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OUTILS DE SEPARATION ET DE DETECTION DES ACIDES NUCLEIQUES

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OUTILS DE SEPARATION ET DE DETECTION DES ACIDES NUCLEIQUES

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Électroph sur agarose ou polyacrilamide sépare ac nuclé (ADN ou ARN) en fonct de taille grâce à leur charge. Migration borne- vers +. Gel polyacrilam plus fin donc meilleur résolution.

Coloration Bet (intercalant entre plateau de paire de base, fluorescence rouge en présence d'UV) ou Sybr green (fixe ac nucl au niveau du sillon mineure, fluoresc vert après excitat uv).

- Gel native ADNdb(non dénaturé) : ADN garde struct db, sur gel agarose, colorat bet ou sybr green, gel analyt.
- Gel dénatur ADNsb : ADN devient sb, gel polyacrilamide, agent dénatu : urée, gel de séquence = permet analyse séquence, visible en autoradiographie (détecte radiograph) ou en fluoresc.
- Gel dénat ARN : ARN dénaturé linéaire, agent dénat : formaldéhyde, formamide, colorat bet, gel analyt, petit fragm sur gel agarose, grand fragm sur polyacrilam.

Gel préparatif (ex agarose natif) : dépot produit pcr sur gel, migrat, colorat, découpe fragm interêt, fonte agar libère ADN dans tube, filtration, centrifug = culot produit pcr purifié.

Séparat prot sur polyacrilam, gel dénat : SDS = prot linéaire, plus charge négativement.

- Marquage 5' : déphosphoryl en 5' par phosphatase alcalinase, T4 polynucléotide kinase ajoute P32gama (phosphate radioact) en 5' grâce à substrat ATPgama(32P), liaison covalante
- Marquage 3' : terminal transferase ajoute dNTP radioact en 3', fait liaison phosphodiester entre P32alpha marqué et OH de l'ADN, relâche P beta et gama. Queue de nucléotides radioact en 3'
- Autre marqu 3' : sur ADN avec extrémité 5' sortante, nécessite ADN pol I fragm klenow (Pol I modifié pour ne plus avoir ativité exo 5'->3'), dNTP dont un marqué sur P32 alpha, matrice ADN avec extr 5' sort. ADN pol I synthétise extr 3' en recopiant 5' avec dNTP radioact et non radioact jusqu'à combler différence.
- Random priming : dénat 100°

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Dénaturation par augment temp à 95° ou augment pH, maintient de l'état par passage directe à 0° (glace).

TM : temp fusion, 50% ADNdb 50% ADNsb (=point d'équ entre sb et db). Prép ADN pure (sans contaminat prot) si A260/A280 >/= 1,8. C(ADNdb) = A260 (xfact de dilut) x 50 en microg/ml.

- A260 = 1 pour [solution d'ADNdb] à 50μg/ml

- A260 = 1 pour [solution d'ARN] à 40μg/ml

- A260 = 1 pour [solution d'ADNsb] à 33μg/ml

ADNsb absorbe plus uv que db. Absroption prot à 280. Courbe sigmoïde permet de déterminer la TM (=détermination expériment).

- Hyperchrome : absorpt de l'ADN augmente lorsqu'il subit une dénaturation.

- Hypochrome : absorpt de l'ADN diminue lorsqu'il subit une renaturation.

TM dépend composit en bases, longeur ADN, composit milieu réact. Tm = 2 x (A+T) + 4 x (G+C)

Hybridat moléc : associat nucléot complémen et antiparal donne duplex (ADN double brin). Thyb = Tm - 5°.

- T >> Tm : hybirdation impossible
- T </= Tm : hybridat parfaite/spécifique
- T << Tm : hybridat partielle/non spéc

Stringeance : conditions expérimentales (t°, force ionique) contrôlant l’hybridation moléculaire

- Forte stringeance : t° élevé, faible C° en sel = pas de mésappariement
- Faible stringeance : t° faible, forte C° en sel = mésappar

PCR : synth/amplific ADN in vitro. Milieu : matrice ADN, couple amorce, dNTP, Taq polym (adn dépend, thermostable, synth 5'->3', pas d'activité correct sur épr 3'->5'). Trois étapes de PCR : dénat (95°), hybridat (Tm-5°), élongat (72°). Moléc d'intérêt à partir du 3e cycle : N = No x 2 n, croiss expon.

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Recapturés par compartiment présynaptique par endocytose ou transporteurs => remis dans vésicules de sécrétion pour réutilisation

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Capturé par cellules gliales à proximité

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Dégradé directement dans la fente par enzymes de dégradation

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(Destinée après utilisation)

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Contre gradient chimique, utilise énergie dû à ion moteur. Cotransport ion ou molécule à contre-gradient grâce au transit dans le sens de son GEC d’un ion moteur.

Maintien du GEC de l’ion moteur nécessite secondairement l’hydrolyse de l’ATP. Après que l’ion rentre, pour maintenir le potentiel, une pompe actif primaire doit rejeter l’ion.

- Symport quand molécule transporté dans même sens que l’ion moteur,
- Antiport quand molécule transporté dans sens inverse de l’ion moteur.
L’ion moteur se déplace toujours dans le sens de son gradient chimique.

