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A utilização do portfólio como método de aprendizagem

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Introdutória

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We provide a brief report and phylogenetic analysis of the confirmed COVID-2 cases in Brazil. From 488 suspected cases, two have so far tested positive for COVID-19. These two cases both travelled to Northern Italy. Detailed clinical and epidemiological descriptions for suspected and confirmed patients, including for the two patients reported here, are available from the National Public Health Emergency Alert and Response Network from the Brazilian Ministry of Health.
Case reports and diagnostic testing
Patient SPBR1 is a 61 year old male that travelled from São Paulo to Italy (Lombardia region) in early February 2020. Upon returning to São Paulo on 21st February, the patient presented with respiratory symptoms including fever, dry cough, sore throat, and runny nose. On 25th February 2020, the patient visited a hospital in São Paulo city and a nasopharyngeal swab was collected for virus detection. By 26th February 2020, confirmatory diagnostic real-time RT-PCR testing had been conducted at the Instituto Adolfo Lutz (IAL), the regional reference laboratory for virus detection in São Paulo state. The sample from patient SPBR1 had a RT-PCR cycle threshold (Ct) value of 30.

Patient SPBR2 is a 32 year old male that travelled from Italy (Milan city, Lombardia region) to São Paulo city on 27th February 2020. Respiratory symptoms including cough, sore throat, myalgia and headache started on the flight to São Paulo, and the patient wore a mask during the flight. On 28th February, the patient visited a hospital in São Paulo and a nasopharyngeal swab was collected. Virus infection was confirmed on the same day using real-time RT-PCR and viral RNA was sent IAL for genomic sequencing. Sample from patient SPBR2 had a RT-PCR Ct value of 18.
Genome sequencing of confirmed cases
To investigate the genomic diversity of these two cases, genomes were generated by the CADDE project at the IAL together with the Institute of Tropical Medicine team from the University of São Paulo (IMT-USP). We used the openly-available COVID-19 sequencing and bioinformatics protocols developed by the ARTIC network. Sequencing protocol, sequencing multiplex primers, and bioinformatic protocols are described in detail in https://artic.network/ncov-2019. cDNA synthesis was conducted in duplicate for each sample. The concentration of PCR products was measured using a Qubit dsDNA High Sensitivity kit on a Qubit 3.0 fluorometer (ThermoFisher).

Library preparation was conducted without a barcoding step and libraries were sequenced on an R9.4.1 flow cell. Sequencing was conducted in MinKNOW version 19.10.1 for over 12 hours. The open-source software RAMPART version 1.0.5 was used to assign and map reads in real-time. Raw files were basecalled with Guppy, demultiplexed and trimmed with Porechop and mapped against reference strain Wuhan-Hu-1 (GenBank accession number MN908947). Variants were called using nanopolish 0.11.3 and accepted if they had a log-likelihood score of greater than 200. Low coverage regions were masked with N characters. Example of read data for SPBR1 is available for inspection from https://cadde.s3.climb.ac.uk/covid-19/BR1.sorted.bam. Consensus genome sequences have been deposited in GISAID with the following IDs: SPBR1: EPI_ISL_412964 and SPBR2: EPI_ISL_413016.
Phylogenetic analysis of COVID-19 complete virus genomes
To put the Brazilian genomes into the context of the global epidemic, we added them to a dataset of 157 curated complete genomes available from GISAID, as of 3rd March 2020. A multiple sequence alignment of 159 complete genomes from 20 countries was generated using MAFFT and manually curated. A maximum likelihood (ML) tree was estimated using PhyML version 3.0 using a general time-reversible nucleotide substitution model with a proportion of invariant sites.

Figure 1. Estimated maximum likelihood phylogenetic tree for complete genome sequences from 159 COVID-19 virus strains. Genome data used here was kindly made available in GISAID, as 3rd March 2020). The right hand panels show zoomed views of Clusters 1 and 2 containing the Brazilian genomes.

Figure 1 shows the estimated maximum likelihood phylogeny. As expected, sequences from China are interspersed across the tree. Interestingly, the two infections samples in Brazil group in different phylogenetic clusters. SPBR1 groups in Cluster 1 and is identical to a recently released sequence from Lombardy, Italy (EPI_ISL_412973). Cluster 1 also contains sequences obtained from patients from Germany, Mexico and Finland that reported travelling to Italy. When combined with the patient travel information, this indicates that the two confirmed cases in Brazil are the result of separate introductions to the country.

The genome from patient SPBR2 groups in Cluster 2, which contains sequences from several countries including China, England, Australia, France, USA, Singapore, Taiwan, and Sweden. We note that the case from England (GISAID ID EPI_ISL_412116) represents a direct import to London from China (Figure 1). The SPBR2 genome sequence is separated by three mutations from EPI_ISL_408977, which represents a case acquired in China and sampled in Australia on 25th January, and by four mutations from sequence EPI_ISL_410545, obtained from a Chinese tourist in Rome, Italy sampled on 29th January 2020. Although it is possible that patient SPBR2 was infected by a traveller from another part of the world, the infection was more likely acquired in Lombardy given the current prevalence of COVID-19 circulating there. If that is true, then the outbreak in Northern Italy was likely the result of multiple introductions to the region and from not a single source.

