula de IgA secretora consiste em duas unidades H2L2, bem como em uma molécula da cadeia J e uma molécula de componente secretor. O componente secretor é uma proteína derivada da clivagem do receptor poli-Ig, que liga dímeros da IgA e facilita o seu transporte por meio das células epiteliais da mucosa. Existe certa quantidade de IgA no soro em forma de monômero H2L2* Há pelo menos duas subclasses, IgAl e IgA2. Algumas bactérias (p. ex., neissérias) são capazes de destruir a IgAl ao produzirem uma protease e, por conseguinte, podem vencer a resistência mediada por anticorpos nas superfícies das mucosas.

D. lgE A região Fc da IgE liga-se a um receptor sobre a superfície dos mastócitos, basóftlos e eosinófilos. A IgE ligada atua co mo receptor para o antígeno que estimulou sua produção, e o complexo antígeno-anticorpo resultante desencadeia respostas alérgicas do tipo imediato (anaftlático) por meio da liberação de mediadores.

136

SEÇÃO li

I m uno logia

E. lgD Atua como receptor de antígeno quando presente sobre a su perfície de certos linfócitos B. No soro, é encontrada apenas em diminutas concentrações. Até o momento, as funções dessa imunoglobulina não são completamente conhecidas.

Genes das imunoglobulinas e geração da diversidade Foram desenvolvidos mecanismos genéticos especiais para produzir o grande número de moléculas de imunoglobulinas (cerca de 101 1) que aparece no hospedeiro em resposta à esti mulação antigênica, sem necessidade de um número excessivo de genes. Por conseguinte, os genes das imunoglobulinas (e, como resumido adiante, os dos receptores de células T) sofrem recombinação somática para produzir a enorme diversidade de especificidades de anticorpos. Cada cadeia de imunoglobulina consiste em uma região variável (V) e uma região constante (C). Para cada tipo de ca deia de imunoglobulina (i.e., a cadeia leve capa Ka cadeia leve lambda (Â)e as cinco cadeias pesadas (yH, µH, aH, EH e ôH) existe um reservatório distinto de segmentos gênicos localiza do em diferentes cromossomos. Em seres humanos, as famí lias multigenes são encontradas nos seguintes cromossomos Â, cromossomo 22; K, cromossomo 2; e a família de cadeia pesa da, cromossomo 14. Cada um desses três Zoei contém um con junto de diferentes segmentos V amplamente separados dos segmentos C. Durante a diferenciação das células B, o DNA sofre rearranjo para que os segmentos gênicos selecionados se tornem adjacentes entre si no genoma. Uma família de enzi mas conhecidas como as V(D) J recombinases é responsável por esse processo de rearranjo gênico. A região variável de cada cadeia L é codificada por dois seg mentos: V e J. A região variável de cada cadeia H é codificada por três segmentos: V, D e J. Os segmentos são unidos em um único gene variável V funcional por rearranjo do DNA. Cada gene variá vel V organizado é transcrito com o gene constante C apropria do para produzir um RNA mensageiro (RNAm), que codifica a cadeia peptídica completa. As cadeias L e H são sintetizadas sepa radamente em polissomos e, por fim, reunidas no citoplasma para formar unidades H2L2 por meio de ligações dissulfeto. Em segui da, ocorre a adição de carboidrato durante a sua passagem pelos componentes da membrana celular (p. ex., aparelho de Golgi), e a molécula de imunoglobulina é liberada da célula. Esse mecanismo de rearranjo gênico permite a organização de enorme variedade de moléculas de imunoglobulina. A di versidade dos anticorpos depende ( 1) de inúmeros segmentos gênicos V, D e J; (2) da associação de combinações, isto é, de qualquer segmento gênico V com qualquer segmento D ou J; (3) da combinação aleatória de diferentes cadeias L e H; (4) de hipermutações somáticas; (5) da diversidade juncional criada pela junção imprecisa durante o rearranjo com a adição de nu cleotídeos em que a enzima terminal desoxinucleotidil transfe rase forma uma junção completa.

Mudança de classe das imunoglobulinas Inicialmente, todas as células B correspondentes a determi nado antígeno possuem IgM específica contra esse antígeno e

e

o o (/) 1Cl:S o e:: � ....e::.. (/) o � e o e::o .5,2 (..) e::Cl:S Q) "tJ

Resposta secundária ao antígeno A ----...

o.

Resposta primária ao antígeno A

,.. ...

/

/

Tempo (meses)

Resposta primária ao antígeno B /

1

Administração do antígeno A

2

3

4

/

/

/

....

,

'

'

',

5

....... _

_

6

Segunda adiministração do antígeno A e primeira do antígeno B

FIGURA 8.7 Intensidade da produção de anticorpos após primeira ad ministração de um antígeno e após dose de reforço (segundo contato).

produzem IgM em resposta à exposição ao antígeno. Em se guida, o rearranjo gênico permite a elaboração de anticorpos da mesma especificidade antigênica, mas de diferentes classes de imunoglobulinas. Na mudança de classe, o mesmo gene VH reunido é capaz de se associar, de modo sequencial, a diferen tes genes CH, de modo que a imunoglobulina produzida pos teriormente (IgG, IgA ou IgE) tem a mesma especificidade da IgM original, porém com características biológicas diferentes. A mudança de classe depende das citocinas liberadas por célu las T e ocorre também após estimulação antigênica.

A resposta primária Quando um indivíduo se depara com um antígeno pela pri meira vez, o anticorpo, contra esse antígeno, torna-se detec tável no soro depois de alguns dias ou semanas. Dependendo da natureza e da dose do antígeno, bem como da via de ad ministração (p. ex., oral, parenteral) a concentração sérica de anticorpos continua aumentando durante várias semanas e, em seguida, declina, podendo atingir níveis muito baixos (Fig. 8.7). Os primeiros anticorpos a serem formados são a IgM, se guida da IgG, da IgA ou de ambas. Os níveis de IgM tendem a declinar antes dos níveis de IgG.

A resposta secundária No caso de um segundo encontro com o mesmo antígeno (ou com um antígeno estreitamente relacionado de "reação cruza da"), meses ou anos após a resposta primária, a resposta hu moral é mais rápida e os níveis de anticorpos atingem valores mais elevados que os observados durante a resposta primária. Essa alteração na resposta é atribuída à persistência das "célu las de memória" sensíveis ao antígeno após a primeira resposta imunológica. Na resposta secundária, a concentração de IgM produzida é qualitativamente semelhante àquela observada após o primeiro contato com o antígeno; todavia, ocorre a pro dução de uma quantidade muito maior de IgG e o nível desta imunoglobulina tende a persistir por muito mais tempo do que na resposta primária. Além disso, tal anticorpo tende a ligar se mais firmemente ao antígeno (i.e., exibe maior afinidade) e, por conseguinte, dissocia-se com menos facilidade.

CAPÍTULO 8 Imunologia

Funções protetoras dos anticorpos Em virtude da estreita complementariedade estrutural entre os anticorpos e o antígeno que induziu a sua produção, os dois tendem a ligar-se toda vez que se encontram, tanto in vitro quanto in vivo. Essa ligação não é covalente e envolve forças eletrostáticas, forças de Van der Waals e outras forças fracas. Os anticorpos podem produzir resistência à infecção por cinco pr1nc1pa1s mecanismos. *

*

*

*

1 . Aumento da fagocitose os anticorpos realizam opso nização de um antígeno estranho (revestimento), permitindo que o mesmo possa ser mais facilmente reconhecido por fagó citos. Além disso, a imunidade mediada por anticorpos con tra bactérias é mais eficaz quando dirigida contra as infecções microbianas, cuja virulência está relacionada com cápsulas de polissacarídeos (p. ex., pneumococos, Haemophilus spp., Neis seria spp.). Nessas infecções, os anticorpos formam complexos com os antígenos capsulares, tornando os microrganismos sus cetíveis à ingestão por células fagocíticas e a sua destruição no interior das células. -

2. Neutralização virai anticorpos direcionados especifica mente contra proteínas virais podem se ligar à partícula viral, bloqueando sua capacidade de se aderir ao seu receptor celular. Assim, como o vírus não invade a célula hospedeira, sua repli cação fica comprometida. -

3. Neuratralização de toxinas anticorpos podem neutra lizar toxinas de diferentes microrganismos (p. ex., toxina difté rica, tetânica e botulínica) e inativar seus efeitos nocivos. -

4. Lise mediada por complemento

a ligação de anticor pos a proteínas virais na supercície de uma célula infectada ou de um microrganismo pode ativar o sistema complemento, re sultando em lise celular. -

5. Citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) a adesão de anticorpos a proteínas virais na superfície de cé lulas infectadas pode levar a interação dessas células revestidas de anticorpos, com diferentes tipos celulares (células NK, PMNs, macófagos e células T CDS+), resultando em sua lise. Uma vez que esses anticorpos são protetores, diferentes estratégias são utilizadas para induzir sua produção (imunidade ativa), ou para sua administração no hospedeiro (imunidade passiva). -

A. Imunidade ativa

A imunidade ativa é induzida após contato com um antígeno estranho (p. ex., microrganismos e seus produtos). Esse conta to pode ser fruto de uma infecção clínica ou subclínica, de uma imunização com agentes infecciosos atenuados, inativados ou com antígenos desses agentes, do contato com produtos micro bianos (p. ex., toxinas e toxoides), e por transplantes de células estranhas. Em todos esses exemplos, o hospedeiro ativamente produz anticorpos. Contudo, a proteção é retardada até que a sua produção alcance uma concentração efetiva. B. Imunidade passiva

A imunidade passiva é gerada pela administração de anticorpos pré-formados. A principal vantagem desse tipo de imunidade

137

é a pronta disponibilidade de uma grande quantidade de an ticorpos. Essa técnica pode ser útil contra certos vírus (p. ex., vírus da hepatite B), após acidentes com instrumentos perfu rocortantes de indivíduos não vacinados*. Além dos efeitos protetores mediados por anticorpos, efeitos deletérios podem ocorrer. A imunidade passiva pode desencadear reações de hi persensibilidade, caso esses anticorpos sejam de outra espécie. Já na imunidade ativa, a ligação dos anticorpos ao antígeno leva à formação de imunocomplexos circulantes, em que sua deposição nos tecidos resulta no desenvolvimento de disfun ções, como, por exemplo, a deposição de imunocomplexos nos rins pode induzir glomerulonefrite a partir de uma infecção estreptocócica.

Células T A. Imunidade de base celular

A imunidade humoral é importante nas enfermidades media das por toxinas, nas infecções microbianas, nas quais o prin cipal fator de virulência é a cápsula polissacarídica e como parte da resposta do hospedeiro a determinadas infecções vi rais. Contudo, a imunidade de base celular desempenha uma função central na defesa do hospedeiro a uma variedade de patógenos. Nessa seção, será revisado o desenvolvimento das células T, sua proliferação e diferenciação e, finalmente, suas funções efetoras. 1 . Desenvolvimento das células T No interior do timo, as células progenitoras das células T sofrem diferenciação, sob a influência de hormônios tímicos, passando a expressar o re ceptor de célula T (TRC). Esses TCRs passam por um processo de recombinação dos segmentos gênicos VDJ, que codifica pa ra a cadeia beta do TCR, seguido pelo rearranjo da cadeia alfa, assim, criando um TCR a� funcional. A maioria das células expressa TCR a�, porém algumas células T podem expressar TCR yô. Essas células se tornam agora positivas, tanto para ex pressão de CD4 e CDS quanto para moléculas correceptoras. A esse ponto, as células T expressam em sua superfície um TCR funcional. Em seguida, as células T sofrem processos de sele ção positiva e negativa, que resultam em retenção das células dotadas dos receptores de antígenos de maior utilidade, isto é, os específicos para os antígenos não próprios (estranhos). Esses antígenos também são somente reconhecidos por mo léculas de MHC próprias (restrição de MHC). Os clones po tencialmente autoimunes são suprimidos ou funcionalmente inativados (tornando-se anérgicos). Uma consequência dos processos de seleção é que cerca de 95% dos timócitos morrem no timo. Como consequência do processo de maturação final, essas células perdem a capacidade de expressão concomitante de CD4 e CDS e se tornam células T TRC/CD3 positivas, que expressam CD4 ou CDS. Apenas uma minoria de células T em desenvolvimento expressa os receptores apropriados para se rem retidos e sair para a periferia, onde podem maturar em células T efetivas. -

* N. de RT. A imunidade passiva também pode ocorrer de forma natural. Anticorpos matemos do isotipo IgG passam pela barreira placentária, for necendo uma imunidade temporária para o neonato. Outro mecanismo de transmissão ocorre durante a amamentação, principalmente durante a primeira, pela presença de uma grande quantidade de anticorpos do iso tipo IgG e IgA.