Une pompe fonctionne tant qu’il y a de l’ATP. Un transporteur actif secondaire fonctionne tant qu’il y a un GEC pour l’ion-moteur. Canaux responsables des changements de perméabilité membranaire. Phénomènes rapides et transitoires.

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Sortie de 3 Na⁺ pour 2 K⁺. Pompe inhibée par l’ouabaïne qui peut se fixer au site de liaison du potassium. Rôle : maintenir un gradient de concentration pour le sodium et le potassium et une électronégativité à l’intérieur de la cellule.

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- Transports actifs primaires à l’encontre des gradients, nécessitant ATP
- Remettent potentiel de membrane au potentiel de repos

L’ATP va être hydrolysé par la pompe qui est une enzyme, et donner de l’ADP. L’énergie produite sera utilisée pour faire passer les ions à travers la membrane contre leur GEC.

La phosphorylation joue sur les affinités, par ex, lorsque la Na⁺/K⁺ ATPase est phosphorylée elle a une meilleure affinité pour le Na⁺, et pour le K⁺ quand elle n’est pas phosphorylée.

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- Toujours ouvert
- Surtout canaux de fuite au potassium dans cellules, ce qui fait que le potentiel de repos des cellules est toujours proche du potentiel du potassium

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- S’ouvre par déformation mécanique de la membrane
- Exemple : dans les capillaires pour contracter les vaisseaux si on a d’un coup une très grande pression.

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- S’ouvre après la fixation de son ligand
- Spécifiques du ligand mais pas du type ionique

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- S’ouvre par changement du potentiel de membrane (Vm) lors d’une dépolarisation.
- Spécifiques d’un seul type d’ion.
- Existe un seuil d’ouverture.

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- Complexes protéiques de quatre à six sous-unités protéiques organisées en rosette dans la membrane
- Changent de conformations pour s’ouvrir et se fermer pour laisser passer ions.
- Le passage par lequel l’ion traverse la membrane est appelé le pore du canal.
- Au repos,  majorité des canaux ioniques fermés,  s’ouvrent si stimulation.
- Sélectif ou non.
- Structure des sous unités varie d’un canal à l’autre et détermine la spécificité du canal. Les propriétés spécifiques sont la sélectivité ionique ; c’est-à-dire la spécificité pour un ion, et puis les mécanismes d’ouverture et de fermeture.

Les canaux à transport passif, sans source d’énergie, se font grâce aux gradients électrochimiques :

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Résultante des deux forces :
- Si GC et GE dans le même sens : le GEC sera dans le même sens
- Si GC et GE en sens opposé : le GEC prendra le sens du plus fort gradient
- Si GC ou GE nul : le GEC est égal au gradient restant

À l’équilibre le GC = GE
GC = Eion et GE = Vm

GEC = V m – E ion

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Chaque cellule a un potentiel de membrane (Vm), le potentiel de repos (Vmrepos = -70mV) est l’état de base d’une cellule.

Si on enregistre un potentiel -, l’intérieur de la cellule est - par rapport à l’extérieur. Donc si on ouvre les canaux, le gradient pousse les ions + vers l’intérieur et les ions - vers l’extérieur

- Si V m < 0, les cations entrent et les anions sortent.

- Si V m > 0, les cations sortent et les anions entrent.

- Si V = 0 mV, il n’y a pas de GE.

GE = V m

- Si Vm > Vrepos : dépolarisation
- Si Vm < Vrepos : hyperpolarisation

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Déplacement se fait selon le gradient de concentration entre deux compartiments, jusqu’à atteindre un équilibre de diffusion. Passifs, ne nécessitent pas d’énergie, molécules vont vers là où leur concentration est la plus basse.

Plus d’ions calcium, sodium et chlorure en extracellulaire Plus d’ion potassium en intracellulaire.

GC = Eion

Le calcul de Eion donne des Volts, Eion peut être positif ou négatif.

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Récepteurs ont un segment transmembranaire. Ligand se fixe sur récepteur qui change de conformation et active directement l’enzyme à laquelle il est couplé, mais pas de 2nds messagers.

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Dans le cas RCPG avec l’adénylyl cyclase, ligand active récepteur qui active la sous-unité alphas qui active l’adénylyl cyclase, qui produit un second messager : l’AMPc. Cet AMPc active la PKA. La voix de signalisation se poursuit par phosphorylation de molécules

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7 passages transmembranaires, extrémité C-terminal dans cell et N-terminal dans milieu extracell, associé à canal (mouvement d'ions) ou enzyme effectrice (synthèse de 2nd messager)

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Permet passage rapide d'ions grâce à la fixation de deux ligands sur sous-unités alpha

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Grosses molécules polaires non chargées ou petites molécules chargées (ions) dans le sens du gradient de concentration

Grosses molécules polaires non chargées ou petites molécules chargées (ions) contre le sens du gradient de concentration

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Ligand => récepteurs cytosolique : complexe passe dans noyau => fixation sur promoteur de gène => stimulation/inhibition expression

Pour les ligands lipophiles à diffusion libre à travers la membranaire

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- Message lipophile => récepteurs intracell (cytoplasmique ou nucléaire)
- Message hydrophile => récepteurs membranaires

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Cellule produit hormone transportée par voie sanguine jusqu'à cellule cible

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Cellule émettrice secrète molécules signales captés par cellule cible à proximité possédant récepteurs spécifiques

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- Deux cellules juxtaposées
- Deux cellules reliées par protéines transmembranaires