This has implications for epidemiological tracing and for identifying connections to the Italian outbreak using genome sequence analysis. Incidentally, a few Swiss genomes have been deposited overnight which seems to confirm the hypothesis of multiple virus introductions to Northern Italy. We caution, however, that further analysis is needed to evaluate the statistical robustness of the clusters in the SARS-CoV-2 phylogeny, which is challenging at this stage of the epidemic due to the small number of mutations between sequenced strains.

In conclusion, genome sequencing and analysis of the first two COVID-19 virus genomes from Brazil shows two independent virus introductions to the country. Phylogenetic analysis is consistent with the reported travel history of SPBR1. The challenges in inferring directionality of transmission for SPBR2 based on genetic data alone can be explained by undersampling and limited genetic variation of currently available virus genomes. Additional genome data from Northern Italy, and from travellers to that region, will help to elucidate the patterns of transmission there. Finally, continued surveillance of new cases will be critical to anticipate virus importations to Brazil, understand transmission in different settings, and identify possible clusters of local transmission in the country.

Disclaimer
The new sequences have been deposited in GISAID with accession IDs EPI_ISL_412964 (SPBR1) and EPI_ISL_413016 (SPBR2). Please feel free to download, share, use, and analyze the data from Brazilian strains deposited in GISAID. We ask that you communicate with us if you wish to publish results that use this data in a journal. If you have any other questions, please also contact us directly.

Contributing authors
Jaqueline Goes de Jesus, Claudio Sacchi, Ingra Claro, Flávia Salles, Erika Manulli, Daniela da Silva, Terezinha Maria de Paiva, Margarete Pinho, Ana Maria Sardinha Afonso, Andressa Mathias, Lincoln Prado, Ana Lucia de Carvalho Avelino, Katia Correa de Oliveira Santos, Filipe Romero, Fabiana dos Santos, Claudia Gonçalves, Maria do Carmo Timenetsky, Joshua Quick, Oliver G. Pybus, Nick Loman, Andrew Rambaut, Ester C. Sabino, Nuno R. Faria

Affiliations
Laboratorio Estratégico, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brazil
Núcleo Doenças Respiratórias, Centro de Virologia, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brazil
Centro Nacional de Influenza, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brazil
Instituto Medicina Tropical, Universidade de São Paulo, Brazil
University of Birmingham, United Kingdom
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
Institute of Evolutionary Biology, University of Edinburgh, United Kingdom
Department of Zoology, University of Oxford, United Kingdom

Funding
FAPESP Medical Research Council Brazil-UP CADDE partnership award (MR/S0195/1), a Wellcome Trust and Royal Society Sir Henry Dale Fellowship (204311/Z/16/Z), Oxford Martin School, and a Wellcome Trust Collaborators Award 206298/Z/17/Z ( ARTIC network).

Acknowledgments
We would like to thank all the authors who have kindly deposited and shared genome data on GISAID. A table with genome sequence acknowledgments can be found here gisaid_cov2020_acknowledgement_table.xls.zip (28.5 KB).

Updated epidemiological situation in Brazil:
http://plataforma.saude.gov.br/novocoronavirus/

Notification of suspected and confirmed cases in Brazil:
https://redcap.saude.gov.br/surveys/?s=TPMRRNMJ3D

Additional information (in Portuguese):
https://www.saude.gov.br/saude-de-a-z/coronavirus

Contact information
Professor Ester Cerdeira Sabino, MD, PhD
Instituto Medicina Tropical, University of Sao Paulo, Brazil
Email: sabinoec@gmail.com

Professor Nuno Rodrigues Faria, PhD
Associate Professor, University of Oxford, United Kingdom
Email: nuno.faria@zoo.ox.ac.uk

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First cases of coronavirus disease (COVID-19) in Brazil, South America (2 genomes, 3rd March 2020)

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First cases of coronavirus disease (COVID-19) in Brazil, South America (2 genomes, 3rd March 2020) We provide a brief report and phylogenetic analysis of the confirmed COVID-2 cases in Brazil. From 488 suspected cases, two have so far tested positive for COVID-19. These two cases both travelled to Northern Italy.

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Bioética e Biossegurança no laboratório

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Mariana Alvim - @marianaalvim

Da BBC News Brasil em São Paulo

Crédito, Arquivo pessoal

Legenda da foto,

Claudia Gonçalves, Jaqueline Goes e Claudio Sacchi, parte da equipe brasileira que conseguiu sequenciar genoma de coronavírus em aproximadamente 48 horas após confirmação de diagnóstico

Na terça-feira de carnaval, enquanto foliões pulavam pelas ruas e músicos esquentavam a percussão por todo o país, um grupo de cientistas brasileiros se apressou para um outro tipo de agito.