138

SEÇÃO li

Imunologia

2. Receptor de célula T para antígenos - O receptor de cé

lulas T é uma proteína heterodimérica transmembrana, consti tuída de duas cadeias ligadas por dissulfeto. Como mencionado anteriormente, existem duas classes diferentes de receptores de células T, a classe a e � e a classe y e ô. As células T a� cons tituem o fenótipo celular T predominante, sendo subdivididas de acordo com a expressão de outros marcadores de superfície celular, as proteínas conhecidas como CD4 e CDS. As células T que expressam yô são relativamente raras nos seres humanos e parecem predispostas ao reconhecimento de antígenos bacte rianos encontrados frequentemente - p. ex., certos glicolipí deos e lipídeos fosforilados. As células T yô são principalmente encontradas no epitélio dos tratos reprodutivo e gastrintesti nal. Os TCRs apresentam regiões variáveis e constantes, como observado nas moléculas de anticorpos. As proteínas receptoras de células T possuem regiões variá veis e constantes semelhantes às moléculas de anticorpos. As regiões variáveis localizam-se nas extremidades aminotermi nais da cadeia polipeptídica, afastadas da membrana celular. Ambas as cadeias contribuem para o domínio variável, que interage com o antígeno apresentado por proteínas próprias codificadas no complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os genes dos receptores de células T assemelham-se es treitamente aos genes das imunoglobulinas, e a produção de diversidade no receptor de células T é obtida, em grande parte, de modo análogo ao processo descrito anteriormente para as imunoglobulinas. Por conseguinte, existem inúmeros segmen tos de regiões variáveis, que contribuem para um repertório de diferentes especificidades antigênicas; inúmeros segmentos V, D e J capazes de se combinar de diferentes maneiras. Existem mais segmentos J e D para os genes dos receptores de células T do que para os genes das imunoglobulinas. Em todas as células T funcionais específicas do antígeno, as duas cadeias dos receptores de células T estão associadas, de modo não covalente, a seis outras cadeias polipeptídicas, com postas de quatro proteínas diferentes que formam o complexo CD3. As proteínas invariantes do complexo CD3 são responsá veis pela transdução do sinal recebido pelo receptor de células T ao reconhecer o antígeno no interior da célula. As quatro proteínas do complexo CD3 são proteínas transmembrana, que podem interagir com tirosinoquinases citosólicas no in terior da membrana. É essa interação que inicia os eventos bioquímicos de transdução de sinais que levam à transcrição gênica, à ativação celular e ao início das atividades funcionais das células T. As moléculas CD4 e CDS, que diferenciam as duas prin cipais classes funcionais de células T, atuam como moléculas correceptoras sobre a superfície da célula T. Durante o reco nhecimento do antígeno, as moléculas CD4 e CDS interagem com o complexo receptor de célula T e com moléculas MHC, na superfície da APC. A molécula CD4 liga-se a moléculas MHC da classe li, enquanto a molécula CDS liga-se a molécu las MHC da classe 1. 3. Proliferação e diferenciação das células T - A prolifera ção das células T depende de uma série de eventos. Na apresen tação via molécula de MHC classe li, dois sinais são necessários para que as células T CD4 naives sejam ativadas. O primeiro sinal é dado pela interação do TCR na superfície da célula T,

com o complexo peptídeo-MHC da APC. A glicoproteína CD4 na célula T naive atua como correceptor se ligando ao MHC classe II. Essa ligação assegura a estabilidade entre a célula T e a APC. O segundo sinal (coestimulação), que é necessário para a ativação da célula T, é proveniente da interação das moléculas coestimulatórias da família B7 (B7-1/B7-2, também identifica como CDSO e CDS6), na superficie da APC, com o CD2S na superfifice da célula T. Uma vez, ocorrendo esses dois sinais (TCR-peptídeo-MHC classe II e CD2S-B7-1/B7-2), uma série de vias bioquímicas são desencadeadas no interior celular, re sultando na síntese de DNA, mitose e proliferação. Durante esses eventos, a célula T secreta citocinas (principalmente IL-2 e IFN-y) e aumenta a expressão de receptores para IL-2, resul tando na sua proliferação e diferenciação em células efetoras. A ativação das células T CDS ocorre quando seu TCR in terage com o complexo peptídeo-MHC classe 1 expressado na superfície das células infectadas. A glicoproteína CDS na super fície da célula T atua como correceptor se ligando à molécula de MHC classe 1 na APC. Novamente, essa interação mantém as duas células ligadas, durante a ativação-antígeno específica. Uma vez ativada, a célula T citotóxica produz IL-2 e IFN-y, se multiplica e se diferencia em célula efetora. Ao contrário da ativação da célula T CD4, a célula T CDS é, geralmente, inde pendente de moléculas coestimulatórias e as células infectadas por vírus são destruídas através de grânulos citotóxicos libera dos pela célula T CDS. B. Funções efetoras da célula T

1 . Células CD4 efetoras - As células T CD4 proliferativas po dem se diferenciar em uma das quatro principais categorias de células efetoras: células Thl, células Th2, células Th17 e células regulatórias (célula Treg). Na presença de IFN-y, Thl predo mina, levando à ativação de macrófagos e à indução de troca de classe em células B, para produção de diferentes subclasses de IgG. Ambos os casos, resultam na eliminação bacteriana tanto pela destruição direta por macrófagos ativados por IFN-yquan to pela destruição facilitada por opsonização. Essas células Thl também produzem IL-2 e IFN-y. Na presença de IL-4, células Th2 predominam e ativam mastócitos e eosinófilos, além de es timular células B a produzirem anticorpos da classe IgE, ajudan do na resposta imune contra helmintos. As células Th2 secretam IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Quando TGF-� e IL-6 estão concomi tantemente presentes, as células T CD4 se diferenciam em célu las Thl7. Essas células produzem IL-17 e IL-22. A IL-17 é uma citocina que induz as células estromais e epiteliais a produzirem IL-S. A IL-S, por sua vez, é uma potente quimiocina responsável pelo recrutamento de neutrófilos e macrófagos em tecidos in fectados. As células T se diferenciam em Treg, quando expostas apenas a TGF-�. Essas células são responsáveis pela supressão da resposta imune. Elas são identificadas pela expressão de CD4 e de CD25 na superfície e pelo fator de transcrição Foxp23. As células Treg produzem TFG-� e IL-10, as quais participam no processo de supressão da resposta imune. 2. Células CDS efetoras - As células CDS se diferenciam em

células citotóxicas efetoras pela interação do TCR e pelo com plexo peptídeo-MHC classe 1 na superfície de uma célula infec tada. Após o reconhecimento, as células T CDS promovem a destruição da célula infectada. O principal método de destruição

CAPÍTULO 8

.

.

é através da liberação de grânulos citotóxicos, contendo perforinas, granzrrnas e uma terceira protema, recentemente, identificada como granulizina. Assim, a liberação das perforinas pelas células T CDS, ajudam as grazimas e as granulisinas a penetra rem na célula infectada. As granzimas iniciam a apoptose (mor te celular programada) pela ativação das caspases celulares. Esse mesmo fenômeno também ocorre durante o reconhecimento de células tumorais pelas células T CDS. Para informações adicio nais sobre esse tópico, ver Murphy et al., (2011). '

Via de MB lectina

Via clássica

� Superfícies

\ Complexo

microbianas

imune *

\

C1 ativado C4 C2

-�

COMPLEMENTO O sistema do complemento inclui proteínas séricas e ligadas à membrana que atuam em ambos os sistemas de defesa do hos pedeiro, o adaptativo e o inato. Essas proteínas são altamente reguladas e interagem através de uma série de cascatas proteo líticas. Vários componentes do complemento são proenzimas, que devem ser clivadas para a formação de enzimas ativas. Os componentes da via clássica são designados por Cl a C9 e a sequência de reação é Cl-C4-C2-C3-C5-C6-C7-CS-C9.

Existem três principais vias de ativação do complemento: a via clássica, a via alternativa e a via de ativação mediada por

Via alternativa

J Superfícies

microbianas

I

C3

/�- Fator B Fator D [C3bBb] Properdina

C3

C3a C3b

/"

[C4b2bC3b] [C3bBbC3b] Anafilatoxinas CS convertases cs

A ativação do complemento resulta em quatro importantes funções efetoras: (1) citólise, (2) quimiotaxia, (3) opsonização e (4) anafilatoxina.

Vias de ativação do complemento

[C4b2b]

139

C3 convertases

Efeitos biológicos do complemento

1. Citólise é a lise de células, tais como bactérias, células in fectadas e células tumorais. Esse processo ocorre através do desenvolvimento do complexo de ataque à membrana (membrane attack complex [MAC]) (CSb, 6, 7, S, 9), que é inserido na membrana de uma célula ou de um microrga nismo. O MAC resulta na perda da integridade osmótica e lise celular 2. Quimiotaxia é um processo no qual uma célula do siste ma imunológico, usualmente um fagócito, é atraído e se move em direção ao fator solúvel. Por exemplo, o CSa é um potente fator quimiotático que estimula a migração de neutrófilos e de monócitos em direção ao antígeno. 3. Opsonização é um processo no qual um microrganismo ou um complexo antígeno-anticorpo se torna revestido de moléculas que se ligam a receptores específicos na su perfíce de fagócitos. Logo, a fagocitose é mais eficiente na presença de C3b, uma vez que fagócitos apresentam recep tores específicos para essa molécula. 4. Anafilatoxinas promovem vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular. Tanto C3a quanto CSa são po tentes promotores de vasodilatação e permeabilidade vascular. Essas duas moléculas também estimulam mas tócitos e basófilos a liberarem histamina. Essa função do complemento resulta no aumento do fluxo sanguíneo, no sítio de infecção ou estimulação, permitindo a entrada de mais componentes do sistema complemento (anticorpos, citocinas, quimiocinas e células do sistema imune), que irão, cada vez mais, amplificar a resposta imune.

l MBL

Imunologia

csa

r C6,C7,C8,C9 C5�9 I CSb

Complexo de ataque à membrana

! Lise celular

FIGURA 8.8 Sequência de reações do complemento.

lectinas ligadoras à manose (Via lectínica, mannose-binding lectin [MBL]) (Fig. S.S). Todas as vias podem resultar na for mação da MAC. Essas três vias também levam à liberação de CS convertase, que por sua vez cliva a CS em CSa e CSb. Como mencionado anteriormente, CSa é uma anafilatoxina e um fa tor quimiotático. O CSb se liga ao C6 e ao C7, para formar um complexo que se insere na bicamada da membrana. Em segui da, CS se liga ao complexo C5b-C6-C7, seguida da polimeriza ção de até 16 moléculas de C9 para produzir o MAC. O MAC, então, gera um canal ou poro na membrana, causando citólise devido à passagem de água atrás da membrana da célula.

A via clássica O componente Cl, ligado a um local na região Fc, é constituí do de três proteínas: Clq, Clr e Cls. A Clq é um agregado de polipeptídeos que se ligam à porção Fc da IgG e da IgM. O complexo imune antígeno-anticorpo, complexado com Cl, ativa a Cls, que cliva C4 e C2, formando C4b2b. Este com plemento é a C3 convertase ativa que cliva moléculas de C3 em dois fragmentos: C3a e C3b. O fragmento C3b forma um complexo com C4b2b, produzindo uma nova enzima, a CS convertase, que cliva o componente CS, formando CSa e CSb.

