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A host organelle integrates stolen chloroplasts for animal photosynthesis

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nature communications - 2024 - DTX3L-mediated TIRR nuclear export and degradation regulates DNA repair pathway choice and PARP inhibitor sensitivity

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314303011 蔡汶恩

Q: D-motif and F-motif 功能上有什麼不同？

A: Biological 上並沒有研究解釋功能上的不同，主要功能就是docking 。

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Q: F-motif做mutation沒有像D motif mutation一樣造成幾個位點異常磷酸化的可能原因

A: 作者在文中沒有提到，不過可能是JNK1上的FRS( F-motif recruitment site)本身和JIP1的binding affinity不高 (F-motif對JNK1的binding affinity, Kd值約2.2mM，遠低於D-motif, Kd值約81nM)，加上F-motif主要促進的是其鄰近（特別是立刻N端附近，如T205）的磷酸化，作用範圍比D-motif窄，對整體磷酸化的模式影響有限。此外JIPI內的F motif沒有phenylalanine，使其docking上JNK1的效率不高。

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Q:在分析local effective concentration，發現偏好D-motif的C端進入active site，不偏好N端可能的原因是什麼，是因為序列的關係嗎?

A:不偏好N端可能是因為結構上的問題，雖然是IDR，但還是會有side chain會影響到IDR的結構，導致N端不偏好進入active site。

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Q：為何FRS影響到的較少？如果影響這麼少，那它的功能是甚麼？

A：因為FRS與F-motif的Binding本身就較弱。FRS的功用是與DRS協同作用，使JNK1更容易使JIP1磷酸化。

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313303013 張祐維

Q：在第二十頁投影片中的公式意義為何？以及與F-mutant/ DF-mutant+peptide速率的關係為何要用比值做比較？

A：公式中分母的部分為那個docking location的體積，分子為40多萬組模型目標位點在此磷酸化的機率。

因為用比值可以作為population的表示，而如果用差值作比較容易失真。

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Q: 在 Fig 3 mutate JIP D motif (黃色的線) 發現在 T103 , S421 和 T448 比 JIP WT 的磷酸化比例還高，是因為 mutate 的位置會破壞 D motif 的 structure ,所以讓這三個位點比較容易被磷酸化嗎？

A:應該跟結構沒關係，可能是因為 mutate D motif ,讓 JNK 的 docking site DRS 空出來,跟 JIP 其他位點形成hydrophbic cluster interaction ,而意外造成這三個位點磷酸化比例提高。

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Q：為何Fig.3 S421中，在加入peptide後磷酸化仍然比wild type高？

A：從Fig.1 D圖中，可看到S421磷酸化效率本來就低，因此Fig.3圖上表示加入peptide後與wild type有差距，其實此差距是很小的。

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Q&A

Q: 所以可以透過這篇paper進而解釋說D-motif的影響具有距離和方向性，而F-motif則僅促進N端的單一位點嗎？

A: 只有在此篇paper可以這樣解釋，在此篇paper中是這樣沒錯。

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abstract_turnitin

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Q:圖五中有些不同的胺基酸為何對應相同顏色?

A:我推測是根據胺基酸的性質做分類，例如是否帶電，極性非極性等，講者說明會回去再確認。

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314303006 賴思瑜

Q:想問在NMR的圖中其實有顯示13個點 但這邊主要提到的是11的點，那其他兩個點是跟JNK1的磷酸化比較無關嗎？

A:文中有提到多看到兩個點，分別是S40跟T201，他們鑑定到這兩個是非典型的磷酸位點，不是S/T-P site 的磷酸化位點，這篇作者雖然有提到這兩個點，可是沒有在後續進行更多的探討，所以我們沒有特別說明。

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1. 講者要在一周前上傳paper，上課前一

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1. 講者要在一周前上傳paper，上課前一天上傳abstract和比對結果。

2. 課堂開始前，學生聽眾要留言comments。

3. 課堂中，每位學生必須要問問題。每位同學提出的問題及得到的答案必須貼在板上，期限為上課當天。

4. 學生聽眾貼在板上的問題及答案的質與量為學生聽眾提出問題的分數，答案的正確與否為講者回答問題的分數，所以講者在一周內適當提出修正及補充學生聽眾貼在板上的答案。

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314303019黃宜婷

Q：為了阻斷在阻擋D motif後其他位點有結合力增強的現象做了一條peptide，想問那條peptide是怎麼設計的？

A：直接設計一個可以把D motif直接整塊擋住的peptide

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314303020 王之涵

Q: 測定phosphorylation rate時X軸皆為40分鐘，請問是如何界定出來的呢？還是NMR測定時間以40分鐘為單位？

Ａ：NMR並不是以40分鐘為單位測量，而是有些組別在40分鐘時已達飽和且拉開差距。

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313303013 張祐維

Q:如何區分Fig 1F中的adjenct cell和 tumor cell?