Diante da notícia de que um caso suspeito de infecção por coronavírus em solo brasileiro poderia ser confirmado em breve, pesquisadores do Instituto Adolfo Lutz (IAL) e do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo (IMT-USP), ambas instituições públicas sediadas em São Paulo, correram contra o tempo para preparar equipamentos e laboratório com o objetivo de sequenciar o genoma do vírus coletado em paciente internado na capital paulista. O diagnóstico do homem de 61 anos foi confirmado na quarta-feira (26).

"Em média, os países estão conseguindo fazer o sequenciamento em 15 dias. Queríamos fazer em 24 horas, bater o recorde, mas não funcionou tudo (no processo). Fizemos em 48 horas, como o Instituto Pasteur (na França)", contou à BBC News Brasil Ester Cerdeira Sabino, pesquisadora e professora do IMT-USP.

"Nas epidemias anteriores, como da Síndrome Respiratória Aguda Grave (Sars) ou da Respiratória do Oriente Médio (Mers), você até sequenciava (o vírus), mas só tinha o dado alguns meses depois. Hoje, estamos conseguindo fazer o sequenciamento em tempo real, enquanto a epidemia acontece", aponta, atribuindo a rapidez a um barateamento e maior conhecimento das técnicas.

"A capacidade de sequenciar rapidamente, principalmente no início de uma epidemia, pode ajudar na tomada de decisões. Vamos supor que apareça outro caso em São Paulo: se você tem a sequência, você pode responder mais rapidamente se o vírus já está circulando a nível local independente de viagens no exterior (os chamados casos autóctones)."

Sabino diz que conquistas na ciência como essa são como "tijolos" que vão se juntando, então não é possível dizer de imediato que "construção" esses tijolos vão formar - mas pode ser desde uma vacina ao melhor planejamento de uma cidade diante de uma eventual epidemia. Identificar as características genéticas de um vírus como esse, além de comparar a cepa coletada no Brasil com as de outros países do mundo, é como juntar pistas cronológicas e geográficas no caminho de transmissão do patógeno. Também é uma forma de registrar mutações, pontos fracos e fortes do vírus.

Crédito, Getty Images

Legenda da foto,

O material genético de um vírus dá pistas sobre seu trajeto de transmissão

Os resultados divulgados pela equipe brasileira nesta sexta-feira (28) indicam por exemplo que, das dezenas de amostras do novo tipo de coronavírus já analisadas em todo o mundo, a maior compatibilidade do material genético do vírus encontrado no paciente internado em São Paulo foi com um vírus sequenciado na Bavária, Alemanha. Isto é um indicativo, mas ainda não a confirmação, de que a cepa do vírus em questão teve origem na China, passou pela Alemanha, Itália, até chegar ao Brasil. A possível transmissão da Alemanha para a Itália é uma hipótese nova trazida pela equipe brasileira.

A região da Lombardia, no norte da Itália, onde o paciente brasileiro infectado esteve, até agora não teve amostras sequenciadas por equipes ou institutos locais - ao menos não publicamente.

Já em relação ao primeiro sequenciamento genético do novo tipo de coronavírus, feito em janeiro por pesquisadores na China, o material analisado pelos brasileiros tem três mutações - duas em comum com o encontrado na Alemanha. O sequenciamento realizado em São Paulo foi comparado com 127 genomas completos do coronavírus sequenciados em 17 países diferentes.

"A terceira mutação é uma mutação única, não encontrada na sequência mais próxima, que é a sequência da Alemanha. Então, provavelmente é uma mutação que já aconteceu na transmissão para o paciente brasileiro", explica Jaqueline Goes de Jesus, bolsista da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) em nível de pós-doutorado no IMT-USP.

É normal que, quando o vírus está se "instalando" no corpo de um novo hospedeiro (como um paciente infectado), haja erros no processo de replicação de seu material genético. São mutações que, ao acaso, podem causar tanto uma vantagem adaptativa quanto deixar o patógeno menos infeccioso.

"Alguns vírus são mais estáveis e outros, como os respiratórios, acabam mutando muito. É o que acontece com o vírus da gripe: todo ano a gente tem uma vacina nova, porque há muitas mutações", explica Goes de Jesus.

As brasileiras, assim como os franceses do Pasteur, indicam que o novo tipo de coronavírus surgido na China ainda é bastante homogêneo - portanto, não precisou passar por muitas mutações para se adaptar e espalhar. Há indicações também de que, ao contrário do Sars ou Mers, este coronavírus tem grande capacidade de transmissão e baixa letalidade.

Como foi sequenciamento no Brasil

Na quarta-feira (26), após a confirmação por exames do diagnóstico de coronavírus, amostras do paciente brasileiro foram enviadas ao Instituto Adolfo Lutz, seguindo protocolo do Ministério da Saúde.

