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Alunas: Cleudiane, Eline, Mariana, M. Eduarda e Talita

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Alunas: Cleudiane, Eline, Mariana, M. Eduarda e Talita

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Os principais objetivos de estudos transcriptômicos são:

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Os principais objetivos de estudos transcriptômicos são:

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i) identificar todos os tipos de transcritos, incluindo mRNAs, RNAs não-codantes (ncRNAs) e pequenos RNAs (sRNAs);

ii) determinar a estrutura dos genes, em termos de locais de início, extremidades 5’ e 3’, padrões de splicing e outras modificações pós-transcricionais;

iii) quantificar mudanças nos níveis de expressão de cada transcrito.

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Transcriptoma: conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. Portanto, ele é o reflexo direto da expressão dos genes.

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Avanços tecnológicos baseados na PCR, intenso sequenciamento de cDNA e síntese de novo de ácidos nucléicos, têm contribuído para o desenvolvimento de técnicas de quantificação de mRNA em larga escala, em muitos casos em escala genômica, possibilitando que centenas ou milhares de genes sejam estudados em paralelo em vez de um gene de cada vez. Métodos como Differential Display (DD), Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) e DNA array bibridization ou DNA microarray, todos trouxeram benefícios significativos em relação ao Northern blotting em termos de sensibilidade e número de ensaios. Entre essas tecnologias, a que vem ganhando preferência para estudar a composição de um transcriptoma, e fazer comparações entre diferentes transcriptomas, é a técnica de DNA microarray.

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Um ponto importante a notar é que o transcriptoma nunca é sintetizado de novo, isto é, não começa do zero.

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Um ponto importante a notar é que o transcriptoma nunca é sintetizado de novo, isto é, não começa do zero.

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Cada célula recebe parte de seu transcriptoma materno quando é formada pela divisão celular, e depois é responsável pela manutenção e adaptação do transcriptoma conforme os diferentes estágios de sua vida e o tipo de diferenciação tomado.

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Existem, porém, limitações intrínsecas da técnica, entre as quais (1) a abundância do mRNA nem sempre é bem correlacionada com a abundância da proteína, (ii) a sensibilidade e variação dinâmica dos métodos existentes são tais que os mRNAs menos abundantes, potencialmente codificando as proteínas regulatórias mais importantes, não são facilmente medidos como acontece com os mRNAS mais abundantes, e (iii) a atividade das proteínas codificadas pelos mRNAS é regulada a vários níveis após a sua expressão. Por exemplo, a localização subcelular e/ou a extensão em que as proteínas são pós-traducionalmente modificadas, não são reveladas pela medição da abundancia do mRNA.

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Como alternativa às limitações dos microarrays, os métodos de RNA-Seq, definidos como sequenciamento direto de transcritos através de tecnologias de NGS, estão disponíveis para estudos de transcriptoma e são independentes de qualquer sequência anotada para o organismo de interesse, contando com diversos avanços das tecnologias de microarrays e várias químicas de sequenciamento. Além disso, o RNA-Seq apresenta uma maior capacidade de detectar transcritos de baixa abundância, diferenciar isoformas e possibilitar a identificação de variantes genéticas, além de possibilitar a detecção de uma maior quantidade de genes diferencialmente expressos com fold-change mais altos.

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Exemplo de DNA microarray (microarranjo)

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Exemplo de DNA microarray (microarranjo)