140

SEÇÃO li Imunologia

Essa reação também desencadeia a formação do MAC e a lise celular. Apenas a lgM e a lgG ativam ou fixam o complemento através da via clássica. Entre as lgG, apenas as subclasses l , 2 e 3 fixam o complemento, enquanto a subclasse lgG4 não apre senta essa capacidade. Um exemplo da via clássica pode ser observado, durante a infecção pelo vírus herpes simples (HSV). A replicação viral é acompanhada pela inserção de proteínas virais na superfí cie celular. Anticorpos específicos contra o HSV se ligam na superfície das células infectadas através do sítio Fab. A fração Fc do complexo antígeno-anticorpo é agora exposta e pronta para ligação do Cl. A via clássica é ativada e a célula infectada é destruída pelo MAC.

A via alternativa Agentes infecciosos podem ativar o sistema complemento, através da produção celular dos fatores B, D e properdina. Es ses fatores clivam o C3 e geram C3 convertase. A C3 converta se (C3bBb) alternativa, por sua vez, produz mais C3b. O C3b adicional liga-se à C3 convertase para formar C3bBbC3b, que é a CS convertase da via alternativa que produz CSb, levando à produção do complexo de ataque à membrana descrito ante riormente.

A via lectínica de l igação à manose

Nos últimos anos, surgiu o conceito de uma via adicional de ativação do complemento - a via de MB lectina. Seu principal componente é uma proteína plasmática denominada MBL. A MBL liga-se a resíduos de açúcar, como a manose, encontrados nos polissacarídeos de superfície microbianos, como o LPS. O complexo MBL, quando ligado a superfícies microbianas, pode ativar C4 e C2. O restante desta via prossegue da mesma ma neira que a via clássica de ativação do complemento. A. Regulação do sistema do complemento

O sistema do complemento é regulado por diversas proteínas séricas em diferentes estágios: (1) o inibidor de Cl liga-se à atividade de serina protease de Clr e Cls, inativando-a; (2) o fator 1 cliva C3b e C4b, reduzindo, assim, a quantidade dis ponível de CS convertase; (3) o fator H intensifica o efeito do fator 1 sobre C3b; e (4) o fator P (properdina) protege C3b e estabiliza a C3 convertase da via alternativa. A regulação tam bém é proporcionada por proteínas que têm a capacidade de acelerar a decomposição das proteínas do complemento - p. ex., o fator acelerador da decomposição, uma proteína ligada à membrana e encontrada na maioria das superfícies das células sanguíneas, que pode atuar ao acelerar a dissociação das C3 convertases de ambas as vias.

Deficiências do complemento e evasão do patógeno Foram descritas muitas deficiências genéticas de proteínas do complemento que, em geral, resultam em aumento da susce tibilidade a doenças infecciosas (p. ex., deficiência de C2 leva frequentemente a graves infecções por bactérias piogênicas). A deficiência nos componentes do complexo de ataque à

membrana aumenta acentuadamente a suscetibilidade do indi víduo a infecções por Neisseria. Também são conhecidas defi ciências de componentes da via alternativa (p. ex., a deficiência de properdina, associada à maior suscetibilidade à doença me ningocócica). Ocorrem também deficiências nas proteínas de regulação do complemento. Por exemplo, a perda do inibidor da proteína Cl leva a angioedema hereditário. O sistema com plemento é um importante mecanismo na proteção do hospe deiro. Alguns patógenos desenvolveram diferentes estratégias para escapar desse sistema. Por exemplo, alguns microrga nismos interferem no processo de opsonização mediado pelo C3b, ou, no desenvolvimento do complexo MAC. A ativação do sistema complemento também pode ser inibido por deter minadas proteínas expressas por microrganismos, tais como a proteína A e a proteína C, que se ligam à fração Fc do lgG. Finalmente, os microrganismos podem produzir enzimas que degradam diferentes componentes do sistema complemento, sendo assim, mais patogênicos.

CITOCINAS Nas últimas duas décadas, foi observado um boom" na biologia das citocinas. As citocinas são potentes proteínas regulatórias de baixo peso molecular, produzidas transitória e localmente por diferentes tipos celulares. Hoje, é reconhecido que as ci tocinas são proteínas multifuncionais, cujas propriedades bio lógicas são fundamentais na hematopoiese, imunidade, nas doenças infecciosas, na oncogênese, homeostasia, reparo celu lar e no crescimento e desenvolvimento celular. As citocinas, geralmente, atuam como moléculas sinalizadoras, se ligando aos seus receptores glicoproteicos específicos na membrana celular. Essa interação inicial é seguida por uma retransmissão de sinais para o núcleo celular. A transdução do sinal é realiza da de forma similar a muitos sistemas hormônio-receptor, via fosforilação mediada por proteína quinase de proteínas cito plasmáticas. De fato, a atividade tirosina quinase é intrínseca a vários receptores de citocinas. ((

Classificação e funções As citocinas são classificadas em grupos baseados em funções comuns. As categorias funcionais são: imunorregulatória, pró inflamatória, anti-inflamatória e diferenciação e crescimento celular. Uma importante citocina imunorregulatória, atuando na apresentação antigênica, é a IFNy. As citocinas pró-infla matórias são comumente encontradas durante as doenças in fecciosas, incluindo IL-1, 11-6, TNF-a e IFNs. Já as citocinas anti-inflamatórias incluem 1110, IL-1 1 , TGF-� e IFN-� e são necessárias para suprimir e regular negativamente uma intensa resposta imune. As citocinas que apresentam um importante papel no crescimento e diferenciação celular incluem os fato res de estimulação de colônia (CSFs) e o fator de célula tronco (SCF). Diferentes citocinas, suas origens e funções estão indi cadas no Quadro 8.1. As citocinas são igualmente importantes na diferencia ção das células T em diferentes subpopulações. Enquanto as células Thl são geradas na presença de IFN-y, as células Th2 são diferenciadas na presença de IL-4. Já, as células Th17 são produzidas na presença de TGF-� e IL-6, porém, na presença

CAPÍTULO 8 Imunologia de somente TGF-�, as células T se diferenciam em Treg. Cada uma das subpopulações secreta seu próprio conjunto de cito cinas que apresentam propriedades regulatórias distintas. As sim, as citocinas direcionam o tipo de resposta imune que será gerada.

Apl icações Hoje, há pelo menos quatro aplicações clínicas para as citoci nas. Em primeiro lugar, as citocinas servem como biomarca dores de doenças e fornecem pistas dos seus mecanismos de patogênese. Por exemplo, as citocinas pró-inflamatórias, como a TNF-a, IL-1 e IL-6, podem ser detectadas no soro de pacien tes com choque séptico. Essas citocinas parecem exercer um papel crítico no desenvolvimento dessa desordem e a detecção de sua presença pode ter valor prognóstico em sepse grave. Em segundo lugar, a dosagem da produção das citocinas in vitro é também útil no monitoramento da condição imunológica. As funções das células T podem ser avaliadas por sua capacidade de produção de IFN-y. Esse procedimento está sendo realiza do no diagnóstico da reativação da tuberculose (TB). Em ter ceiro lugar, as citocinas recombinantes são agentes-chave na terapêutica. Um exemplo desse procedimento é exemplificado pelas moléculas de IFNs. O FDA aprovou o uso de IFN-a para infecções pelo vírus da hepatite C, o IFN-�, para o tratamento da esclerose múltipla e o IFN-y para a doença granulomatosa crônica (Chronicgranulomatous disease [CGD]). E, finalmente, em quarto lugar, as citocinas podem ser alvo para terapias. Re centemente, antagonistas para os receptores de citocinas e anti corpos monoclonais anticitocinas têm sido utilizados, de forma satisfatória, em patologias, que resultam em superexpressão da resposta imune. Exemplos dessas terapias são os inibidores de TNF-a, para o controle da artrite reumatoide e os inibidores de IL-2 e IL-15, no tratamento de determinadas neoplasias e em transplantes.

HIPERSENSIBILIDADE O termo "hipersensibilidade" refere-se a uma condição em que uma resposta imunológica resulta em reação exagerada ou inapropriada, prejudicial ao hospedeiro. No indivíduo, es sas reações ocorrem tipicamente após o segundo contato com um antígeno específico (alergênio). O primeiro contato é um evento preliminar necessário que induz sensibilização ao alergen10. Existem quatro tipos principais de reação de hipersensibili dade: os tipos I, II e III são mediados por anticorpos, enquanto o tipo IV é mediado pelas células T. A

'

Tipo 1: hipersensibilidade imediata (alergia) A hipersensibilidade tipo I manifesta-se por reações teciduais que ocorrem poucos segundos após a combinação do antíge no com o anticorpo IgE correspondente. Os sintomas podem ocorrer na forma de anaftlaxia sistêmica (p. ex., após a admi nistração de proteínas heterólogas) ou como reação local (p. ex., alergia atópica, incluindo rinites como a febre do feno). O mecanismo geral da hipersensibilidade imediata envolve as seguintes etapas: um antígeno induz a formação de anticorpo

141

IgE, que se liga, especificamente, através de sua porção Fc, a um receptor de alta afinidade para fração Fc de IgE existente na superfície dos basóftlos, eosinófilos e mastócitos. Algum tempo depois, a ocorrência de uma segunda exposição do indivíduo com o mesmo antígeno resulta em fixação desse antígeno à IgE ligada à célula, estabelecendo ligações cruzadas das moléculas de IgE e liberando, em segundos a minutos, mediadores far macologicamente ativos das células. Os nucleotídeos cíclicos e o cálcio são essenciais para a liberação de mediadores. Pode haver também uma segunda "fase tardia'', de vários dias de du ração, envolvendo a infiltração dos tecidos com leucócitos e principalmente eosinóftlos. A seguir são mencionados alguns mediadores importantes da hipersensibilidade do tipo I e seus principais efeitos. 1 . Histamina existe em um estado pré-formado nas pla quetas bem como nos grânulos dos basóftlos, mastócitos e eosinófilos. Sua liberação provoca vasodilatação, aumento da permeabilidade capilar e contração da musculatura lisa (p. ex., broncospasmo). Os anti-histamínicos têm a capacidade de blo quear os receptores locais de histamina, mostrando-se relativa mente eficazes na rinite alérgica, mas não na asma. A histamina é um dos mediadores primários da reação do tipo I. -

2. Prostaglandinas e leucotrienos as prostaglandinas e os leucotrienos derivam do ácido araquidônico através da via da ciclo-oxigenase. As prostaglandinas provocam principalmen te broncoconstrição. Os leucotrienos causam principalmente aumento da permeabilidade dos capilares. Esses mediadores, juntamente com as citocinas, como o TNF a e a IL4, são desig nados como mediadores secundários das reações do tipo I. -

A. Tratamento e prevenção das reações anafiláticas O tratamento tem por objetivo reverter a ação dos mediadores ao manter as vias respiratórias, estabelecer uma ventilação ar tificial, se necessário, e fornecer suporte para a função cardíaca. Podem-se administrar um ou mais dos seguintes agentes: epi nefrina, anti-histamínicos e corticosteroides. A prevenção de pende da identificação do alergênio (frequentemente por meio de teste cutâneo), e o indivíduo deve evitar subsequentemente a exposição.

B. Atopia Os distúrbios de hipersensibilidade atópica exibem forte predis posição familiar e estão associados a níveis elevados de IgE. A predisposição a atopia é claramente genética; entretanto, os sin tomas são induzidos em consequência da exposição do indivíduo a alergênios específicos. Tipicamente, esses antígenos são am bientais (p. ex., alergia respiratória a pólen, ambrósia-americana doméstica) ou alimentares (p. ex., alergia intestinal a moluscos). As manifestações clínicas comuns consistem em febre do feno, asma, eczema e urticária. Muitos indivíduos sofrem reações do tipo imediato a testes cutâneos (injeção, teste epicutâneo, teste de escarificação), em que se utiliza o antígeno agressor.