Assim, na quarta-feira de manhã, cinco pesquisadores começaram a colocar a mão na massa no sequenciamento, em um laboratório do instituto.

Em linhas gerais, há a extração do RNA do vírus; sua transformação no chamado DNA complementar; depois a replicação exponencial de cópias deste DNA, através da chamada reação em cadeia da polimerase. Isso tudo acontece a nível molecular dentro de um líquido transparente.

Em seguida, vem a fase da leitura do material genético. Nela, é usado um equipamento pequeno e com aparência de pen-drive, chamado de sequenciador.

No processo, os brasileiros contaram com a colaboração remota de pesquisadores das universidades de Birmingham, Edinburgh e Oxford, no Reino Unido.

A leitura do material foi finalizada na manhã desta sexta-feira e logo publicada no Virological.org, um fórum mundial de discussão para virologistas, epidemiologistas e especialistas em saúde publica.

"No passado, os cientistas gostavam de guardar esse tipo de dado até publicá-los em alguma revista científica. Mas hoje, o consenso é de que, durante uma epidemia, você não deve guardar as sequências, e sim torná-las públicas imediatamente", explica Ester Cerdeira Sabino.

Jaqueline Goes de Jesus diz que, tecnicamente, a sequência obtida já tem 96% de cobertura, o que configura um genoma completo. Mas a equipe pretende completar esse sequenciamento e estar de prontidão para a análise de eventuais novos casos confirmados no Brasil.

A pesquisadora faz parte de um projeto que tem justamente o objetivo de monitorar e responder em tempo real a epidemias, o Brazil-UK Centre for Arbovirus Discovery, Diagnosis, Genomics and Epidemiology (CADDE), que conta com recursos da Fapesp e do Medical Research Council (MRC). Nascido há um ano, o centro de pesquisas pretende trabalhar não só com coronavírus como o atual como também com arbovírus como dengue e chicungunha.

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Quarto mais afetado pelo coronavírus, o país europeu vê a epidemia gerar propostas xenófobas, acusações de histeria e disputas políticas.

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Os bastidores e resultados da corrida de cientistas brasileiros para sequenciar coronavírus em tempo recorde - BBC News Brasil

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Mariana Alvim - @marianaalvim Da BBC News Brasil em São Paulo Na terça-feira de carnaval, enquanto foliões pulavam pelas ruas e músicos esquentavam a percussão por todo o país, um grupo de cientistas brasileiros se apressou para um outro tipo de agito.

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The 2019‐new coronavirus epidemic: Evidence for virus evolution

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Curso Técnicas em Biologia Molecular I - Módulo 9 - Extracao de DNA

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Este livro apresenta os elementos necessários para a compreensão das diferentes aplicações científicas e tecnológicas da área da biotecnologia na vida cotidiana, bem como seu impacto na sociedade.

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Este livro apresenta os elementos necessários para a compreensão das diferentes aplicações científicas e tecnológicas da área da biotecnologia na vida cotidiana, bem como seu impacto na sociedade.

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Técnicas de Biologia Molecular - Extração de Ácidos Nucleicos

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Reação em cadeia da polimerase: PCR convencional, RT-qPCR, Xpert

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Reação em cadeia da polimerase (PCR) (artigo) | Khan Academy

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Uma técnica utilizada para amplificar, ou fazer muitas cópias de, uma região de interesse específica do DNA.

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Eletroforese em gel (artigo) | Biotecnologia | Khan Academy

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Uma técnica utilizada para separar fragmentos de DNA e outras macromoléculas por tamanho e carga.

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O sequenciamento de DNA é o processo realizado para se determinar a sequência exata de nucleotídeos em uma molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico). Isso significa que, ao sequenciar um fragmento de DNA, será possível conhecer a sequência em que as quatro bases nucleotídicas (Adenina, Guanina, Citosina e Timina) ocorrem dentro dessa molécula de ácido nucleico.

A sequência nucleotídica é a base para o conhecimento de um gene ou genoma. Ela contém as informações sobre as propriedades hereditárias e bioquímicas da vida. Através dela é possível compreender a construção e estrutura das células e organismos.

O sequenciamento do DNA foi fundamental para que as informações genéticas começassem a ser desvendadas. Por essa razão, é indispensável para a pesquisa biológica.

A história do sequenciamento de DNA

Os últimos 100 anos testemunharam uma verdadeira revolução no entendimento de como a informação genética é armazenada, usada e transmitida.

Os trabalhos de Mendel, em 1850, foram capazes de demonstrar que as características são transmitidas por hereditariedade ao longo das gerações. Em 1944, o grupo do pesquisador Oswald Avery demonstrou que a transferência de informações entre organismos (no caso, bactérias) é viável e que ocorre pelo material genético, o DNA.