A:應該有做另一份明視野H&E stain的切片，來去確認二者的位置！

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314303011 蔡汶恩

Q：M1/M2 macrophage的差異？

A：M1,抗發炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、促進發炎，

M2,抑制發炎、組織修復、促進腫瘤、免疫抑制，

單核細胞是巨噬細胞的來源，巨噬細胞可以分成不同的類型，會有不同的功能，但都具有巨噬細胞的marker。

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Q : 在Figure 3A最右邊那張clinical score圖的橫軸顯示天數從-3開始是什麼意思?

A : 推測應該是用CAR-T做治療前就已經有開始根據小鼠的各種狀態去計算分數，然後第0天則是開始加入CAR-T的時間。

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Q:請問復發的小鼠判斷依據是什麼

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Q:請問復發的小鼠判斷依據是什麼

A:放約14天後，根據腫瘤的大小判斷（有一個criteria量表）

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Q:在Figure 2E前，作者的結果顯示，在CAR-T remission的組別有較多M1 cell，TNF-α是M1 cell分泌的促炎因子之一，想比於IL-6及IL-12，為什麼CAR-T remission的TNF-α並沒有比較顯著的提升?且在CAR-T relapse組別M2 cell比例較高，但抗發炎因子IL-10並沒有顯著差異可能的原因是什麼?

A: Macrophage 的M1及M2都有不同的subtype，不同的subtype 所 secret 的 cytokine也有所不同，導致結果只看到IL-6及IL-12是有顯著差異的。

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Q:Fig 3A 中的「Clinical score」的依據是什麼？分數的高低代表什麼？

A: Supplemental figure 2中，作者依據Weigh loss, Activity, Paralysis來給予分數，分數越高代表嚴重程度越高。

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Q: p-Rb和Rb的差別是什麼？為何一個在stress前表達，一個在stress後表達？

A: p-Rb是磷酸化的Rb，其磷酸化後被抑制。因此在stress前表達p-Rb，stress後表達活化老化因子Rb。

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Q:想請問為什麼 Fig 1 的 A20 b cell lymphoma / leukemia 的小鼠模型有分成全身性和區域性？

A:因淋巴瘤可能會局部生長，也有可能隨著疾病進展擴散到其他地方，因此作者建立全身性和區域性的小鼠模型（兩者感染方式不同，全身性為靜脈注射，區域性為皮下注射），可能造成免疫反應不同，並了解在CAR-T 治療下 TAM 是否存在差異。

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Q:在3D跟E的圖中，分別在六張小圖都有黑線區分上下兩個區塊，是代表什麼意思？

A：在黑線中，有用流式細胞儀去做染色的動作，那上面的區塊是有測量到被染色，是有螢光表達的地方，下面的區塊就是沒有表達的地方。一般會做一個control組沒有染色的部分去界定說哪一區是有表達，哪一區是沒有表達，之後再去確認中間那一條黑線會畫在哪裡

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nature communications - 2024 - Transiently formed nucleus-to-cilium microtubule arrays mediate senescence initiation in a KIFC3-dependent manner

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Q：作者發現M1/M2的極化與PI3K和STAT3有關，請問詳細的訊息傳遞路徑是什麼？

A：當細胞激素與受體結合後會活化下游的STAT路徑，接著影響DNA的表達，使之朝向M1/M2極化

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Q:腫瘤體積計算公式a×b²/2中a、b分別代表什麼意思？如何推導出？

Ａ：在小鼠皮下原位腫瘤實驗裡，常用卡尺測量腫瘤的長徑 (a, length) 與 短徑 (b, width)。由於腫瘤大致呈橢圓形，腫瘤體積公式 a × b² / 2 是從橢球體體積公式推導來的。

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314303019黃宜婷

Q: figure 2B有說是分別沒植入CAR-T和有植入CAR-T的小鼠復發的機率，想問右邊那張圖橫軸是什麼意思？

A: 就是在所有CAR-T小鼠中復發和痊癒的比率

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314303011 蔡汶恩

Q: mother centriole 跟 primary cilia 的關係？

A: mother centriole會有一群裡面含有很多組裝cilia的component的囊泡會接在上面，然後會形成cilia，等他長到一定的長度之後外膜會和細胞膜融合長出去

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313303013 張祐維

Q：Fig 2I中，scramble 的意義是什麼？是代表 control嗎？

A：他是具random sequence 的質體，且當其進入細胞時不會影響細胞，因此可作為control 組。

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Q:想問 Fig2 的圖C 綠色染到的 alpha-Tublin 都是 sinc-MTs 而不會是其他 tublin 嗎？

A:作者內文的描述認為染到 alpha -Tublin 的確都是 sinc-MTs ，但是至於會不會染到其他的 tublin 可能要再回去看 supplementary。

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Q: Figure 3中的圖d，為什麼在day10的螢光訊號 (包含KIFC3) 會特別看不見?