Tipo li: hipersensibilidade A hipersensibilidade tipo II envolve a ligação dos anticorpos IgG a antígenos da superfície celular ou a moléculas da matriz

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extracelular. O anticorpo dirigido contra os antígenos da su perfície celular pode ativar o complemento (ou outros efetores) com a consequente lesão das células. Em consequência, pode ocorrer lise mediada pelo complemento, conforme se observa em anemias hemolíticas, reações transfusionais ABO e doença hemolítica Rh. Certos fármacos, como a penicilina, podem ligar-se a proteí nas de superfície sobre os eritrócitos, desencadeando a formação de anticorpos. Em seguida, esses anticorpos autoimunes podem combinar-se com a superfície da célula, resultando em hemólise. Na síndrome de Goodpasture, ocorre a produção de anticorpos contra as membranas basais dos rins e dos pulmões, resultando em grave lesão dessas membranas graças à atividade dos leucó citos atraídos pelo complemento. Em alguns casos, os anticorpos dirigidos contra receptores de superfície celular alteram a função sem causar lesão celular (p. ex., na doença de Graves, um auto anticorpo liga-se ao hormônio estimulador da tireoide, causan do hipertireoidismo por estimulação da tireoide).

Tipo Ili: hipersensibilidade por imunocomplexos Quando o anticorpo se combina com seu antígeno específico, formam-se imunocomplexos. Normalmente, esses imuno complexos são imediatamente removidos, mas em certas oca siões persistem e depositam-se nos tecidos, provocando vários distúrbios. Nas infecções microbianas ou virais persistentes, os imunocomplexos podem depositar-se em órgãos (p. ex., os rins), resultando em disfunção. Nos distúrbios autoimunes, os antígenos "próprios" podem induzir a formação de anticorpos que se ligam a antígenos dos órgãos ou que se depositam em órgãos ou tecidos em forma de complexos, particularmente nas articulações (artrite), nos rins (nefrite) e nos vasos sanguíneos (vasculite). Finalmente, antígenos do ambiente, como esporos de fungos, e certos fármacos podem causar a formação de imu nocomplexos com doença. Seja qual for o local de deposição dos imunocomplexos, eles ativam o sistema do complemento, e os macrófagos e neu trófilos são atraídos para o local, onde causam inflamação e lesão tecidual. Existem duas formas principais de hipersensibi lidade mediada por imunocomplexos. Uma delas é local (rea ção de Arthus), sendo tipicamente produzida na pele quando se injeta uma baixa dose de antígeno com a formação local de imunocomplexos. Os anticorpos IgG estão envolvidos, e a con sequente ativação do complemento leva a ativação dos mas tócitos e neutrófilos, liberação de mediadores e aumento da permeabilidade vascular. Tipicamente, essa reação ocorre em cerca de 12 h. Uma segunda forma de hipersensibilidade tipo III envolve a doença sistêmica por imunocomplexos, como a glomerulonefrite pós-estreptocócica aguda. A glomerulonefrite pós-estreptocócica aguda é uma do ença causada por imunocomplexos bem conhecida. Seu início é observado algumas semanas após uma infecção por estrep tococos �-hemolíticos do grupo A, em particular da pele, e muitas vezes ocorre com infecções causadas por tipos nefri togênicos de estreptococos. Em geral, o nível de complemento mostra-se baixo, sugerindo uma reação antígeno-anticorpo com o consumo do complemento. São observados depósitos grumosos de imunoglobulina e do componente C3 do comple mento ao longo das membranas basais glomerulares coradas

por imunofluorescência, sugerindo a presença de complexos antígeno-anticorpo. É provável que os complexos antígeno es treptocócico anticorpo sejam filtrados pelos glomérulos, fixan do-se ao complemento, atraindo as células polimorfonucleares e dando início ao processo inflamatório que causa danos aos rms. *

Tipo IV: hipersensibilidade mediada por células (delayed-type hypersensibility [DTH], tardia) A hipersensibilidade mediada por células não é causada por anticorpos, mas constitui uma função dos linfócitos T especifi camente sensibilizados que ativam os macrófagos para causar uma resposta inflamatória. A resposta é tardia, ou seja, inicia se geralmente 2 a 3 dias após o contato com o antígeno, e com frequência dura vários dias.

A. Hipersensibilidade de contato É observada após sensibilização com substâncias químicas simples (p. ex., níquel, formaldeído), materiais vegetais (hera, carvalho venenoso), fármacos de uso tópico (p. ex., sulfonami das, neomicina), alguns cosméticos, sabões e outras substân cias. Em todos os casos, pequenas moléculas penetram na pele e, em seguida, atuando como haptenos, ligam-se a proteínas corporais que servem como antígeno completo. A hipersen sibilidade mediada por células é induzida particularmente na pele. Quando a pele entra novamente em contato com o agente agressor, o indivíduo sensibilizado desenvolve eritema, pruri do, vesículas, eczema ou necrose da pele em 12 a 48 h. O teste epicutâneo, realizado em uma pequena área da pele, às vezes pode identificar o agente agressor. As recidivas são prevenidas quando o indivíduo evita exposição subsequente ao material. A APC na sensibilidade de contato é provavelmente a célula de Langerhans na epiderme, que interage com células CD4 Thl inflamatórias que direcionam a resposta.

B. Hipersensibilidade do tipo tuberculínico A hipersensibilidade tardia a antígenos de microrganismos ocorre em muitas doenças infecciosas e tem sido utilizada co mo recurso auxiliar no estabelecimento do diagnóstico, aplica ção exemplificada pela reação tuberculínica. Quando se injeta uma pequena quantidade de tuberculina na epiderme de pa ciente previamente exposto ao Mycobacterium tuberculosis, ocorre pouca reação imediata; entretanto, aos poucos verifica se o aparecimento de endurecimento e rubor, que alcançam o pico em 24 a 72 h. As células mononucleares acumulam-se no tecido subcutâneo, e verifica-se a presença de quantidades abundantes de células CD4 Thl inflamatórias. O teste cutâneo positivo indica que o indivíduo já foi infectado pelo agente, mas não implica a presença de doença atual. Todavia, uma recente mudança da resposta ao teste cutâneo de negativa para positiva sugere infecção recente e possibilidade de atividade atual. A obtenção de resposta positiva ao teste cutâneo ajuda a estabelecer o diagnóstico. Por exemplo, na hanseníase um teste cutâneo positivo indica doença tuberculoide com imunidade celular ativa, enquanto um resultado negativo sugere hansení ase lepromatosa com fraca imunidade celular.

CAPÍTULO 8 Imunologia

DEFICIÊNCIASDARESPOSTAIMUNOLÓGICA Doenças por imunodeficiências As imunodeficiências podem ser divididas em duas categorias, as imunodeficiências primárias e as imunodeficiências secun dárias. As doenças por imunodeficiências primárias consistem em distúrbios do sistema imunológico, em que a falha é in trínseca às células que compõem esse sistema. Já, as doenças imunológicas secundárias consistem em distúrbios do sistema imune, em que a falha é induzida por fatores externos, como infecções virais, neoplasias e medicamentos. Essa seção é par ticularmente relevante para a microbiologia médica, pois essas doenças primárias são geralmente identificadas pelo tipo, du ração e frequência de doenças infecciosas apresentadas por um indivíduo. Em contraste, as doenças secundárias são frequen temente induzidas por microrganismos.

A. lmunodeficiências primárias As imunodeficiências primárias geralmente apresentam uma origem genética, em que mais de 150 anomalias já foram identi ficadas. Estes distúrbios resultam em perda numérica e funcio nal das células T, células B, fagócitos, componentes do sistema complemento, citocinas ou TLRs. Claramente, a perda desses elementos funcionais levam à suscetibilidade a infecções. Um exemplo é a doença granulomatosa crônica (CGD), na qual ocorre uma deficiência na função das células fagocitárias. Os indivíduos apresentam níveis normais de imunoglobulinas, células T, células B e também dos fagócitos. Contudo, as célu las fagocíticas não são capazes de destruir os microrganismos fagocitados, por um defeito genético no cromossomo b-558. Essa mutação leva a incapacidade metabólica dessas células em produzir peróxidos e superóxidos. Essa anomalia pode ser detectada pelo teste do nitroblue tetrazolium (NBT)*. Essas cé lulas são incapazes de matar certas bactérias ou fungos, como Staphylococcus, Escherichia coli e Aspergillus spp. Se não trata da, essa doença é, geralmente, fatal na primeira década de vida da criança. O IFN-ypode restaurar a função dessas células. As sim, na maioria dos casos, a administração desta citocina ou o transplante de medula óssea é tratamento efetivo para este dis túrbio. Outro exemplo é a imunodeficiência combinada grave (severe combined immunodeficiency [SCID]). Essa síndrome, na realidade, é a expressão final para diferentes distúrbios ge néticos, que levam tanto a comprometimento das funções das células T quanto das células B. Os indivíduos acometidos são extremamente suscetíveis a infecções por praticamente todos os tipos de microrganismos. Caso não tratado, os indivíduos morrem no primeiro ano de vida.

B. Deficiências secundárias As imunodeficiências secundárias são associadas a processos infecciosos, neoplasias e medicamentos. * N. de R.T. O teste do nitroblue tetrazoium l (NBT), embora seja um mé todo simples e econômico poucos laboratórios o realizam. Dependendo do operador, a ocorrência de falso-negativos pode acontecer. Em nos so meio, o NBT é indicado como teste de rastreamento para DGC por apresentar um menor custo. No entanto, existem relatos na literatura de pacientes com a doença e que apresentaram resultado do teste normal. Nesses casos, em pacientes com clínica bem sugestiva e NBT normal, é muito importante realizar o DHR.

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e. 1 nfecções Determinadas infecções podem causar imunossupressão no hospedeiro. É conhecido que o vírus do sarampo e o vírus Eps tein-Barr (EBV), da mononucleose, podem provocar redução da hipersensibilidade do tipo tardio (DTH) em testes cutâneos. A replicação do EBV pode revelar o possível mecanismo para essa imunossupressão. O EBV infecta as células B, resultando em uma célula transformada, que se prolifera indefinidamen te. Curiosamente, o genoma viral codifica para um análogo da IL-10 humana. A IL-10 é uma citocina imunossupressora que inibe o braço Thl, assim inibindo a produção de IFN-ye, con sequentemente, o resultado do teste cutâneo de DTH. Outro exemplo importante é a imunodeficiência induzida pelo vírus HIV, resultando na Aids. O vírus HIV, primariamente, infecta as células T CD4. O processo de infecção é possível, uma vez que o vírus usa a molécula de CD4 como receptor e o receptor de quimiocina CCR5, como correceptor para entrar na célula. A replicação viral resulta em uma progressiva destruição direta e indireta das células T CD4 e no desenvolvimento da Aids. Como consequência, na infecção, o paciente com HIV desen volve múltiplas infecções oportunistas. Como discutido neste capítulo, as células T CD4 são críticas na geração de subpopu lações Thl, Th2, Th17 e Treg. Essas células cooperam para a produção de anticorpos pelas células B e servem como fontes de IL2 e IFN-y. A replicação do vírus citotóxico é devastadora para o sistema imunológico.

D. Neoplasias Leucemias, linfomas, mioloma múltiplo e outros tipos de neo plasias podem levar a imunodeficiências e, consequentemente, ao aumento das infecções oportunistas. Por exemplo, pacien tes com leucemia podem apresentar deficiência em neutrófi los, resultando em perda da fagocitose e aumento das infecções bacterianas e fúngicas. Alguns tumores secretam altos níveis de TGF-�, que pode suprimir uma variedade de respostas, in cluindo as mediadas pelas células Thl.

E. Fármacos Fármacos citotóxicos usados no tratamento de neoplasias (p. ex., cisplatina), fármacos imunossupressores (p. ex., ciclosporina) usados em pacientes transplantados e os novos fármacos anti citocinas (anti-TNF-a.) usados no tratamento de doenças autoi munes, podem resultar em risco de infecções oportunistas.

LABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA CLÍNICA (TESTES DE DIAGNÓSTICO) Diversas descobertas da biologia molecular, do DNA recom binante e proteínas, da biologia das citocinas e da genética humana contribuíram enormemente para compreensão das doenças mediadas pelo sistema imunológico. Com esses avan ços, o laboratório de imunologia clínica se desenvolveu e au mentou sua importância no diagnóstico destes distúrbios. Assim, o laboratório de microbiologia clínica é importante nos transplantes, na reumatologia, na oncologia, na dermatologia, nas doenças infecciosas, nas alergias e nas imunodeficiências. O objetivo primordial do laboratório de imunologia clínica é

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fornecer testes laboratoriais que validem o diagnóstico clínico e monitorem os indivíduos com distúrbios imunológicos. Uma variedade de tecnologias é usada para avaliar tanto os anticor pos quanto os componentes celulares da resposta imune. Para uma revisão mais detalhada dos sistemas de testes imunológi cos realizados no ambiente hospitalar, ver Detrick et al. (2006). Alguns testes estão destacados adiante.

Ensaios de avaliação de anticorpos A. Ensaios imunoenzimáticos (enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa) O ensaio imunoenzimático possui muitas variações, que de pendem da conjugação de uma enzima com um anticorpo. A enzima é detectada pela determinação da atividade enzimática com seu substrato. Para medir o anticorpo, antígenos conhe cidos são fixados a uma fase sólida (p. ex., placa de plástico de microdiluição), incubados com diluições do anticorpo do tes te, lavados e novamente incubados com anti-imunoglobulina marcada com uma enzima (p. ex., peroxidase da "raiz forte" [horseradish]). A atividade enzimática, medida por adição do substrato específico e avaliação da reação colorimétrica, é uma função direta da quantidade de anticorpo ligado. Esse teste sorológico é usado para detectar anticorpos em diferen tes doenças infecciosas, tais como anticorpos contra proteínas do vírus HIV, em amostras de sangue ou anticorpos contra o Treponema pallidum, agente etiológico da sífilis. Esse sistema é igualmente usado na detecção de autoanticorpos presentes na circulação de indivíduos com doenças autoimunes sistêmicas, ou orgão específica (p. ex., anticorpos no lúpus eritematoso sis têmico, escleroderma ou síndrome de Sjogren). Variações dos testes imunoenzimáticos incluem algumas novas tecnologias, tais como ensaios quimioluminescentes (CIA) e ensaios multi plex baseados em partículas.

B. lmunofluorescência Os corantes fluorescentes (p. ex., fluoresceína, rodamina) po dem ser ligados de modo covalente a moléculas de anticorpo e visualizados por luz ultravioleta ao microscópio de fluores cência. Esse anticorpo marcado pode ser utilizado para a iden tificação de antígenos (p. ex., na superfície de bactérias, como estreptococos ou treponemas) ou de células em cortes histoló gicos ou outras amostras. Ocorre a reação de imunofluores cência direta quando o anticorpo marcado conhecido interage diretamente com um antígeno desconhecido. Ocorre a reação de imunofluorescência indireta quando se utiliza um processo em dois estágios (p. ex., um antígeno conhecido é fixado a uma lâmina, adiciona-se soro desconhecido, e a preparação é lava da). Se o anticorpo sérico desconhecido se combinar com o an tígeno, permanecerá fixado na lâmina, podendo ser detectado pela adição de anticorpo anti-imunoglobulina fluorescente ou outro reagente específico de anticorpo, como a proteína A de Staphylococcus ou a proteína G de Streptococcus, e examinado à microscopia de imunofluorescência. A imunofluorescência, historicamente, tem sido usada na detecção de anticorpos contra determinados microrganismos, além de ser um ensaio-padrão na detecção de autoanticorpos em doenças autoimunes (p. ex., anticorpos antinucleares).

C. lmmunoblotting Às vezes, denominado Western blotting, é um método desti nado a identificar um determinado antígeno em uma mistura complexa de proteínas. A mistura complexa de proteínas é sub metida à eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)-dodecil sulfato de sódio (SDS), procedimento que separa as proteínas de acordo com seu tamanho molecular. Em seguida, o gel é recoberto com uma membrana (frequentemente, uma folha de nitrocelulose) e as proteínas são "transferidas" por eletroforese para a membrana. A membrana de nitrocelulose (blot) adquire uma réplica das proteínas separadas por SDS-PAGE. Durante o processo de transferência, o SDS é removido em grande par te das proteínas e, pelo menos com algumas proteínas, ocorre novo rearranjo, sendo a configuração restaurada o suficien te para que os anticorpos possam reagir com as proteínas na membrana. Em seguida, a membrana de nitrocelulose reage com o an ticorpo marcado com enzima em um teste direto ou indireto com anticorpo, seguido de anti-imunoglobulina marcada. O antígeno proteico torna-se, então, visível em forma de uma fai xa na membrana. Nenhuma das outras proteínas na mistura é detectada. Essa técnica é utilizada, por exemplo, para se confir mar um teste de Elisa HIV-positivo, por demonstração da pre sença de anticorpos específicos, contra as proteínas do HIV, no soro do paciente (teste confirmatório, após os testes de ras treamento positivos). Essa técnica é amplamente usada como teste secundário para HVC e doença de Lyme. Recentemente, está também sendo aplicada na identificação de autoanticorpos em determinadas doenças autoimunes (p. ex., polimiosites). Variações dessa técnica incluem os ensaios de dot ou slot blot, ambos usando antígenos purificados.

D. Outros ensaios de laboratório Os testes disponíveis nos laboratórios de imunologia clínica incluem: a eletroforese de proteínas e a eletroforese de imu nofixação, que são importantes na identificação da produção anormal de imunoglobulinas no soro ou urina de pacientes com mieloma. A nefelometria é outro teste que quantifica uma grande variedade de analitos no soro ou plasma. Esse é o méto do de escolha, para quantificação dos componentes do sistema complemento, imunoglobulinas e outros analitos séricos. Es ses testes são usados para avaliar anomalias associadas a certas infecções (p. ex., o vírus HCV pode ser associado à proteína monoclonal e à presença de crioglobulinas).

Avaliação da resposta celular A. Citometria de fl uxo Outra aplicação das moléculas de anticorpos marcadas com corante fluorescente consiste em contagem e classificação das células por citometria de fluxo por meio de um separador de células ativado por fluorescência (FACS). A citometria de fluxo analisa uma suspensão de células que flui através de um conjunto de feixes de laser para medir a quantidade relativa de luz dispersa por partículas microscópicas (fornecendo, assim, uma informação sobre o tamanho relativo e a granulosidade) e a fluorescência relativa dessas partículas. Para uma mistura de leucócitos, é relativamente fácil separar

CAPÍTULO 8 Imunologia as células nessa mistura em suas principais classes (p. ex., linfó citos pequenos separados dos granulócitos, que são maiores e contêm mais grânulos [os quais dispersam mais lúmen] ). Com a disponibilidade de painéis de anticorpos monoclonais (que podem ser detectados por anti-imunoglobulinas fluorescentes) contra as proteínas da superfície celular, também é possível proceder à contagem de subpopulações de células (p. ex., cé lulas T auxiliares que expressam CD4 e células T citotóxicas que expressam CDS, ou células B que expressam anticorpos e células T). Essa tecnologia é amplamente utilizada em medici na clínica e na pesquisa biomédica (p. ex., para quantificar as células T CD4 em pacientes HIV-positivos ou distinguir célu las tumorais de leucócitos normais).

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B. Ensaios de funcionalidade celular Com a finalidade de avaliar a funcionalidade da célula T in vi tro, a sua habilidade de proliferação e a capacidade de produ ção de citocinas (como IFN-y) são analisadas. Esse teste é um análogo ao cutâneo para TB para avaliação da hipersensibilida de do tipo IV. Na pele, o antígeno de TB interage com células T específicas, que se proliferam e produzem IFN-y, resultando em reação positiva. No teste in vitro, leucócitos de sangue pe riférico (peripherical blood leukocytes [PBLs] ) são incubados com um antígeno específico (p. ex., antígenos de TB), por 24 a 72h. Quando células T interagem com esses PBLs se proli feram e produzem IFN-y. Essa proliferação pode ser medida pela incorporação de timidina H3, ou a produção de IFN-y po de ser monitorada por Elisa ou por citometria de fluxo. Esse teste é usado para avaliar a condição de um indivíduo, parti cularmente, em pacientes que são imunossuprimidos, como consequência de uma doença infecciosa, neoplasia ou terapia medicamentosa.

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RESUMO DO CAPÍTULO *

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Imunidade inata: é uma resposta imediata e não específica para um patógeno. Os componentes dessa resposta incluem fagócitos (macrófagos e neutrófilos), células NK, TLRs, ci tocinas e proteínas do sistema complemento. As funções protetoras dos fagócitos são: fagocitose (prima riamente, por macrófagos e PMNs) é o principal mecanis mo de detecção e de destruição de patógenos. Esse processo inclui as seguintes etapas: quimiotaxia, migração, ingestão e destruição microbiana. Imunidade adaptativa: pode ser mediada por anticorpos, por células ou por ambos. E uma resposta específica para um antígeno que a induziu e confere imunidade protetora,para uma nova reinfecção ou contato com o mesmo antígeno. Apresentação antigênica: é uma etapa crítica na resposta adaptativa. Proteínas a partir de antígenos exógenos são processadas por APCs e, então, apresentadas via molécu la de MHC classe II. Esse complexo antígeno-MHC é re conhecido pelo TCR expresso pela célula T CD4. O CD4 atua como correceptor. Um segundo sinal é necessário pa ra ativação das células T e, é derivado da interação entre a

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molécula CDSO, na superfície da APC com a molécula de CD2S na superfície da célula T. As células T, agora pro liferam e se diferenciam em células T efetoras. Antígenos endógenos são processados pela APC e apresentados via molécula de MHC classe 1. O complexo peptídeo-MHC classe 1 é reconhecido pelo TCR expresso na superfície das células T CDS. Produção de anticorpos: as células B rearranjam os genes que codificam para imunoglobulina e expressam o receptor para o antígeno (BCR). Quando o antígeno interage com o BCR, a célula B é estimulada, entra em divisão e forma um clone. A célula B se diferencia em plasmócitos secretores de anticorpos ou células B de memória. Funções dos anticorpos: os anticorpos melhoram a fago citose, induzem neutralização de vírus e de toxinas bacte rianas e participam de lise mediada por complemento e de ADCC. Funções das células T: (1) células T CD4 se diferenciam em Thl, Th2, Th17 e Treg. Thl produz citocinas (IL-2 e IFN-y), ativa macrófagos e induz mudança de classe para produção de IgG por células B. Th2 ativa mastócitos, eo sinófilos e induz a produção de IgE pelas células B. Th17 produz IL-17, que induz a produção de IL-8, resultando no recrutamento de neutrófilos e macrófagos. As células Treg produzem TGF-� e IL-10, que suprimem o sistema imune. (2) As células T CDS funcionam como células citotóxicas. Há três principais vias de ativação da cascata do comple mento. Cada uma dessas vias leva à formação do MAC, resultando em lise celular. O complemento promove prote ção contra patógenos por quatro mecanismos: (1) citólise, (2) quimiotaxia, (3) opsonização e (4) vasodilatação e per meabilidade celular. Citocinas são moléculas críticas do sistema imunológico, direcionando a resposta celular pelos macrófagos, PMNs, células NK, células T e células B. Os IFNs são potentes cito cinas antivirais e imunorregulatórias. Reações de hipersensibilidades: 0 Tipo 1, imediata: anticorpos IgE são induzidos pela presença do alérgeno e se ligam, pela sua fração Fc, a mastócitos e a eosinófilos. Após um segundo contato, esse mesmo antígeno se liga cruzadamente com as mo léculas de IgE na superfície das células sensibilizadas, resultando em sua degranulação e liberação de media dores químicos, especialmente a histamina. 0 Tipo II: os antígenos na superfície celular combinam com anticorpos, resultando em lise celular mediada por complemento (p. ex., reações de transfusão sanguínea), ou outras reações citotóxicas de membrana (p. ex., ane mia hemolítica autoimune) 0 Tipo Ili, imuno complexo: os complexos antígenos anticorpos são depositados nos tecidos, ativando o sistema complemento ou estimulando a migração de PMNs, resultando em dano tecidual. 0 Tipo IV, tardio: os linfócitos T sensibilizados por um antígeno liberam citocinas em um segundo contato com o mesmo antígeno. Essas citocinas induzem infla mação e ativam macrófagos.