Já em 1953, a estrutura de dupla-hélice do DNA foi desvendada por James Watson e Francis Crick. Isso ajudou no desenvolvimento da biologia molecular e da engenharia genética.

Na década de 1970, Fred Sanger e Walter Gilbert desenvolveram as tecnologias de sequenciamento de DNA. Assim, tornaram possível que a informação genética começasse a ser desvendada.

Até então, a manipulação de genes individuais ou de pequenos trechos do DNA parecia uma tarefa insuperável. O sequenciamento permitiu compreender melhor a estrutura e a função dos ácidos nucleicos. Esse foi o ponto de partida para hoje ser comum isolar e estudar um trecho de DNA.

O legado de Frederick Sanger

Frederick Sanger foi responsável por dois dos mais importantes avanços técnicos na área de genética. Primeiro, no início da década de 50, ele desenvolveu um método para determinar a sequência de aminoácidos de um polipeptídio e o fez funcionar no sequenciamento de aminoácidos da insulina.

Este trabalho, finalizado em 1955, forneceu a primeira prova de que os aminoácidos em uma proteína estão presentes em uma sequência constante e geneticamente determinada. Isto deu aos biólogos moleculares a confiança em atacar outros problemas, tais como o código genético.

Então, em 1977, Sanger aperfeiçoou um método rápido de sequenciamento do DNA. Por essa razão, ficou conhecido como método de sequenciamento de Sanger. Abriu assim a porta para a análise da estrutura do gene e sua organização. Ambos os avanços foram valiosos e reconhecidos com prêmios Nobel, em 1958 e 1980.

O método desenvolvido por Sanger foi crucial para desenvolvimento do Projeto internacional do Genoma Humano.

O Projeto Genoma Humano

O Projeto Genoma teve como objetivo determinar a sequência de todo o genoma humano. Esse esforço de pesquisa internacional, custando mais de US $ 3 bilhões e levando 13 anos para ser concluído. A primeira sequência completa foi determinada em abril de 2003.

O DNA sequenciado no Projeto Genoma Humano foi obtido a partir de 21 doadores, homens e mulheres, de diferentes grupos étnicos. O resultado possibilitou avaliar muitas informações sobre as diferenças entre os indivíduos de uma mesma espécie.

Esse mapeamento abriu diversas fronteiras e forneceu meios para identificar mutações e doenças genéticas específicas. Pode determinar quais trechos de DNA contêm genes e quais trechos carregam instruções de regulação, ligando ou desligando os genes. Também abriu caminho para uma medicina mais personalizada, permitindo aos cientistas examinar até que ponto a resposta de um paciente a um medicamento é determinada pelo seu perfil genético.

Essas conquistas exigiram o desenvolvimento e aprimoramento de novas tecnologias, com a intenção de melhorar a eficácia dos cuidados de saúde e promover a saúde humana. Claro que a medicina totalmente personalizada ainda está longe de ser uma realidade para todos, mas estes já são os primeiros passos.

O método de sequenciamento de Sanger

O método de sequenciamento de DNA mais usado, até os dias de hoje, é o de Sanger. Também chamado de método didesoxi ou método de terminação de cadeia.

Nesse procedimento, uma molécula de DNA cuja sequência deve ser determinada é convertida em fitas simples que são utilizadas como molde para sintetizar uma série de fitas complementares. Cada uma dessas fitas termina aleatoriamente em um nucleotídeo específico diferente. A série resultante de fragmentos de DNA é separada por eletroforese e analisada para revelar a sequência do DNA.

Confira todas as etapas do método de Sanger

Nesse método são preparados quatro tubos de reação de sequenciamento (A, C, G, T), correspondendo a cada um dos quatro nucleotídeos. Cada tubo contém:

1. O molde de DNA a ser sequenciado;

2. A sequência do iniciador (primer);

3. DNA-polimerase;

4. Os quatro desoxinucleotídeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

5. Um didesoxinucleotídeo trifosfato marcado radiotivamente ou por um corante fluorescente (específico para cada tubo: tubo A tem ddATP, tubo G tem ddGTP, etc.);

6. O primer ou iniciador marcado é adicionado ao DNA unifilamentar cuja sequência é desconhecida.

7. A enzima DNA-polimerase adiciona bases livres ao DNA unifilamentar, usando o pareamento de bases complementares.

Ocorrem quatro reações diferentes, correspondendo aos quatro didesoxinucleotídeos marcados (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP). Eles terminam a sequência de DNA sempre que são incorporados, ao contrário do desoxinucleotídeo normal (dATP, dCTP, dGTP e dTTP, correspondentes às bases A, C, G e T, respectivamente).

Isso produz fragmentos com comprimentos variáveis, que podem ser separados por eletroforese.

A posição de cada fragmento no gel é indicada pela emissão de partículas radioativas do marcador, o que permite a leitura direta da sequência de DNA.

Embora o mesmo método básico seja ainda utilizado, vários aperfeiçoamentos ocorreram. O sequenciamento de DNA automatizado foi um deles.