A: 因為sinc-MT為受到壓力後短暫的形成，KIFC3只會在有polyglutamylation的mircotubule上協助移動。因此當sinc-MT隨著時間增加而不見時，KIFC3也會不在，所以看不到螢光訊號。

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Q: cilia跟衰老之間有什麼關聯性？

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Q: cilia跟衰老之間有什麼關聯性？

A: cilia可以作為一個溝通的橋樑，感應外界的刺激，接著把訊號傳遞下去，其中有跟衰老相關的路徑

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Q:在Figure 3b,d,e中，KIFC3的IF都標示著KIFC3，但Figure 3f中卻標示KIFC3-v5，與前面的KIFC3有什麼不同?是使用不同的antibody嗎?

A:KIFC3-v5是設計帶有v5 tag 的exogenous protein ，所用IF抗體則是標記在v5 tag上。

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Q&A

Q:如何判斷Fig 3e的圖是細胞核還是整顆細胞?

A:由染成紅色的polyglutamylated sinc-M呈線狀可以判斷應為整顆細胞，若為細胞核應會呈點狀。

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問:在圖2 m中有發現用了兩條 shRNA: shTTLL5-1 和 shTTLL5-2，想請問作者在設計上有什麼不同？

答:我有去看說明，但作者沒有特別說，因此我猜測是做二重複，或是其他sh 的knockdown的RNA 序列不一樣，但沒有很清楚。

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Q1:Fig1 i 的 CDK5RAP2 是跟衰老有關嗎?還是跟微管有關聯?

A1:CDK5RAP2與微管的形成和調節有關，且會去影響到p21及p16的衰老因子

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Q:CAMSAP2為何能精準的只對minus end進行染色而不會染到plus end？

Ａ:CAMSAP2是一種protein，本篇文章用帶有螢光的專門抗體進行染色。

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Q:前面有介紹p53和p16那結果圖裡面p21是什麼？

A:在p53下游，受p53調控的基因

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Q:想請問既然是 USP53 mutatant 造成家族性膽汁淤積症，那為什麼作者除了 USP53 還要做USP54?

A: 因為 USP53 和 USP54 序列相似，所以作者才一起做 。

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313303013 張祐維

Q:為什麼Fig1F中的結果可以得出di-Ub不容易被切除？

A:實際上這裡只能得出Ub會被USP53 54切除，但是若要得出di-Ub被切除要結合後續實驗的結果才能得出。

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Q: 什麼是OtUBD?

A: 一段特定的結構，會專一性binding ubiquitin ，在文章中是起到pull down的作用。

# data[].attributes.body
Q: 在Figure 1e，為什麼下方顯示除了Ub-RhoG (Rhodamine G)還有其他不少位點 (substrate) 接上RhoG，但實驗結果主要只有顯示兩條線的樣子?

A: Ub-RhoG所接的Ub為monoubiquitin﹐且此實驗是使用dipeptide去切割，對於其他substrate切割的效率比較差，也切不太動，因此仔細看可以發現下方的線是很多不同顏色的線重疊在一起。

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Q:在 Figure 1F中，K63 的 tetra Ub對比其他種類的tetra Ub ，在gel上的分子量大小為什麼不同?

A:目前K63 的 tetra Ub在gel上對比其他會有較小的分子量，但為甚麼會有此現象還尚不清楚，也有可能是跑gel時，電壓不穩造成。

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Q: 還是有點不太懂Fig 4e 的意思，這裡是指模擬出來的兩個USP54的 S1 site 與 S2 site 結合嗎?