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G LOSSÁ R I O Alelos: variantes de

um único /ocus genético. Anafilatoxinas: fragmentos de proteínas do complemento li berados durante a ativação (p. ex., CSa, C3a) resultam em aumento da permeabilidade vascular e atraem leucócitos. Anticorpo (Ac): proteína produzida em consequência da inte ração com um antígeno. A proteína tem a capacidade de combinar-se com o antígeno que estimulou sua produção. Os anticorpos são produzidos por plasmócitos. Anticorpos monoclonais: cada linfócito B produz um anticor po de especificidade exclusiva. Entretanto, as células B nor mais não crescem indefinidamente. Se for efetuada a fusão de células B, com uma célula de mieloma por hibridização celular somática e se forem selecionadas as células fundi das, que secretam anticorpos de especificidade desejada, será obtida uma linhagem celular imortalizada produtora de anticorpos, conhecida como hibridoma, e essas células híbridas produzirão anticorpos monoclonais. Antígeno (Ag): substância capaz de reagir com um anticorpo. Nem todos os antígenos podem induzir à produção de anti corpos; os que têm essa propriedade também são denomi nados imunógenos. Célula B (também denominada linfócito 8): as células B são linfócitos derivados da Bursa de Fabricius em aves, tendo como análogo a medula óssea humana. Essas células, por rearranjo de seus genes para imunoglobulina, expressam um único receptor para antígeno na superfície celular (BCR). As células B constituem os precursores dos plasmócitos que produzem anticorpos. Célula polimorfonuclear (PMN): também conhecida como neutrófilo ou granulócito, a célula PMN caracteriza-se por um núcleo multilobulado. Os PMN migram da circulação para o local de inflamação pelo processo da quimiotaxia e fagocitam bactérias e outras partículas. Célula T (também denominada linfócito T): célula derivada do timo, que participa de uma variedade de reações imuno lógicas mediadas por células. Célula T citotóxica: célula T capaz de matar outras células, como, por exemplo, células infectadas por patógenos intra celulares. Células destruidoras naturais (natural killer, NK): grandes células linfoides granulosas sem receptor específico do an tígeno conhecido. Estas células são capazes de reconhecer determinadas células anormais e matá-las,- como, por exemplo, células infectadas por vírus e tumorais, desempe nhando importante papel na resposta inata. Citólise: refere-se à lise das bactérias ou células, como células tumorais ou eritrócitos, pela inserção do complexo de ata que à membrana, derivado da ativação do complemento. Citocinas: potentes moléculas de baixo peso molecular produ zidas de forma transitória e local, por diferentes tipos celula res e, envolvidas em diversas funções na resposta imune.

Classe de imunoglobulinas: subdivisão das

moléculas de imu noglobulinas com base em diferenças estruturais (sequências de aminoácidos). Nos seres humanos, existem cinco classes de imunoglobulinas: lgG, lgM, lgA, lgE e lgD. Complemento: conjunto de proteínas plasmáticas que consti tui o principal mediador das reações antígeno-anticorpo. A ativação do complemento pode envolver as vias: clássica, alternativa e lectínica. Complexo de ataque à membrana: produto final da ativação da cascata do complemento, que contém CS, C6, C7, CB e C9. O complexo de ataque à membrana produz orifícios nas membranas das bactérias gram-negativas, destruindo-as, bem como nos eritrócitos e em outras células, resultando em lise. Complexo principal dehistocompatibilidade (MHC}: conjun to de genes localizados em estreita proximidade - como, por exemplo, no cromossomo 6 humano, que codificam os antígenos de histocompatibilidade (moléculas MHC). Endotoxinas: toxinas bacterianas liberadas de células lesiona das (LPS). Epítopo: local de um antígeno reconhecido por um anticorpo. Também conhecido como determinante antigênico. Hapteno: molécula que não é imunogênica em si, mas que pode reagir com anticorpo específico após ser adicionada a uma molécula carreadora. Histocompatível: que compartilha antígenos do complexo principal de histocompatibilidade (transplantes). Imunidade:

defesa do hospedeiro inespecífica não adquirida, mediante contato com um antígeno, como as barreiras representadas pela pele e pelas mucosas contra os antígenos infecciosos, além de uma variedade de fatores imunológicos inespecíficos (p. ex., células fagocíticas, célu las NK, complemento, TLRs e citocinas). Imunidade adaptativa: proteção adquirida pela introdu ção deliberada de um antígeno em um hospedeiro respon sivo. A imunidade ativa é específica e mediada por anticor pos ou células linfoides (ou por ambos). Imunidade humoral: relacionada com a imunidade em um lí quido orgânico e utilizada para referir-se à imunidade me diada por anticorpos. Imunidade mediada por células (celular}: aquela em que pre domina a participação dos linfócitos e macrócitos. lmunida de mediada por células é uma expressão, geralmente, apli cada à reação de hipersensibilidade do tipo IV (ver adiante). lmunoglobulina: glicoproteína constituída pelas cadeias H e L, que atua como anticorpo. Todos os anticorpos são imuno globulinas, mas nem todas as imunoglobulinas exercem a função de anticorpo. Inflamação: acúmulo local de líquido e células após lesão ou infecção. *

Imunidade inata:

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* Modificado e reproduzido, com autorização, de Stites DP, Stobo JD, Wells JV (editors.): Basic & Clinica/ lmmunology, 6th ed. Originalmente, publicado por, Appleton & Lange. Copyright© 1 987 de The McGraw-Hill Companies, lnc.

CAPÍTULO 8 Imunologia

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G LO S SÁ R I O (continuação)

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grupo heterogêneo de proteínas de baixo peso molecular pertencente à família das citocinas. Há dois prin cipais tipos de IFNs: Os IFNs do tipo 1 (a e B) elaborados por células infectadas do hospedeiro, que protegem as células não infectadas da infecção virai. O IFN do tipo li (IFN-y), que é produzido por células T e NK ativadas. Essas moléculas desempenham papel importante em atividades antivirais, imunorregulatórias e antiproliferativas. Leucócito: termo genérico que se refere a uma célula branca do sangue. Linfócito: célula mononuclear de 7 a 12 µm de diâmetro, con tendo um núcleo com cromatina densamente agrupada e uma faixa de citoplasma. Os linfócitos incluem as células T e B, que desempenham papéis primários na imunidade. Macrófago: célula mononuclear fagocítica derivada de monó citos da medula óssea e encontrada em tecidos e no local de inflamação. Os macrófagos desempenham funções acessó rias na imunidade, particularmente, como células apresen tadoras de antígenos (APCs). Moléculas de adesão celular (CAMs): por exemplo, as integri nas e selectinas. São moléculas que medeiam a ligação de células a outras células ou a moléculas da matriz extracelu lar, como a fibronectina. Monócito: célula sanguínea fagocítica circulante que se desen volve em macrófagos teciduais. Opsonina: substância capaz de aumentar a fagocitose. Os anti corpos e o complemento são as duas principais opsoninas. Opsonização: revestimento de um antígeno ou de uma partí cula (p. ex., agente infeccioso) por substâncias como anti corpos, componentes do complemento, fibronectina, etc., que facilitam a captação da partícula externa por uma cé lula fagocítica. Plasmócito: célula B de diferenciação terminal, que secreta an ticorpos. Quimiocinas: proteínas de baixo peso molecular que estimu lam o movimento dos leucócitos. Quimiotaxia: processo pelo qual as células fagocíticas são atra ídas para a vizinhança dos patógenos invasores. lnterferons:

QUESTÕES DE REVISÃO 1. Qual das seguintes alternativas é uma característica da resposta imunológica adaptativa e não da resposta inata? (A) (B) (C) (D) (E)

Barreiras físicas Barreiras químicas Expansão clonal das células efetoras Mediadores inflamatórios Fagocitose

2. Que mecanismo genético aumenta o número de moléculas de anticorpos diferentes durante a resposta imunológica sem au mentar a diversidade do pool de receptores de antígenos espe cíficos? (A) Recombinação do segmento do gene V (B) Mudança de classe

Reações de hipersensibilidade:

(1) Hipersensibilidade mediada por anticorpos *

*

*

Tipo 1. Imediata:

o anticorpo lgE é induzido pelo alergê nio e liga-se, através de seu receptor Fc, aos mastócitos e eosinófilos. Ao entrar novamente em contato com o antíge no, a lgE fixada estabelece ligações cruzadas, induzindo à desgranulação e liberação de mediadores, particularmente a histamina. Tipo li: Os antígenos presentes em uma superfície celular combinam-se com anticorpos, resultando em lise mediada pelo complemento (p. ex., reações transfusionais ou ao Rh), ou outra lesão citotóxica da membrana (p. ex., anemia he molítica autoimune). Tipo 111. lmunocomplexos: os imunocomplexos de antíge no-anticorpo depositam-se nos tecidos, o complemento é ativado e as células polimorfonucleares são atraídas para o local, provocando lesão tecidual.

(2) Hipersensibilidade mediada por células

os linfócitos T, sensibilizados por um an tígeno, liberam citocinas por ocasião do segundo contato com o mesmo antígeno. As citocinas induzem à inflamação e ativam os macrófagos. Receptores do tipo Toll (TLRs): Compreendem uma família de receptores de reconhecimento de padrões evolucional mente conservados em microrganismos e servem como a primeira linha de defesa na imunidade inata. Resposta imunológica: desenvolvimento de resistência (imu nidade) a uma substância estranha (p. ex., agente infeccio so). Pode ser mediada por anticorpos (humoral), células (ce lular) ou ambos. Subclasse de imunoglobulinas: subdivisão das classes de imunoglobulinas baseada em diferenças estruturais nas ca deias H. Para a lgG humana existem quatro subclasses: lgGl, lgG2, lgG3 e lgG4. Timócitos: células T em desenvolvimento encontradas no timo. Vacinação: indução de imunidade por meio da inoculação de uma forma atenuada ou morta de um patógeno. *

Tipo IV. Tardia:

(C) Hipermutação somática (D) Variabilidade juncional decorrente da junção imprecisa de V, D e J (E) Duplicação génica, isto é, inúmeros segmentos génicos de V, D eJ 3. Qual a principal função das moléculas MHC das classes I e II? (A) Elas são mediadoras da resposta da célula B, de forma inde pendente da célula T (B) Ligam peptídeos antigénicos para a apresentação aos recep tores específicos do antígeno nas células B (C) Auxiliam na endocitose de antígenos por células fagocíticas (D) Ligam-se diretamente aos antígenos dos carboidratos para apresentação nas células T (E) Apresentam peptídeos antigénicos para revisão por recepto res específicos do antígeno em células

148

SEÇÃO li Imunologia

4. As moléculas MHC da classe I necessitam ligar-se a peptídeos antigênicos para moldá-los corretamente e serem expressos na superfície da célula. Qual seria o problema de saúde mais comum em uma criança que tenha um defeito na função do transporta dor de peptídeo (TAP) encontrado no retículo endoplasmático? (A) (B) (C) (D) (E)

Infecções crônicas virais do trato respiratório superior Infecções por parasitos Infecções por bactérias encapsuladas Alergias a cães domésticos Doença autoimune