Automação do método de Sanger

Os avanços técnicos possibilitaram automatizar o sequenciamento, trazendo melhorias para o método de Sanger.

Os equipamentos são capazes de misturar os reagentes, aplicá-los, fazer correr e ler a ordem das bases de nucleotídeos a partir de um gel. O uso de nucleotídeos terminadores de cadeia, marcados com agentes fluorescentes de cores diferentes, facilita esse processo.

As quatro reações de síntese podem ser realizadas no mesmo tubo e os produtos podem ser separados em uma única canaleta de gel por eletroforese capilar. Um detector lê e grava a cor do marcador fluorescente em cada banda à medida que ela passa. Assim a sequência pode ser analisada.

Sequenciamento de Nova Geração: Next-Generation Sequence (NGS)

Apesar de o método de Sanger ser utilizado até hoje, novas técnicas têm sido desenvolvidas para o sequenciamento de DNA. A mais recente é o sequenciamento de nova geração, também chamada de sequenciamento de segunda geração ou ainda Next-Generation Sequencing (NGS).

Através do NGS é possível realizar o sequenciamento de um genoma inteiro em questão de dias. A sua velocidade, capacidade de gerar dados em larga escala e precisão, a um custo inferior aos métodos tradicionais ganha, a cada dia, mais espaço.

O princípio básico das plataformas de NGS está em sequenciar várias moléculas diferentes (ou vários fragmentos diferentes provenientes do mesmo genoma) em paralelo. Logo, elas diferem fundamentalmente das metodologias de Sanger, em que uma única sequência de DNA, oriunda de um trecho específico, é obtida em cada reação. Isso é possível graças à integração de ferramentas de nanotecnologia, robótica e informática em aparelhos de alto desempenho.

A importância do sequenciamento

Hoje é possível, portanto, determinar mais rapidamente uma sequência completa de um genoma humano, diferente do período inicial do Projeto Genoma. Os pesquisadores agora são capazes de comparar grandes extensões de DNA (1 milhão de bases ou mais) de indivíduos diferentes, com mais agilidade.

Essas comparações podem gerar uma enorme quantidade de informações sobre o papel da herança na suscetibilidade a doenças e em resposta a influências ambientais. Abrem-se assim novas perspectivas para a medicina baseada nas características genéticas de cada indivíduo, criando um vasto potencial para diagnósticos e terapias.

Da mesma forma, é possível determinar todo o conjunto de microrganismos presente em um ambiente (microbioma) a partir do sequenciamento de todo o DNA ali encontrado. Ou até mesmo comparar as sequências do genoma de diferentes tipos de animais e organismos, fornecendo insights sobre a biologia do desenvolvimento e da evolução.

Referências

https://pt.khanacademy.org

http://www.ib.usp.br/biologia

Heather, J. M., & Chain, B. (2016). The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics, 107(1), 1-8.http://doi.org/10.1016/j.ygeno.2015.11.003

KLUG, William S., CUMMINGS, Michael R., SPENCER, Charlotte A., PALLADINO, Michel A. Conceitos de Genética. ArtMed, 2010.

BROWN, Terence A. Genética - Um Enfoque Molecular, 3ª edição. Guanabara Koogan, 1999.

SCHAEFER, G. Bradley, THOMPSON, James. Genética Médica. AMGH, 2015.

OSÓRIO, Maria Lucena, ROBINSON, Wanyce Miriam. Genética Humana. ArtMed, 2013.

MENCK, Carlos M. Genética Molecular Básica. Guanabara Koogan, 2017.

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Sequenciamento de DNA: Desvendando o código da vida

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O sequenciamento de DNA é o processo realizado para se determinar a sequência exata de nucleotídeos em uma molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico). Isso significa que, ao sequenciar um fragmento de DNA, será possível conhecer a sequência em que as quatro bases nucleotídicas (Adenina, Guanina, Citosina e Timina)...

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Sequenciamento de DNA (artigo) | Khan Academy

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Como a sequência de bases de nucleotídeos (As, Ts, Cs, and Gs) de um pedaço de DNA é determinada.

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Curso NGS - Sequenciamento de DNA de próxima geração - módulo 20 - Filogenia

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Estrutura e replicação de DNA | Biologia | Khan Academy

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Na notícia a seguir foi encontrado uma relação em até um terço dos pacientes com COVID-19 estavam tendo também trombose, agindo de maneira totalmente oposta a doenças como a dengue por exemplo em que a coagulação é prejudicada. A ação médica dos pacientes com esses sintomas tem sido o uso de anticoagulantes.

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Além dos pulmões, o novo coronavírus (SARS-CoV-2) pode afetar inúmeros órgãos e causar uma série de complicações, como casos de trombose. Isso porque o vírus da COVID-19 desencadeia distúrbios no processo de coagulação do sangue e o intensifica. Mesmo que seja uma condição grave, os pacientes podem ser tratados e, geralmente, se recuperarem, desde que a descoberta seja feita de forma precoce.