A: 不是模擬圖，這裡是指用X-ray 所觀察到的結構是一個USP54的S1 site 會和另一個 USP54的 S2 site 透過isopeptide bonds 相連，但其實實際上應該是一個USP54自己的S1 site 會和自己的S2 site結合(如4g所示)，所以作者才會做Fig 4f 的實驗證明。

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Q:在做diglycine ubiquitinome profiling時是鑑定有ubiquitin的，而USP53是deubiquitinase，是反向推斷嗎

A:對，只將USP53 knockdown並且未knockdown的對照組進行比較後，就可以知道缺少USP53所造成的影響（有些就不能被deubiquitin而留下ubiquitin chain）。

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Q: PRTG跟RABAC1是什麼？為何作者選則測定這兩個基因？

A: 是細胞表面免疫球蛋白樣蛋白，會影響細胞間黏附，與上皮屏障有關。

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Q:圖中因為USP53的缺失可以導致兩個疾病:聽力障礙跟膽汁滯留症，請問要怎麼分辨是影響哪一個?或是有膽汁滯留症就會有聽力障

A:應該是不會一起，都是形成tricellular tight junction，這邊主要在講USP53、54 linkage type的發現，比較沒有著重在深入探討聽力障礙方面。

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Q: 為何原本作者使用HeLa cell到後面要改用CaCo-2 cell呢？

A: 作者為了研究和耳道問題以及膽汁淤積中USP-53所造成的影響，因此選擇用疾病發生的epithelial cell類型的CaCo-2 cell作為模型

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Ｑ：OtuBD是只出現在膽嗎？

Ａ：它是ubiquitin binding domain, 是pull down實驗中加入抓出ubiquitin的人工合成蛋白。

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Q：USP53需要至少兩個Ub才能切，那留下一個Ub的作用是什麼？

A：蛋白至少要連續接上四個Ub才會被degrate，接上一個是要告訴蛋白要做什麼。

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314303011 蔡汶恩

Q: H&E、EM是看什麼的？

A: H&E 可以看發炎，圖上染細胞核是紫色，染細胞質與胞外基質是粉紅色，中間白色空洞是lipid，因此進行冷凍切片以ORO staining 更清楚可以看到lipid累積。

EM和Sirius Red是看細胞纖維化的情形。

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Q: Michael addition是什麼?

A: 一種nucleophilic addition，發生在具有α,β-unsaturated carbonyl compound，像是4-HNE上 (一種α,β-不飽和醛類)。親核試劑 (像是-SH, -NH, -NH2)會去攻擊 β 碳，形成新的C–C或C–S / C–N鍵，產生共價adduct。

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Q:在最後作者所畫出的Alterations in TGF-β signaling的Model中，4-HNE會與SPTBN1結合促進caspase 3切割SPTBBN1成N-SPTBN1，圖中的4-HNE在SPTBN1切割完後，並沒有離開N-SPTBN1，而是一起進入到核中，所以4-HNE在促進caspase 3切割完SPTBBN1，並不會離開N-SPTBN1，而是會繼續結合在N-SPTBN1，並依同進入核中?

A:在本篇研究中看到ASKO小鼠，4-HNE會大量表現在核中，且先前研究發現SPTBBN1會被caspase 3切割成N-SPTBN1，進到核中，所以作者認為可能是N-SPTBN1將4-HNE帶入核中，但沒有相關的實驗證明。

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Q&A

Q:實驗中給予小鼠的西方飲食跟一般飲食有何差異?

A:在西方飲食中，為了模擬高熱量、高脂肪、高糖、高膽固醇的飲食模式，會提高飼料中脂肪、碳水化合物及膽固醇的相對比例，其中，脂肪約佔40-60%，碳水化合物約佔 30–40%，膽固醇約佔0.2–1%，比例會根據不同廠牌有所差異。

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Q: Fig 4C中siAldh2後加入4-HNE，p-SMAD3沒有表現、siSptbn1表現量有，而後面同時siAldh2及siSptbn1組別中其p-SMAD3表現有些微回升，那要怎麼確定他的回升是因為Sptbn1的原因，而不是因為單純同時knockout兩個之後細胞壓力下降?

A: 這裡可以證明的是「誰」最會受到4-HNE的影響，可以說在同時knockout Sptbn1及Aldh2的狀況下還是有回升，代表4-HNE的主要目標是Sptbn1。

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Q: 人類 3D MASH 模型是如何建立的？

A: 使用Primary human hepatocytes、Kupffer cells、Stellate cells模擬真實肝臟結構，於MASH induction medium懸浮培養，誘導脂質累積。這種方法能更貼近於人體環境的病理及訊號傳導。

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Q: Fig2A 為什麼要持續施打 siRNA 七週那麼久？

A:因為根據前面實驗發現小鼠在約 12 個月時才會出現明顯脂肪肝與纖維化的病灶，因此從約 10 個月開始連續 7 週注射 siRNA，使 SPTBN1 持續的被抑制，以觀察是否能改善已形成的病變，並且，siRNA 效果維持時間短，需要多次注射才能達到穩定 knockdown。