5. Qual das classes de anticorpos tem a capacidade de atravessar a placenta? (A) (B) (C) (D) (E)

IgG IgA IgM IgE IgD

6. Um homem de aproximadamente 20 anos de idade, que se en contra em um quarto de enfermaria de emergência, apresenta respiração curta e fadiga. Também está bastante pálido. Dois dias atrás, recebeu uma injeção de penicilina, para combater uma infecção. Ele já havia recebido penicilina antes sem proble mas, tendo-se constatado que não tinha "alergia" a penicilina. Os testes laboratoriais mostraram que apresentava anticorpos con tra a penicilina no soro e uma baixa na contagem de leucócitos. Foi diagnosticada anemia hemolítica imune. Que tipo de reação de hipersensibilidade esse paciente está sofrendo? (A) (B) (C) (D)

Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV (DTH)

7. Qual dos seguintes tipos de célula expressam receptores para a IgE em sua superfície celular que estimula a célula a montar uma resposta aos parasitos, tais como vermes? (A) (B) (C) (D) (E)

Células T Células B Pró-monócitos Células NK Mastócitos

8. Qual teste imunológico é amplamente empregado para enume rar precisamente e coletar células expressando um antígeno li gado por anticorpo monoclonal fluorescente? (A) (B) (C) (D) (E)

Elisa Imunofluorescência direta

Western blotting

Idênticas entre si, exceto em seus determinantes antigênicos Idênticas entre si Idênticas entre si, exceto em suas regiões hipervariáveis De sequências semelhantes mas com diferentes aminoácidos Idênticas entre si, exceto em seu domínio estrutural total

10. Os complexos antígeno-anticorpo são fagocitados mais efetiva mente na presença de qual componente do complemento? (A) (B) (C) (D) (E)

(A) (B) (C) (D) (E)

Moléculas MHC da classe I Moléculas MHC da classe II Moléculas de adesão em células Moléculas de glicofosfolipídeos Moléculas CD40

12. A célula que exerce um papel crítico na resposta imune inata, e mata células infectadas por vírus é: (A) (B) (C) (D) (E)

Célula T Neutrófilo Célula NK Macrófago Célula B

13. A citocina que ativa células, para expressar MHC classe II e pro teger as células da infecção viral é: (A) (B) (C) (D) (E)

IFN-a IL-6 IFN-y TNF-a IL-10

14. Qual o tipo de reação de hipersensibilidade resulta na liberação de histamina mediada por IgE? (A) (B) (C) (D)

Tipo 1 Tipo 2 Tipo 3 Tipo 4

15. A interação de uma molécula antigênica de um patógeno com seu TLR específico resulta em: (A) (B) (C) (D) (E)

Apresentação do antígeno à células T auxiliares Ativação celular e produção de citocinas e quimiocinas Produção de IgG Troca de classe da imunoglobulina Fagocitose

Respostas

C3ae CSa C3b Complexo C56789 MBL Properdina

c

1. e

5. A

9. B

2. B

6. B

10. B

14. A

3. E

7. E

11. A

15. B

4. A

8. D

12.

Separador de células ativado por fluorescência (FACS) Imunofluorescência indireta

9. Em qualquer molécula de imunoglobulina, as cadeias leves são (A) (B) (C) (D) (E)

11. As células NK expressam um receptor destruidor semelhante à imunoglobulina que reconhece:

13.

c

REFERÊNCIAS Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S: Cellular and Molecular Immuno logy, 7th ed. Saunders Elsevier, 2012. Detrick B, Hamilton RG, Folds JD: Manual ofMolecular and Clinicai Laboratory Immunology, 7th ed. ASM Press, 2006. Murphy K, Travers P, Wolport M: Janeway's Immunobiology, 8th ed. Garland Science, 2011. Nairn R, Helbert M: ImmunologyforMedical Students, 2nd ed. Mosby/ Elsevier, 2007. O'Gorman MRG, Donnenberg AD: Handbook of Human Immuno logy, 2nd ed. CRC Press, 2008. Paul WE (editor): Fundamental Immunology, 6th ed. Wolters Kluwer/ Lippincott Williams & Wilkins, 2008.

C A P Í T U L O

Patogênese da infecção bacteriana

A patogênese da infecção bacteriana abrange o início do pro cesso infeccioso e os mecanismos que levam ao aparecimento dos sinais e sintomas da doença. Os fatores bioquímicos estru turais e genéticos que desempenham um papel importante na patogênese bacteriana são discutidos neste capítulo e podem ser revistos nos capítulos específicos para cada microrganismo. As bactérias patogênicas caracterizam-se por sua capacidade de disseminação, aderência e persistência, bem como invasão de células e tecidos do hospedeiro, toxigenicidade e capacidade de escapar ou sobreviver ao sistema imunológico do hospedeiro. A resistência a antimicrobianos e a desinfetantes também pode

contribuir para virulência ou para capacidade do microrganis mo em causar doença. Muitas infecções causadas por bactérias geralmente tidas como patógenos são inaparentes ou assintomá ticas. Ocorrerá doença se as bactérias ou reações imunológicas à sua presença prejudicarem o hospedeiro. Os termos frequentemente empregados para descrever os aspectos da patogênese estão definidos no Glossário (ver adiante). No Glossário do Capítulo 8, encontram-se as defini ções dos termos utilizados em imunologia bem como os em pregados para descrever aspectos da resposta do hospedeiro à infecção.

G LO S SÁ R I O processo pelo qual as bactérias se fixam à superfície das células do hospedeiro. Após as bac térias terem penetrado no organismo, a aderência constitui uma etapa inicial importante no processo de infecção. Os termos aderência, adesão e fixação frequentemente são uti lizados como sinônimos. Infecção: multiplicação de um agente infeccioso no corpo. A multiplicação das bactérias que fazem parte da microbiota normal do trato gastrintestinal, da pele e assim por diante, geralmente não é considerada uma infecção. Já a multipli cação de bactérias patogênicas (p. ex., espécies de Salmo nel/a) - mesmo quando o indivíduo se mostra assintomáti co - é tida como uma infecção. Invasão: processo pelo qual bactérias, parasites animais, fun gos e vírus penetram nas células ou nos tecidos do hospe deiro e disseminam-se pelo corpo.

Aderência {adesão, fixação):

microrganismos que colonizam diferentes sítios de indivíduos saudáveis. Não patógeno: microrganismo que não provoca doença; pode fazer parte da microbiota normal. Patogenicidade: capacidade que um agente infeccioso tem de provocar doença. (Ver também Virulência.) Patógeno: microrganismo capaz de causar doença. Patógeno oportunista: agente capaz de provocar doença apenas quando a resistência do hospedeiro está compro metida (i. e., quando o paciente se encontra "imunocompro metido"). Portador: indivíduo ou animal com infecção assintomática, que pode ser transmitida a outro indivíduo ou animal sus cetível. Superantígenos: toxinas que ativam o sistema imunológico se ligando diretamente à cadeia � do complexo de histoMicrobiota:

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SEÇÃO Ili Bacteriologia

compatibilidade principal (MHC) e ao receptor de linfócito T (T ce// receptor, TCR), assim resultando em intensa ativação policlonal de células T e na produção maciça de citocinas. Toxigenicidade: capacidade que um microrganismo tem de produzir uma toxina que contribui para o desenvolvimento de doença.

IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS QUE CAUSAM DOENÇA Os seres humanos e os animais possuem uma microbiota normal abundante que habitualmente não provoca doença (Cap. 10), mas que atinge o equilíbrio com o hospedeiro, ga rantindo a sobrevivência, o crescimento e a propagação não apenas das bactérias, mas também do hospedeiro. Algumas bactérias que constituem importantes causas de doença cres cem comumente com a microbiota normal (p. ex., Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus). Algumas vezes, verifica-se a presença de bactérias nitidamente patogênicas (p. ex., Salmo nella typhi), porém a infecção permanece latente ou subclínica, de modo que o hospedeiro é um "portador" das bactérias. Pode ser difícil mostrar que determinada espécie bacteria na constitui a causa de uma doença específica. Em 1884, Robert Koch propôs uma série de postulados que foram amplamente aplicados para correlacionar muitas espécies bacterianas espe cíficas com determinadas doenças. Os postulados de Koch es tão resumidos no Quadro 9 .1.

QUADR0 9.1

capacidade quantitativa de um agente provocar doença. Os agentes virulentos causam doença quando in troduzidos no hospedeiro em pequeno número. A virulên cia envolve aderência, persistência, invasão e toxigenicida de (ver anteriormente).

Virulência:

Os postulados de Koch continuam sendo uma base essen cial da microbiologia; no entanto, desde o fim do século XIX, constatou-se que muitos microrganismos que não preenchem os critérios dos postulados de Koch também provocam do ença. Assim, por exemplo, o Treponema pallidum (sífilis) e o Mycobacterium leprae (hanseníase) não podem ser cultivados in vitro; entretanto, existem modelos de infecção em animais com esses agentes. Outro exemplo é a Neisseria gonorrhoeae (gonorreia), para a qual não há modelo de infecção em ani mais, embora possa ser facilmente cultivada in vitro, tendo si do produzidas infecções experimentais em seres humanos que substituem o modelo animal. Em outros casos, os postulados de Koch foram satisfei tos, pelo menos em parte, ao se demonstrar a patogenicidade bacteriana em um modelo de infecção in vitro, em vez de um modelo em animal. Por exemplo, algumas formas de diarreia induzida por Escherichia coli (Cap. 15) foram defmidas pela in teração dessa bactéria com células do hospedeiro em cultura. As respostas imunológicas do hospedeiro também devem ser consideradas quando se investiga a presença de determinado

Regras para o estabelecimento das causas das doenças infecciosas

Postulados de Koch

Postulados de Koch moleculares

1 . O microrganismo deve ser encontrado em todos os casos da doença em questão e sua distribuição no corpo deve estar em concordância com as lesões observadas

1 . O fenótipo ou propriedade sob investigação deve estar significativamente associado a cepas patogênicas de uma espécie e não a cepas não patogênicas

2. O microrganismo deve crescer em cultura pura in vitro (ou fora do corpo do hospedeiro) por diversas gerações

2. A inativação específica de um gene ou genes associados à virulência deve levar a uma diminuição mensurável da patogenicidade ou da virulência

3. Quando tal cultura pura for inoculada em um animal suscetível, deverá resultar no surgimento da doença típica 4. O microrganismo deve ser novamente isolado de lesões que produziram doença no modelo experimental

3. Reversão ou substituição de um gene mutado com um gene selvagem deve levar a restauração da patogenicidade ou virulência

Regras moleculares para o estabelecimento da relação micróbio-doença

1 . A sequência de ácidos nucleicos de um patógeno putativo deve estar presente na maior parte dos casos de uma doença infecciosa e preferencialmente em locais anatômicos onde o patógeno é evidente 2. A sequência de ácidos nucleicos de um patógeno putativo deve estar ausente na maior parte dos controles saudáveis. Se a sequência for detectada em controles saudáveis, ela deve estar presente com baixa prevalência quando comparada com o número de pacientes que têm a doença, e em um baixo número de cópias 3. O número de cópias de uma sequência de ácidos nucleicos associados a um patógeno deve diminuir ou tornar-se não detectável com a resolução da doença (p. ex., com um tratamento eficaz) e deve aumentar em casos de recidiva ou recorrência da doença 4. A presença de uma sequência de ácidos nucleicos associada a um patógeno em indivíduos sadios deve ajudar a prever o desenvolvimento subsequente da doença 5. A natureza do patógeno inferido a partir da análise da sequência de ácidos nucleicos deve ser condizente com as características biológicas conhecidas dos organismos relacionados com a natureza da doença. A importância de uma sequência microbiana detectada está aumentada quando o genótipo microbiano prevê a morfologia e a patologia microbianas, as características clínicas da doença e a resposta do hospedeiro