Sobre a formação de coágulos em pacientes da COVID-19, um recente estudo brasileiro conduzido por uma equipe multidisciplinar - com especialistas em terapia intensiva, cardiologia, hematologia, virologia, patologia, imunologia e biologia molecular -, incluindo pesquisadores da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), verificou que o coronavírus atua de forma a favorecer a formação de coágulos (trombos) e que podem obstruir a circulação. Por isso, o grupo sugere mudar a classificação da doença para febre viral trombótica.

COVID-19 podem desencadear casos de trombose em pacientes infectados (Imagem: Reprodução/iLexx/Envato Elements)

O que é trombose e quais são os fatores de risco?

Vale explicar que a trombose é uma condição clínica, onde ocorre a formação de um coágulo sanguíneo. Em outras palavras, é possível visualizar uma massa quase sólida formada em alguma veia e artérias do corpo do paciente. Na maioria dos casos, essa formação ocorre na parte inferior da perna, na coxa ou na pelve do paciente. Em situações mais graves, o paciente enfrenta uma embolia pulmonar, ou seja, este coágulo percorre os vasos sanguíneos do corpo, chegando aos pulmões, onde pode ser fatal, independente da COVID-19.

Para um caso de trombose, existem inúmeros fatores de risco, como a redução da velocidade do fluxo sanguíneo em decorrência de um imobilização prolongada e até mesmo o uso de pílulas anticoncepcionais, já que promovem o aumento de um hormônio sexual chamado estrogênio. Além disso, outras condições como obesidade, histórico familiar e idade podem favorecer ou não a formação de trombos.

De acordo com nota divulgada pela Secretaria de Saúde de Minas Gerais, metade das pessoas com trombose não apresentam sintomas. No entanto, os pacientes podem verificar, em alguns casos, dor, inchaço e vermelhidão na área de formação do coágulo. Agora, a embolia pulmonar também pode ou não manifestar sintomas, sendo os mais comuns: irregularidade nos batimentos cardíacos; dificuldade na respiração; dor no peito com tosse; ou ainda tosse com sangue.

Relação entre trombose e a COVID-19

De acordo com as análises de casos da COVID-19, a trombose pode afetar até um terço dos pacientes infectados pelo coronavírus e internados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs). No entanto, os mecanismos que levam a evolução de um quadro da doença viral para a formação de coágulos ainda não são completamente conhecidos pela ciência, o que se sabe é que o risco é aumentado através da infecção.

Enquanto isso, outras infecções virais, inclusive, agem de maneira oposta. Por exemplo, agentes causadores da dengue e da febre amarela prejudicam a coagulação e, para isso, provocam sangramentos nos casos mais graves, pois impedem a coagulação. Devido a essa evolução do quadro, as duas doenças são consideras febres virais hemorrágicas. No caso da COVID-19, a situação é bastante diferente, o que é favorecido é a formação de trombos e a hipercoagulação.

Para o tratamento de casos da COVID-19 e de trombose simultâneos, um dos protocolos médicos adotados é o uso de anticoagulantes, principalmente para casos onde há a internação hospitalar. Lógico, sempre avaliando o quadro individualmente.

Fonte: Secretaria de Saúde de Minas Gerais

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Trombose e COVID-19: qual a relação entre as duas doenças?

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Além dos pulmões, o novo coronavírus (SARS-CoV-2) pode afetar inúmeros órgãos e causar uma série de complicações, como casos de trombose. Isso porque o vírus da COVID-19 desencadeia distúrbios no processo de coagulação do sangue e o intensifica. Mesmo que seja uma condição grave, os pacientes podem ser tratados e, geralmente, se recuperarem, desde que a descoberta seja feita de forma precoce.

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Nesse seminário foi apresentado diversos medicamentos e as respostas medicamentosas em tratamentos para a Covid-19 em que a maioria é metabolizado pela enzima CYP3A4

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Abordagem Farmacogenética para a Melhoria do Tratamento COVID-19

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Trabalho abordando as avançadas técnicas de bioinformática para obter novas percepções sobre os mecanismos moleculares mais complexos da resistência antimicrobiana

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Abordagens de bioinformática para a compreensão de mecanismos moleculares na resistência antimicrobiana - grupo I

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Seminário envolvendo a resistência de bactérias a seus antibióticos em relação a pacientes hospitalizados e a preocupação global a perda de efeitos de antibióticos mais antigos devido a resistência antimicrobiana

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Seminário apresentando os biomarcadores do câncer que são macromoléculas presentes no tumor, sangue ou outros fluidos corporais, cujo aparecimento está relacionado com o crescimento de células neoplásicas com diversas funções na evolução do caso clínico como: avaliar o estadiamento da doença, a evolução do tratamento e determinar se existe doença residual ou recidiva após o tratamento.

