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Sur les conseils de ces peintres éminents, Rubens part pour l'Italie de 1600 à 1608 pour étudier les œuvres de la Renaissance. Il séjourne notamment à Gênes, Mantoue, Venise et Rome où il assimile les styles et copie les œuvres de Raphaël, du Caravage, et surtout du Titien dont il retient la fougue du coloris. Il s'installe ensuite dans la ville de Mantoue, sous la protection du cardinal Montalto au service du duc Vincent de Gonzague chez qui il devient peintre de cour. Rubens réalise son premier chef-d'œuvre, Sainte Hélène à la Vraie Croix pour la basilique Sainte-Croix-de-Jérusalem.

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De 1606 à 1608, il demeure principalement à Rome et, pendant cette période, Rubens obtient, avec l'aide du cardinal Jacopo Serra, sa plus importante commande à l'époque pour le maître-autel de la nouvelle église en vogue, la Chiesa Nuova également appelée Santa Maria in Vallicella.Le sujet en est le pape Grégoire le Grand ainsi que des saints locaux majeurs adorant l'icône de la Vierge et l'Enfant. La première version de ce tableau est une toile qui est actuellement au musée des beaux-arts de Grenoble, et qui est immédiatement remplacée par une seconde version sur trois panneaux en ardoise représentant l'image miraculeuse de la Santa Maria in Vallicella qui est montrée au public lors des fêtes religieuses grâce à un couvercle en cuivre amovible, également peint par l'artiste

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À Gênes, Rubens peint de nombreux portraits tels que le Portrait de Brigida Spinola Doria conservé à la National Gallery de Washington, et le Portrait de Maria Serra Pallavicino, dans un style qui influence plus tard des artistes tels que Van Dyck, Reynolds et Gainsborough

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il étudie l'art classique grec et romain et il réalise des copies de grands maîtres italiens. Il est particulièrement influencé par la sculpture hellénistique Le Groupe du Laocoon, mais aussi par les œuvres d'art de Michel-Ange, Raphaël et Léonard de Vinci Il est également influencé par les peintures plus modernes et naturalistes du Caravage dont il copie d'ailleurs plus tard le tableau La Mise au tombeau

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Il retourne en Italie en 1604, où il reste pendant les quatre années suivantes, d'abord à Mantoue, puis à Gênes et à Rome où il s'illustre dans la peinture religieuse, des scènes mythologiques et de portraits.