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Bromuro de Etidio (BrEt)

Agente intercalante  que se usa como colorante fluorescente para la visualización de ácidos nucleicos en geles de agarosa y  poliacrilamida.

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Ana Lucía Valdez García

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Utilizado para separar moléculas en función de su carga, tamaño y forma.

Medio de separación especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, ARN y las proteínas.

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1.- Se disuelve polvo de agarosa en una solución tampón hirviente.
2.- Se deja enfriar la solución a 55°C y se vierte en un soporte, donde se solidifica.
3.- Se sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de electrodos que contiene solución tampón.

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1.- Estas se mezclan con componentes que les agregan densidad, como el glicerol o la sacarosa.
2.- Las muestras se colocan por medio de una micropipeta o pipeta de transferencia en las rendijas visibles en el gel con la ayuda de una plantilla.
3.- Las muestras se sumergen en la solución tampón y permanecen en los pocillos.
4.- El equipo de electroforesis se conecta a una fuente de corriente continua directa y se somete a tensión.
5.- Las moléculas cargadas contenidas en las muestras penetran en los capilares del gel.
6.- Las moléculas de carga neta negativa migran hacia ánodo,
mientras que las moléculas de carga neta positiva migran hacia el cátodo.

* Cuanto más fuerte sea el campo eléctrico, mas rápido migran las moléculas.
* El tampón sirve para conducir la electricidad y para controlar el pH.
* El pH tiene una influencia sobre la carga y la estabilidad de las moléculas biológicas.

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Técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN.

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Una combinación de fuerza eléctrica y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología de diferentes moléculas.

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Disuelven en el buffer a 90-95 °C.
Solidifican a 35-45 °C.

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Disuelven a 65 °C.
Solidifican a 30-35 °C.

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Agarosas de alta fuerza de gel o la de baja viscosidad

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Agarosas de alta fuerza de gel o la de baja viscosidad

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Permiten una mejor separación.
Rango inferior del tamaño de las moléculas a separar.

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Parámetros que determinan el rango de tamaños en los qeu obtendremos una buena separación de los fragmentos de ADN

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Tampón utilizado para aplicaciones de electroforesis en gel de agarosa que requieren una alta resolución y separación de ADN bacteriano de alto peso molecular.

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Electrodo en la parte negativa.

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Electrodo en la parte positiva.

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El gel debe colocarse con las muestras en dirección al cátodo.

El ADN deberá migrar hacia el ánodo y de esa manera separar la muestra.

Es importante que para poder realizar la cuantificación se pueda colocar un marcador de peso molecular.

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Mezcla de ADN con peso molecular conocido

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Mezcla de ADN con peso molecular conocido

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Utilizado para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN.

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Detecta una señal quimioluminiscente mediante una cámara CCD super-enfriada.
El ChemilDoc XRS+ le permite documentar geles de proteínas teñidos con colorante fluorescente y visibles.
Tiene una software para observar geles y tomar fotos que pueden ser editables.

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Permite observar el gel directamente.
Primero se tiñe el gel para observar las bandas expuestas a la luz UV.

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TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA)

El TAE tiene una menor capacidad de amortiguación que el TBE.

Puede resultar en una acidificación del medio si la electroforesis se desarrolla durante un periodo muy prolongado, pero funciona muy bien con tiempos normales de electroforesis.

Además tiene una mayor capacidad de resolución que el TBE para tamaños grandes de ADN.

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Absorbe luz ultravioleta de λ ≈ 300 nm.

Emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante la cual podemos observar la posición y cantidad relativa del ADN en el gel tras la electroforesis.

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Se prepara a una concentración de 10 mg/ml en agua.

Se conserva a temperatura ambiente o a 4°C en un tubo envuelto en papel de aluminio.

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1.- Preparar el gel con BrEt incorporado.

2.-Teñir el gel una vez finalizada la electroforesis con una solución de BrEt.

* La concentración final del BrEt en el gel o en la solución de teñido debe ser de 0.5 µg/ml (en ambos casos).

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Ambos suelen prepararse como soluciones concentradas, que pueden almacenarse a temperatura ambiente.

Estas se diluyen con agua antes de cada electroforesis para lograr la concentración de uso: 1x para el TAE y 0.5x para el TBE.

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Alta densidad que permita que la muestra se introduzca en el pocillo del gel.

Además de colorantes que nos indiquen cuando debe detenerse la electroforesis.

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Buffer de carga tipo I (6x):
0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 40% sacarosa, en agua. Almacenar a 4°C.

Buffer de carga tipo II (6x):
0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 30% glicerol, en agua. Almacenar a 4°C.

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Alternativas a la tinción con BrEt

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Colorante muy sensible con una elevada afinidad por el ADN, que puede detectar cantidades de tan sólo 20 pg de ADN.

Se utiliza en una dilución 1/10 000 en agua para el teñido del gel tras la electroforesis.

Recomendable para la deetección de cantidades muy pequeñas de ADN que no sean detectables mediante tinción con BrEt.

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Sensibilidad similar al BrEt, pero menor capacidad mutagénica.

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Alta sensibilidad.