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2° PASSO

– CORRIDA DE ELETROFORESE

-Colocar  tampão  TBE  1x  na  cuba  de  eletroforese  (aproximadamente  1 litro).

-Preparar  papel  parafilme  e  adicionar  2

μL do corante em relação a quantidade da amostra.
-Adicionar  10μL  da  amostra no  corante e  transferir  para  cada  um  dos poços no gel.

-Adapta o  eletrodo  (vermelho positivo  deve  ficar  para  onde  o  gel  vai

correr).

-Ligue  a  voltagem:

iniciando  em  80V  e  depois  que  iniciar  a  corrida  subir para 100V, corrida por aproximadamente 45 minutos.

-visualizar gel em transluminador.

# data[].attributes.body
1° PASSO

– PREPARO DO GEL DE AGAROSE

Pesar  3g  de  agarose, adicionar  150mL de  TBE  1X  e  levar  ao  microondas,

colocando  pequenos  intervalos  de  tempo  para  que  o  gel  não  ferva  e

transborde  do  erlenmeyer,  até  que  se  obtenha  um  líquido  totalmente translúcido. Aguardar até que esfrie um pouco e pipetar 15 μL de Brometo

de etídio, homogeneizar, despejar na base para moldagem do gel e inserir os pentes. Aguardar até que o gel se solidifique para remover os pentes e inserir a bandeja na cuba de eletroforese.

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-Reagentes de maior volume devem ser pipetados primeiro.

-Mix deve ficar em banho de gelo.

-Taq polimerase é a última a ser pipetada e a última a ser retirada da geladeira, pois é

degrada pelo calor.

-Após pipetagem do volume total do mix, dividir nos eppendor

fs 0,2mL e pipetar 3uL de DNA.

-Identificar os tubos.

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Procedimentos

•Assepsia do local de trabalho;

•Amostras de DNA que serão amplificadas devem ficar em banho

-maria 56°C 30’ ou 37°C 60’.

•Fazer os cálculos de cada volume dos reagentes necessários antes de entrar na sala.

# data[].attributes.body
2º DIA DE EXTRAÇÃO

-Adicionar  700μL  de  Clorofórmio,  homogeneizar  em  vórtex  e  resfriar  no

freezer por aproximadamente 10 minutos.

-Centrifugar  as  amostras  à  10.000  rpm  por  10  minutos  (enquanto  isso, identificar novos tubos de 1,5mL para transferir o sobrenadante).

-Retirar o sobrenadante e transferir para um novo tubo de 1,5mL, adicionar

700μL de Clorofórmio, homogeneizar suavemente e centrifugar a 10.000 rpm por

10 minutos.

-Retirar o sobrenadante e transferir para

novos tubos de 1,5mL identificados  com  o  nome  da  amostra,  data,  finalidade  e  nome  de  quem  fez  a extração. Em seguida adicionar igual ou maior volume de Isopropanol gelado e homogeneizar suavemente até o DNA precipitar (formar “nuvem”) Centrifugar  a  10.000  rpm  por  3  minutos,  retirar  o  Isopropanol  por  inversão retirando o excesso que sobrar com o auxílio de papel toalha.

-Adicionar 300μL de Álcool 70%, homoge

neizar suavemente e centrifugar a 10.000 rpm por 5 minutos.

-Descartar o Álcool 70% por inversão, retirar o excesso com o auxílio de

papel toalha. É importante que não fique nenhum resquício de Álcool, por isso,

se  for  possível  colocar  os  tubos  abertos  no  banho  seco  a  37ºC  até  que  todo álcool evapore.

-Por último, adicionar 200μL de Tampão TE e deixar por 48 horas na geladeira

para o DNA reidratar. Caso a amostra for ser usada no dia seguinte, adicionar o

Tampão TE na mesma e deixar no banho seco a 37ºC overnight.

-Se  não  estiverem  sendo  usadas  as  amostras  devem  ser  guardadas  na

geladeira, e se não forem mais ser usadas devem ser descartadas.

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PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA EM FARELO DE SOJA

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PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA EM FARELO DE SOJA

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1º DIA DE EXTRAÇÃO

-Pesar  0,05g  (50mg)  de  farelo  de  soja  de  cada  uma  das  amostras

desejadas e colocar em um tubo ependorff de 2,0 mL identificado.

-Adicionar em cada tubo 700μL de Solução de Lise e homogeneizar bem utilizando o vórtex.

- Adicionar  10μL  de  Proteinase  K  (20mg/mL)  e  homogeneizar  a  mão  ou

rapidamente em vórtex.

-Deixar em banho seco a 55ºC overnight.

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1 )  P R E P A R O   D A   S O L U Ç Ã O   DE   L I S E

Em um béquer misturar 6mL de detergente, 4g de NaCl

(4 colheres de sal) e água qsp

para 60mL de solução.

2 ) E X T R A Ç Ã O   D E   D N A
-Cortar  e macerar  a banana com  a  solução  de lise, no saco plástico, até se obter uma solução liquefeita.

-Misturar  a  solução  durante  2  a  3  minutos  e,  em seguida, filtrar utilizando gase, funil e o tubo de ensaio

- Depois  de  filtrar,  acrescentar  lentamente  o  álcool etílico

absoluto gelado com auxílio da pipeta

de pasteur.

# data[].attributes.body
M A T E R I A I S
• 1 morango;

• Saco plástico comum

transparente;

• Detergente comercial;

• Água;

• Béquer ou copo;

• Colher de medida (colher de

café);

• Proveta;

• Álcool etílico absoluto (Deve ser

mantido gelado até o momento da

sua utilização);

• Gaze para filtrar;

• Tubo de ensaio;

• Cloreto de sódio;

• Funil;

• Faca;

• Bastão de vidro;

•Pipeta Pasteur.