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La técnica de coloración de Gram es extremadamente sencilla de realizar y relativamente económica y no puede faltar en un laboratorio de microbiología.

La misma se realiza de la siguiente manera:

1. Fijar el frotis con calor y colocar sobre el puente de coloración.

2. Se cubre la lámina completamente con cristal violeta por 1 minuto.

3. Lavar con agua. No secar

4. Cubrir la lámina con solución de lugol, dejar actuar durante 1 minuto. Lavar con agua. No secar.

5. Decolorar por 5-10 segundos con agitación suave en alcohol acetona. O colocar la lámina en posición vertical y dejar caer gotas del decolorante sobre la superficie hasta que arrastre el sobrante de cristal violeta no retenido. No exceder.

6. Lavar con agua. No secar.

7. Volver a colocar la lámina sobre el puente de coloración y cubrir por 30 seg con safranina (Gram-Hucker) o 1 min con fucsina básica (Gram-Kopeloff).

8. Lavar con agua

9. Dejar secar espontáneamente al aire en posición vertical.

Una vez seco, colocar 1 gota de aceite de inmersión para observarlo bajo el objetivo de 100X en el microscopio óptico.

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Preparar un frotis bacteriano

Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco, siguiendo las precauciones de esterilidad.

Secado del frotis

Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.

Calentar la muestra

La muestra se debe calentar aplicando fuego al portaobjeto por debajo. Se puede hacer una fijación con alcohol cuando el frotis no se ha preparado con esputo (tratado con hipoclorito de sodio para blanquearlo) y si no se va a teñir inmediatamente.

M. tuberculosis se elimina con lejía y durante el proceso de tinción. La termo fijación del esputo no tratado no matará a M. tuberculosis, mientras que la fijación con alcohol es bactericida.

Cubrir la mancha

La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina (colorante básico primario).

Calentar la mancha

Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento de vapor (aproximadamente a 60 °C). Es importante no sobrecalentar y evitar quemar la muestra.

Con relación al calentamiento de la mancha, se debe tener mucho cuidado al calentar la carbol fucsina, especialmente si la tinción se lleva a cabo sobre una bandeja u otro recipiente en el que se hayan recogido productos químicos altamente inflamables de la tinción previa.

Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los portaobjetos usando un hisopo encendido previamente humedecido con unas gotas de alcohol ácido, metanol o etanol al 70 %. Evitar usar un hisopo grande empapado en etanol porque esto es un riesgo de incendio.

Lavar la mancha

Este lavado debe hacerse con agua limpia. Si el agua del grifo no está limpia, lavar el frotis con agua filtrada o destilada, preferiblemente.

Cubrir el frotis con alcohol ácido

Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura se lleva a cabo durante 5 minutos o hasta que el frotis esté lo suficientemente decolorado, es decir, de color rosa pálido.

Hay que tomar en cuenta que el alcohol ácido es inflamable; por lo tanto, debe usarse con mucho cuidado. Se debe evitar estar cerca de fuentes de ignición.

Lavar la mancha

El lavado debe ser con agua limpia, destilada.

Cubrir el frotis con colorante

Puede ser colorante verde de malaquita (0,5 %) o azul de metileno (0,3 %) durante 1 o 2 minutos, utilizando el tiempo más prolongado si el frotis es delgado.

Lavar la mancha

Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).

Drenar

Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la mancha en un estante de drenaje, para que esta se seque al aire (no usar papel absorbente para el secado).

Examinar el frotis en el microscopio

Debe usarse el objetivo de 100X y el aceite de inmersión. Escanear el frotis sistemáticamente y anotar las observaciones pertinentes.

Interpretar los resultados

Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color rojizo se consideran ácido alcohol resistente positivos (AAR+).

Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante utilizado como contra-colorante, se consideran ácido alcohol resistente negativos (AAR-).

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Reaccionan de manera diferente entre las distintas clases de bacterias.
- Ziehl-Neelsen
- Gram

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1) Previo a la coloración se debe tener listo el extendido de la muestra sobre un portaobjetos limpio.

Las muestras pueden ser sangre, médula ósea, cortes de tejidos histológicos o muestras cérvico-vaginal. Se recomienda que los extendidos sean finos y tengan 1 o 2 horas de secado antes de colorearlos.

2) Sobre un puente de coloración se colocan todas las láminas que se tengan para colorear. Se trabaja siempre en un mismo orden y se identifica bien cada lámina.

3) Colocar unas gotas de alcohol metílico al 100% (metanol) sobre el frotis y dejar actuar por 3 a 5 minutos, con el fin de fijar y deshidratar la muestra.

4) Descartar el metanol presente en la lámina y dejar secar al aire.

5) Una vez seco colocar con un gotero la solución final de tinción hasta cubrir la totalidad de la lámina. Dejar actuar por 15 minutos. Algunos autores recomiendan hasta 25 min. Depende de la casa comercial.

6) Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con solución buffer a 7,2.

7) Sobre un papel secante dejar secar las láminas al aire libre, dispuestas en forma vertical con ayuda de un soporte.

8) Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante.

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Existen dos modalidades: una clásica y una rápida.

Modalidad clásica

1. Cubrir los frotis durante 2 o 3 minutos con la solución de May-Grünwald diluida.

2. Lavar con agua destilada tamponada para eliminar la solución anterior.

3. Cubrir con la misma solución de lavado tamponada y dejar por 1 minuto. La idea es que el colorante anterior se fije a las estructuras y que, al mismo tiempo, se hidraten las células.

4. Agregar 12 gotas de tintura de Giemsa diluida sobre el agua tamponada y soplar para mezclar y homogeneizar. Dejar reposar durante 15 o 20 minutos.

5. Lavar los frotis con agua destilada tamponada y colocarlo a secar al aire.

6. Enfocar y observar en un microscopio óptico las células sanguíneas teñidas utilizando el objetivo de 40X. Si es necesario, puede usarse el de 100X.

Modalidad rápida

1. Cubrir el frotis con el colorante May Grünwald diluido durante 1 minuto.

2. Lavar con agua destilada tamponada.

3. Cubrir con agua tamponada y dejar reposar por 1 minuto.

4. Colocar el colorante Giemsa diluido y dejar por 5 minutos.

5. Lavar con agua destilada tamponada y dejar secar al aire.

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1-Realizar el extendido de la muestra de forma que quede una película delgada, bien sea en portaobjeto o cubreobjetos.

2-Dejar secar al aire por 2 horas aproximadamente.

3-Colocar el frotis seco sobre el puente de coloración o cubeta de tinción con el extendido de la muestra hacia arriba.

4-Cubrir la lámina con el colorante de Wright gota a gota hasta abarcar toda la superficie. Dejar actuar durante 5 – 8 minutos.

5-El colorante deberá cubrir completamente el portaobjeto, sin que se derrame por los  bordes. Si durante el tiempo de coloración se comienza a evaporar se deberán colocar unas gotas adicionales.

6-Posteriormente adicionar una cantidad igual del amortiguador, soplar un poco hasta que aparezca el característico brillo metálico. Cronometrar 10 a 15 minutos.

7-Lavar con agua de grifo, colocando el chorro suave hasta que la lámina se vea rosada.

8-Con una gasa impregnada de alcohol eliminar el colorante adherido en el dorso del portaobjetos.

9-Dejar secar muy bien el frotis antes de colocar el aceite de inmersión para visualizarlo en el microscopio.

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Se utilizan dos ó más colorantes. Pueden usar mordentes y decolorantes - Giemsa - Wrigth - May Grünwald

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Realizar la extensión sobre un portaobjetos a partir de la muestra.
1. Dejar secar al aire.

2. Fijar la extensión con calor.

3. Teñir el portaobjetos por decantación, y esperar el tiempo necesario según el colorante utilizado:
· Azul de metileno: 1 minuto.
· Violeta de genciana: 30-45 segundos.
· Cristal Violeta: 15 segundos.
· Fucsinas y safraninas: 1 minuto.

1. Lavar la preparación con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

2. Dejar secar la preparación al aire.
3. Observar la preparación al microscopio óptico

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Se pipetea una pequeña cantidad de sangre, utilizando una pipeta Pasteur, procedente del tubo con la muestra. 1)Colocamos una gota, de pequeña cantidad de sangre, en un extremo del portaobjetos.

2) Se coloca encima el portaobjetos esmerilado con un ángulo de 30-45º.

3) Lo deslizamos hasta que el extremo que contacta con el porta, tome contacto, a su vez, con la gota de sangre.

4)Movemos ligeramente, de un lado a otro, el portaobjetos esmerilado para que la gota de sangre se extienda bien en su extremo.

5)Arrastramos el extremo del portaobjetos esmerilado por la superficie del portaobjetos horizontal para extender la sangre en una fina capa que conformará el frotis sanguíneo.

6) Debemos levantarlo antes de llegar al final del extremo del portaobjetos que se haya en posición horizontal.

7)Damos por concluida la realización del frotis sanguíneo.

8) Retiramos el portaobjetos esmerilado y lo introducimos en la cubeta con agua y lejía al 10%

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Coloración de Azul de Metileno (Tinción Simple)

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Coloración de Azul de Metileno (Tinción Simple)

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Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos patrióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos meta  cromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.
Procedimiento:

· Tome una muestra de los cultivos de Escherichia coli y Bacillus spp.

· Fije al calor la muestra.

· Cubrir con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.

· Lavar con agua.

· Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.

· Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión

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Se utiliza un solo colorante (básicos). - Azul de metileno - Safranina - Cristal violeta