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Trabalho envolvendo biomarcadores de câncer mas entrando especificamente nos melanomas: tumores malignos formados a partir de melanócitos, e mostrando a técnica FISH na diferenciação direta das outras lesões melanocíticas, entre outras técnicas

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Prova composta por 20 questões objetivas incluindo as múltiplas técnicas de Biologia Molecular, com questões de PCR, qPCR Eletroforese e biossegurança. A prova foi tranquila de se realizar com questões bem elaboradas e com um nível moderado de dificuldade.

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Aplicações práticas dos métodos de biologia molecular ao diagnóstico clínico I introduzindo a farmacogenética

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Aplicações práticas dos métodos de biologia molecular ao diagnóstico clínico II

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Nesta aula tivemos como convidada a Dra. Ludmila do LACEN/RS que trouxe sua experiência clínica de diagnóstico molecular para compartilhar conosco, adorei a apresentação e saber sobre como é a rotina dentro de um laboratório.

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Nesta aula a profe trouxe como convidado o biomédico Gabriel que explicou de forma muito clara e espontânea todo seu trabalho e caminhada como biomédico

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Aula presencial sobre extração de ácidos nucleicos

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Aula presencial sobre extração de ácidos nucleicos

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AULA PRÁTICA 1- PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO

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PCR, Eletroforese, PCR em tempo real e visita a TecnoUnisc

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PCR, Eletroforese, PCR em tempo real e visita a TecnoUnisc

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biologia molecular e o tratamento de doenças crônicas

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SLIDES BIOLOGIA MOLECULAR- LAURA E ALICE (1)

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Epidemiologia Molecular e resistência microbiana

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Epidemiologia Molecular e resistência microbiana

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Um vídeo de autoria da Dra. Diana Noronha Nunes e dos doutores Emmanuel Dias Neto e Israel Toja da Silva, todos pesquisadores ligados ao Centro Internacional de Pesquisa (CIPE), do A.C. Camargo Center Cancer, explica como surgem as variantes genômicas do SARS-CoV-2, vírus causador da Covid-19.

Confira abaixo o conteúdo disponibilizado também no YouTube, pelo link https://www.youtube.com/watch?v=h-LDU74yYcA.

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Vídeo explica como surgem variantes genômicas do SARS-CoV-2

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Um vídeo de autoria da Dra. Diana Noronha Nunes e dos doutores Emmanuel Dias Neto e Israel Toja da Silva, todos pesquisadores ligados ao Centro Internacional de Pesquisa (CIPE), do A.C. Camargo Center Cancer, explica como surgem as variantes genômicas do SARS-CoV-2, vírus causador da Covid-19.

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Volume 6 , Number 6
2 November 2018

ABSTRACT

In infectious disease epidemiology, the laboratory plays a critical role in diagnosis, outbreak investigations, surveillance, and characterizing biologic properties of microbes associated with their transmissibility, resistance to anti-infectives, and pathogenesis. The laboratory can inform and refine epidemiologic study design and data analyses. In public health, the laboratory functions to assess effect of an intervention. In addition to research laboratories, the new-generation molecular microbiology technology has been adapted into clinical and public health laboratories to simplify, accelerate, and make precise detection and identification of infectious disease pathogens. This technology is also being applied to subtype microbes to conduct investigations that advance our knowledge of epidemiology of old and emerging infectious diseases. Because of the recent explosive progress in molecular microbiology technology and the vast amount of data generated from the applications of this technology, this Microbiology Spectrum Curated Collection: Advances in Molecular Epidemiology of Infectious Diseases describes these methods separately for bacteria, viruses, and parasites. This review discusses past and current advancements made in laboratory methods used to conduct epidemiologic studies of bacterial infections. It describes methods used to subtype bacterial organisms based on molecular microbiology techniques, following a discussion on what is meant by bacterial "species" and "clones." Discussions on past and new genotyping tests applied to epidemiologic investigations focus on tests that compare electrophoretic band patterns, hybridization matrices, and nucleic acid sequences. Applications of these genotyping tests to address epidemiologic issues are detailed elsewhere in other reviews of this series.

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Published In

Volume 6 * Number 6 * 2 November 2018

Editor: Michael Sadowsky

BioTechnology Institute, University of Minnesota, St. Paul, MN

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Contributors

Author

Division of Infectious Diseases and Vaccinology, School of Public Health, University of California, Berkeley, CA 94720

Editor

BioTechnology Institute, University of Minnesota, St. Paul, MN

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Laboratory Methods in Molecular Epidemiology: Bacterial Infections* | Microbiology Spectrum

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In infectious disease epidemiology, the laboratory plays a critical role in diagnosis, outbreak investigations, surveillance, and characterizing biologic properties of microbes associated with their transmissibility, resistance to anti-infectives, and pathogenesis. The laboratory can inform and refine epidemiologic study design and data analyses. In public health, the laboratory functions to assess effect of an intervention.