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Q:為什麼不做Sptbn1 knockout mice

A: 因為他們發現小鼠死亡率太高了，不適合。

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Ｑ：eWAT是來自副睪丸，請問這篇文章是只針對公小鼠嗎？

A:是的，此篇文章是只針對公小鼠。

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Q：作者前面發現4-HNE的修飾會提高N-SPTBN1的產生，請問在fig6中作者是怎麼得出4-HNE會幫助cas3介導的SPTBN1切割？

A：作者除了發現4-HNE的修飾會提高N-SPTBN1的產生外，在上一篇研究中也發現SPTBN1會利用cas3切割成N-SPTBN1，因此他們推測可能的機制是4-HNE會幫助cas3介導的SPTBN1切割，至於實際上是不是這樣他們並無利用實驗去做驗證。

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Q: liver specific knock out是怎麼做的？

A: 插入lox p site 後，利用liver specific的 albumin-cre去做編輯，且要經兩代交配後才會產生

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Q:詢問圖1E中，灰色區域代表什麼? 為什麼ASKO(第四張圖)的灰色區域不見了?

A:這部分沒有想過，會稍後回去查清楚

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Q: Fig 3A 中第一條well 的flag-USP2與NICD皆沒有，為何還有一條band?

A: 該band應該是抗體非特異性結合的產物。

# data[].attributes.body
314303011 蔡汶恩

Q：

Fig2 WB結果看的protein都有什麼function？

A：

USP28需要FBXW7(E3 ubiquitin ligase 的一部分，負責辨識substrates)，辨識NICD(Notch Intracellular Domain)，而c-JUN,Cyclin E是NICD的target。

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Q: HEK293細胞是什麼細胞？為何選用這種細胞？

A: HEK293是人類胚胎腎細胞。transfection效率高，適合用來做PPI及分子機制相關的研究。

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Q:在Figure3C中，D8,D40有什麼不同嗎？

A:作者從外面拿到的不同的KO cell line，應該是代表編號。

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Q: 作者收集CLL患者11q del的條件只有一個嗎？沒有根據分期之類的其他條件嗎

A: 作者沒有提到，應該是沒有

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Q&A

Q:Fig 3A的NICD C-terminal不同長度的deletion，是有任何依據的嗎，例如某些片段具有特殊結構或功能?

A:作者沒有說明，可能沒有特別的依據。

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Q: 前面Fig 5C中他們篩選出了11個可能的target genes，但他們在Fig 6中卻只有展示其中6個的data sets，那其他的部分作者也有分析嗎?

A: 作者全部的11個都有分析，但這邊選出6個做為代表。

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Q: 為什麼圖3A要做short exposure 還要做long exposure

A:為了看清楚wt NICD的band所以還做long exposure

# data[].attributes.body
Q: fig 4A 中empty代表什麼意思？

A: 是control, transfection時連空的vector都沒送入細胞。

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Q:圖5C中,黑色點跟綠色點分別代表什麼意思?

A:綠點在臨床數據資料中是有顯著表現差異，但這CLL8 data中沒有顯著差異的基因。黑點是完全沒有顯著表現差異的基因。

# data[].attributes.body
Q: 想請問 Cycloheximide chase assay 的 Cycloheximide 是什麼 ?

A:Cycloheximide 是一種阻止細胞繼續產生新蛋白的 compound ，而在這篇 paper 是用來看關閉源頭後(新的蛋白質不再產生)，USP28 對NCID 的降解速度影響。

# data[].attributes.body
Q:Fig.5C中，橫坐標跟縱座標以及虛線所劃分的四個象限代表什麼意義?

A:橫向虛線以上表示具有顯著差異;以下則無。而縱向虛線往右表示正相關;往左則是負相關。

# data[].attributes.body
Q: 4i 中的#1及#2的差異為何？後面的sgDTX3L是用哪一種？

A:#1和#2的sgRNA在method所示為兩種不同的sgRNA，但至於是如何製備的，要回去查詢。至於後續作者是使用哪一種sgRNA，作者並沒有特別表明。

# data[].attributes.body
Q: 要怎麼看figure 6a, b中的case1和case2?

A: 主要是從44位病人prostate cancer的samples去做IHC染色，可以主要看棕色的部分，當DTX3L表現高時，TIRR的表現會下降。因此在6b的圖中可以看到DTX3L和TIRR兩者的IHC score呈現負相關的結果。