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MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA DE EXCITACIÓN CON DOS FOTONES

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MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA DE EXCITACIÓN CON DOS FOTONES La microscopia de excitación de dos fotones es una técnica de proyección de imagen fluorescente que permite la imagen de tejido vivo hasta una profundidad de un milímetro. El microscopio de excitación de dos fotones es una variante especial del microscopio fluorescente de múltiples fotones.

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La microscopia de dos fotones fue promovida por Winfried Denk en el laboratorio de Watt W. Webb en la universidad de Cornell. Combinó la idea de la absorción de dos fotones con el uso de un explorador de láser. En la microscopia de excitación de dos fotones un rayo láser infrarrojo se enfoca a través de una lente objetiva. El láser del Ti-zafiro normalmente usado tiene una anchura del pulso de aproximadamente 100 femtoseconds y un precio de repetición de aproximadamente 80 MHz, permitiendo la densidad del fotón alta y flujo requerido para dos absorción de fotones y es ajustable a través de una amplia gama de longitudes de onda. La tecnología de dos fotones ha sido patentada por Winfried Denk, James Strickler y Watt Webb en la universidad de Cornell.

El uso de luz infrarroja para excitar fluorophores en el tejido de dispersión de la luz ha añadido ventajas. Las longitudes de onda más largas se dispersan a un grado menor que más corto, que es una ventaja para la representación de alta resolución. Además, estos fotones de la energía inferior con menor probabilidad causarán daño fuera del volumen focal. Comparado con un microscopio confocal, el descubrimiento del fotón es mucho más eficaz ya que hasta los fotones dispersados contribuyen a la señal utilizable. Estas ventajas para la representación en tejidos que se dispersan sólo se reconocieron varios años después de la invención de la microscopia de excitación de dos fotones. Hay varias advertencias a la utilización de la microscopia de dos fotones: Los lásers pulsados necesarios para la excitación de dos fotones son mucho más caros que los lásers de onda continua (CW) usados en la microscopia confocal. El espectro de absorción de dos fotones de una molécula puede variar considerablemente de su equivalente de un fotón. Para objetos muy delgados como células aisladas, el fotón solo (confocal) microscopios puede producir imágenes con la resolución óptica más alta debido a sus longitudes de onda de excitación más cortas. En el tejido que se dispersa, por otra parte, el seccionamiento óptico superior y las capacidades de descubrimiento ligeras del microscopio de dos fotones causan el mejor rendimiento.

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El concepto de la excitación de dos fotones está basado en la idea que dos fotones de la energía inferior de manera comparable que necesario para una excitación del fotón también pueden excitar un fluorophore en un acontecimiento cuántico. Cada fotón lleva aproximadamente la mitad de la energía necesaria para excitar la molécula. Una excitación causa la emisión subsecuente de un fotón de la fluorescencia, típicamente en una energía más alta que cualquiera de los dos fotones excitatory. La probabilidad de la absorción cerca simultánea de dos fotones es muy baja. Por lo tanto se requiere típicamente un flujo alto de fotones de excitación, por lo general un láser femtosecond.

Fluorophores el más comúnmente usados tienen espectros de excitación en el 400–500 nm variedad, mientras que el láser usado para excitar la fluorescencia de dos fotones está en el ~700–1000 nm variedad (infrarroja). Si el fluorophore absorbe dos fotones infrarrojos simultáneamente, absorberá bastante energía para levantarse en el estado excitado. El fluorophore emitirá entonces un fotón solo con una longitud de onda que depende del tipo de fluorophore usado (típicamente en el espectro visible). Como dos fotones se absorben durante la excitación del fluorophore, la probabilidad para la emisión fluorescente de los aumentos de fluorophores cuadráticamente con la intensidad de excitación. Por lo tanto, la fluorescencia mucho más de dos fotones se genera donde el rayo láser fuertemente se enfoca que donde es más difuso. Con eficacia, la excitación se restringe al volumen focal diminuto (~1 femtoliter), causando un alto grado del rechazo de objetos desenfocados. Esta localización de la excitación es la ventaja clave comparado con microscopios de excitación del fotón solo, que tienen que emplear elementos adicionales como agujeros de alfiler para rechazar la fluorescencia desenfocada. La fluorescencia de la muestra es coleccionada entonces por un detector de sensibilidad alta, como un tubo del fotomultiplicador. Esta intensidad de la luz observada se hace un pixel a la imagen eventual; el foco se explora en todas partes de una región deseada de la muestra para formar todos los pixeles de la imagen.

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La microscopia de excitación de dos fotones es una técnica de representación de la fluorescencia que permite la representación del tejido vivo hasta una profundidad muy alta, que es hasta aproximadamente un milímetro. Siendo una variante especial del microscopio de la fluorescencia del multifotón, usa la luz de excitación rojo cambiada que también puede excitar tintes fluorescentes. Sin embargo para cada excitación, dos fotones de la luz infrarroja se absorben. La utilización de la luz infrarroja minimiza dispersarse en el tejido. Debido a la absorción del multifotón la señal de fondo fuertemente se suprime. Ambos efectos llevan a una profundidad de la penetración aumentada para estos microscopios. Sin embargo, la resolución permanece limitada con la difracción. La excitación de dos fotones puede ser una alternativa superior a la microscopia confocal debido a su penetración del tejido más profunda, descubrimiento ligero eficiente y fototoxicidad reducida.

Excitación de pedido más alto

La absorción simultánea de tres o más fotones también es posible, teniendo en cuenta de tres fotones o microscopia de excitación del multifotón.

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Microscopia de excitación de dos fotones-helpes.eu

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La microscopia de dos fotones fue promovida por Winfried Denk en el laboratorio de Watt W. Webb en la universidad de Cornell. Combinó la idea de la absorción de dos fotones con el uso de un explorador de láser. En la microscopia de excitación de dos fotones un rayo láser infrarrojo se enfoca a través de una lente objetiva.

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José Alberto González Arellano Rocío Valiente Alaminos

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MICROSCOPÍA DE EXCITACIÓN POR DOS FOTONES

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MICROSCOPÍA DE EXCITACIÓN POR DOS FOTONES FUNDAMENTO Luz de larga longitud de onda para excitar fluorocromos. Absorción de energía de dos fotones de longitud de onda larga. Fotones deben llegar al mismo tiempo. Excitación de un electrón a un estado de energía superior. Decadencia, emisión de señal de fluorescencia.