CAPÍTULO 9 Patogênese da infecção bacteriana microrganismo como possível causa de uma doença. Por con seguinte, a ocorrência de elevação nos títulos de anticorpos específicos durante a recuperação da doença constitui um im portante auxiliar dos postulados de Koch. A moderna genética microbiana abriu novas fronteiras pa ra o estudo das bactérias patogênicas e sua diferenciação das não patogênicas. A clonagem molecular possibilitou aos pes quisadores isolar e modificar genes de virulência específicos, estudando-os em modelos de infecção. A capacidade de estu dar genes associados à virulência levou à proposição dos pos tulados moleculares de Koch, resumidos no Quadro 9 .1. O crescimento de alguns patógenos em cultura é difícil ou mesmo impossível, e por esse motivo não é possível estabelecer a causa das doenças a eles associadas com base nos postulados de Koch ou nos postulados moleculares de Koch. Utiliza-se a reação em cadeia da polimerase para amplificar as sequências de ácidos nucleicos específicas do microrganismo isoladas de tecidos ou líquidos do hospedeiro, empregadas para a identi ficação dos microrganismos infectantes. As diretrizes molecu lares para o estabelecimento da causa da doença microbiana estão relacionadas no Quadro 9.1. Essa abordagem foi utilizada para o estabelecimento das causas de várias doenças, como a doença de Whipple (Tropheryma whipplei), angiomatose baci lar (Bartonella henselae), erliquiose monocítica humana (Ehr lichia chaffeensis), síndrome pulmonar por hanta-vírus (vírus Sin Nombre) e sarcoma de Kaposi (herpes-vírus humano 8). A análise da infecção e da doença mediante a aplicação de certos princípios, como os postulados de Koch, leva à classifi cação das bactérias como patógenos, patógenos oportunistas e não patógenos. Algumas espécies bacterianas são sempre con sideradas patogênicas, e sua presença é anormal. Como exem plos podemos citar o Mycobacterium tuberculosis (tuberculose) e Yersinia pestis (peste), bactérias que satisfazem facilmente os critérios dos postulados de Koch. Outras espécies fazem parte comumente da microbiota normal de seres humanos (e ani mais), mas também podem, com frequência, causar doença. Assim, por exemplo, a E. coli pertence à microbiota gastrintes tinal dos seres humanos sadios, mas também representa uma causa comum das infecções do trato urinário, diarreia do via jante e outras doenças. As cepas da E. coli que provocam doença são diferençadas daquelas que não o fazem pela determinação ( 1) da existência ou não de virulência em animais e modelos de infecção in vitro, bem como (2) da constituição genética significativamente associada à produção da doença. Outras bactérias (p. ex., espécies de Pseudomonas, Stenotrophomonas maltophilia e muitas leveduras e bolores) só provocam doença em indivíduos imunodeprimidos ou debilitados, e constituem patógenos oportunistas.

TRANSMISSÃO DA INFECÇÃO As bactérias (e outros microrganismos) podem se adaptar a uma variedade de ambientes que incluem fontes externas co mo: solo, água e matéria orgânica ou em ambientes internos encontrados nos insetos vetores, animais e em seres humanos, onde normalmente habitam e subsistem. Assim, dotadas des sa capacidade, as bactérias asseguram sua sobrevida e aumen tam a possibilidade de transmissão. Ao produzirem infecção assintomática ou doença leve, em vez de levarem à morte do

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hospedeiro, os microrganismos que normalmente habitam em seres humanos aumentam a possibilidade de transmissão de uma pessoa para outra. Algumas bactérias que costumam provocar doença em se res humanos habitam principalmente em animais e infectam incidentalmente os seres humanos. Por exemplo, as espécies de Salmonella e Campylobacter infectam os animais, sendo trans mitidas aos seres humanos através de produtos alimentares. Outras bactérias produzem infecções de modo inadvertido em seres humanos, constituindo um erro no ciclo de vida normal do microrganismo; nesses casos, os microrganismos não se adaptam aos seres humanos, e a doença que provocam pode ser grave. Por exemplo, a Y. pestis (peste) tem um ciclo de vida bem estabelecido em roedores e pulgas de roedores, e a trans missão pelas pulgas a seres humanos é inadvertida; o Bacillus anthracis (antraz) é encontrado no meio ambiente, infecta oca sionalmente animais e é transmitido aos seres humanos por certos produtos de animais infectados, como pelos. As espé cies de Clostridium são onipresentes no meio ambiente, e são transmitidas aos seres humanos por ingestão (p. ex., gastrente rite por e. perfringens e e. botulinum [botulismo] ), ou quando ocorre contaminação de feridas pelo solo (p. ex., C. perfringens [gangrena gasosa] e C. tetani [tétano]). Tanto Bacillus anthra cis quanto as espécies de Clostridium formam esporos que pro tegem o ácido nucleico de diferentes fatores ambientais hostis como radiação ultravioleta, dessecação, detergentes químicos e alterações de pH. Esses esporos asseguram a sobrevivência do material genético em ambientes externos incluindo os ali mentos ingeridos pelo ser humano, que após sua ingestão ou inoculação germinam retornando ao estado vegetativo meta bolicamente ativo do patógeno. As manifestações clínicas das doenças (p. ex., diarreia, tosse, corrimento vaginal) causadas por microrganismos fre quentemente promovem a transmissão dos agentes. A seguir são apresentados alguns exemplos de síndromes clínicas e o modo pelo qual aumentam a transmissão das bactérias pato gênicas: o Vibrio cholerae pode causar diarreia volumosa, que pode contaminar a água do mar e a água doce; por conseguinte, tanto a água potável quanto os frutos do mar, como ostras e caranguejos, podem ser contaminados; a ingestão de água ou frutos do mar contaminados pode provocar infecção e doença. De modo semelhante, a contaminação dos alimentos com água de esgoto que contenha E. coli, que causa diarreia, resulta em transmissão da bactéria. O M. tuberculosis (tuberculose) infec ta naturalmente apenas os seres humanos, provocando doença respiratória com tosse e produção de perdigotos, o que resulta em transmissão da bactéria de uma pessoa para outra. Muitas bactérias são transmitidas de uma pessoa para outra por meio das mãos. Uma pessoa portadora de S. aureus na parte anterior das narinas pode esfregar o nariz, contaminar as mãos com os estafilococos e disseminá-los para outras partes do corpo ou para outra pessoa, resultando em infecção. Muitos patógenos oportunistas que provocam infecções hospitalares são transmi tidos de um paciente para outro por meio das mãos de membros da equipe hospitalar. Por conseguinte, a lavagem das mãos cons titui um importante componente no controle das infecções. As mais frequentes portas de entrada das bactérias pato gênicas são os locais do corpo nos quais as mucosas entram em contato com a pele: vias respiratórias (superiores e inferiores), trato gastrintestinal (principalmente a boca), trato genital e

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SEÇÃO Ili Bacteriologia

vias urinárias. As áreas anormais das mucosas e da pele (p. ex., cortes, queimaduras e outras lesões) também são portas de en trada frequentes. A pele e as membranas mucosas constituem o mecanismo de defesa primária contra a infecção. Para causar doença, os patógenos precisam vencer essas barreiras.

O PROCESSO INFECCIOSO No corpo, as bactérias que causam doenças têm de se aderir às células do hospedeiro, geralmente às células epiteliais. Estabele cido um local primário de infecção, as bactérias multiplicam-se e disseminam-se diretamente, através dos tecidos ou do sistema linfático, para a corrente sanguínea. Essa infecção (bacteriemia) pode ser transitória ou persistente, e permite que as bactérias se propaguem amplamente pelo corpo até alcançarem os tecidos particularmente apropriados para a sua multiplicação. A pneumonia pneumocócica fornece um exemplo do pro cesso infeccioso. O S. pneumoniae pode ser cultivado a partir de material da nasofaringe de 5 a 40% dos indivíduos sadios. Em certas ocasiões, os pneumococos da nasofaringe são aspi rados para os pulmões, o que é mais comum nos indivíduos debilitados ou em determinadas situações, como, por exem plo, o coma, quando os reflexos normais da tosse e do vômito encontram-se diminuídos. Verifica-se o desenvolvimento de infecção nas vias respiratórias terminais dos pulmões de in divíduos que não produzem anticorpos protetores contra o antígeno capsular pneumocócico. A multiplicação dos pneu mococos e a consequente inflamação resultam em pneumonia. Os pneumococos penetram nos vasos linfáticos dos pulmões e dirigem-se para a corrente sanguínea. Entre 10 e 20% dos in divíduos com pneumonia pneumocócica apresentam bacterie mia por ocasião do diagnóstico de pneumonia. Quando ocorre bacteriemia, os pneumococos podem disseminar-se para locais secundários de infecção (p. ex., líquido cerebrospinal, valvas cardíacas, espaços articulares). As principais complicações da pneumonia pneumocócica consistem em meningite, artrite séptica e raramente endocardites. O processo infeccioso no cólera envolve a ingestão de V. cholerae, atração quimiotática das bactérias para o epitélio in testinal, motilidade das bactérias por meio de um único flagelo polar e penetração na camada mucosa da superfície intestinal. A aderência do V. cholerae à superfície das células epiteliais é me diada por pili e, possivelmente, por outras adesinas. A produção da toxina colérica resulta em fluxo de cloreto e água no lúmen intestinal, provocando diarreia e desequilíbrio eletrolítico.

clonais. Para a maioria dos patógenos, existem apenas um ou alguns tipos clonais que se disseminam no mundo durante certo período. Por exemplo, a meningite meningocócica epi dêmica do sorogrupo A ocorre na Ásia, no Oriente Médio e na África, e, em certas ocasiões, propaga-se para a Europa Se tentrional e para as Américas. Em várias ocasiões, ao longo de várias décadas, observou-se o aparecimento de tipos clonais isolados da Neisseria meningitidis do sorogrupo A em uma região geográfica e, posteriormente, em outras regiões, resul tando em doença epidêmica. Existem muitos tipos do Haemo philus influenzae, mas apenas o clone do H. influenzae tipo b costuma estar associado à ocorrência de doença*. Existem dois tipos clonais da Bordetella pertussis, ambos associados a doen ça. De modo semelhante, a S. Typhi (causadora da febre tifoi de) possui dois tipos clonais. Entretanto, há mecanismos que a bactéria utiliza, ou que foram usados há muito tempo, para transmitir genes de virulência de uma para outra.

Elementos genéticos móveis Os mecanismos primários de troca de informação genética entre bactérias incluem a transformação natural e a trans missão de elementos genéticos móveis tais como plasmídeos, transpósons e bacteriófagos (frequentemente referidos como "fagos"). A transformação ocorre quando o DNA de um or ganismo é liberado para o ambiente e incorporado por um organismo diferente capaz de reconhecer e de se ligar a esse DNA. Em outros casos, os genes que codificam muitos fa tores de virulência bacteriana são carreados por plasmídeos ou fagos. Plasmídeos são estruturas extracromossomiais que apresentam capacidade de autorreplicação e transpósons são segmentos de DNA que podem se mover de um ponto para outro na fita de DNA. Esses dois fenômenos podem resul tar em recombinação entre o DNA extracromossômico e o cromossômico (recombinação ilegítima ou não homóloga; Cap. 7). Se essa recombinação se verifica, os genes que co dificam os fatores de virulência podem tornar-se cromos sômicos. Finalmente, vírus bacterianos ou fagos são outros mecanismos pelos quais o DNA pode ser transferido de um organismo para outro. A transferência desses elementos ge néticos entre membros de uma mesma espécie ou, menos comumente, interespécies pode resultar em transferência de fatores de virulência, incluindo genes de resistência a antimi crobianos. Alguns exemplos de fatores de virulência codifica dos em fagos ou plasmídeos estão no Quadro 9.2.

Ilhas de patogenicidade

A GENÔMICA E A PATOGENICIDADE BACTERIANA

Grandes grupos de genes associados à patogenicidade e locali zados no cromossomo bacteriano são chamados de ilhas de pa togenicidade (PAI pathogenicity islands). Existem grandes grupos de genes organizados, com tamanho entre 10 e 200 kb. As principais propriedades das PAI são as seguintes: possuem um ou mais genes de vi

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Tradução Cláudio M. Rocha-de-Souza Pesquisador visitante do Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos Bio-Manguinhos - FIOCRUZ. Doutor em Microbiologia Médica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Revisão técnica desta edição José Procópio Moreno Senna Pesquisador da vice-diretoria de desenvolvimento tecnológico do Instituto de Tecnologia de Imunobiológicos Bio-Manguinhos - FIOCRUZ.