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La mayoría de las proteínas muestran una
absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano.

Ya que las concentraciones de estos
aminoácidos en las proteínas es constante se puede utilizar la absorbancia a 280nm para estimar su concentración

Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación.

Este método se recomienda para proteínas
puras, ya que se considera el coeficiente de extinción molar (es un parámetro específico para cada proteína) para obtener la cantidad de proteína

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Los ensayos colorimétricos para proteínas se basan en el hecho de que ciertos iones metales y colorantes se unen a las proteínas en una proporción de masa específica, y al unirse se vuelven intensamente coloreados.

Dentro de un rango específico de concentración de proteína, estos reactivos darán lugar a una banda de absorción cuya intensidad es linealmente proporcional a la concentración de proteína de una solución en masa/ unidades de volumen.

Los tres métodos más utilizados son:

• Ensayo de Biuret
• Ensayo de Lowry
• Ensayo de Bradford.

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Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

Una manera de evaluar el protocolo de purificación es conociendo la cantidad de proteína total de la muestra, desde que se clarifica el extracto hasta que se obtiene pura (rendimiento expresado en porcentaje).

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Dentro de una fluctuación limitada entre los 0 y los 40oC aproximadamente, la mayor parte de la solubilidad de
las proteínas globulares aumenta al aumentar la temperatura, aunque existen algunas excepciones, como
ocurre con los electrolitos sencillos.

Por encima de los 40 y los 50oC, la mayor parte de las proteínas aumentan en inestabilidad y comienzan a
desnaturalizarse, generalmente con pérdida de solubilidad en la zona neutra de pH.

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La precipitación de proteínas con alta concentración de sal es una alternativa recurrente en la purificación de
proteínas cuando se trata de extractos muy complejos (gran número de proteínas), o cuando se manejan volúmenes grandes de la muestra, incluso se convierte en una alternativa para clarificar extractos.

Un primer paso de separación es el de la precipitación con sulfato de amonio. Esta técnica se basa en el hecho de que la solubilidad de la mayor parte de las proteínas está disminuida en. altas concentraciones salinas.

A medida que la concentración de sal se eleva, se alcanza un punto en el cual la proteína pierde su solubilidad y precipita.

La concentración de sal que se requiere para este efecto de desplazamiento salino varia de proteína a proteína y por consiguiente es utila para usar en el fraccionaiento de una mezcla de proteínas.
Por ejemplo, 0.8 M de sulfato de amonio hacen precipitar la proteínafibrinogeno del suero, en tanto que 2.4 M es la cantidad requerida para precipitar albumina.

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La solubilidad es la medida de la capacidad de disolverse una cierta sustancia en un determinado medio, a una temperatura y presión determinadas.

La solubilidad de una proteína depende de los residuos de aminoácidos ionizados, regiones polares e hidrofóbicas que están en contacto con el solvente (agua), generando una capa de moléculas de agua
(capa de solvatación).

Cuando la interacción de la proteína con la capa de solvatación se interrumpe por un aumento en la entropía del sistema, entonces la proteína se precipita, esto se logra con solventes, sales o cambios
en el pH.

Altas concentraciones de sales se usan de manera común para precipitar proteínas, los iones compiten con las proteínas por las moléculas de agua en la capa de solvatación, hasta que la proteína
pierde la interacción con la capa de solvatación.

A este fenómeno se le llama en inglés “saltig out ”, cuando la proteína es soluble en presencia de
bajas concentraciones de sales, se denota “salting in ”

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La función de la proteína de interés es determinante durante el proceso de purificación.
• Considerando que la muestra se dividirá en fracciones a lo largo de todo el proceso de purificación, la identificación de la proteína de interés será mediante su función, o alguna característica que se pueda monitorear.
• Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad biológica) (específico, sensible, rápido y barato)
-Ensayos enzimáticos
-Efectos biológicos
-Inmunoensayos

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A lo largo del proceso de purificación, deben seguirse determinados pasos para asegurar que la
proteína de interes no se inactive o desnaturalice por factores físicos o biológicos.
• El pH de las soluciones debe amortiguarse a un pH el cual la proteína sea estable
• La temperatura debe mantenerse por debajo de los 25 C en general cerca de los 4 C para evitar su
desnaturalización térmica.
• Reducir al minimo la actividad de las proteasas

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La proteína debe estar en solución
• La solubilización de proteínas es el proceso de romper las interacciones involucradas en la agregación de las
proteínas, que incluyen enlaces disulfuro, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, interacciones
iónicas e interacciones hidrofóbicas.
• Si no se evitan estas interacciones, las proteínas pueden agregarse o precipitarse, lo que da como resultado
artefactos o pérdida de muestras.

Detergentes: Los detergentes interrumpen las interacciones
hidrofóbicas entre y dentro de las proteínas. Algunas proteínas, especialmente las proteínas de membrana, requieren detergentes para la solubilización durante el aislamiento, así como para mantener la solubilidad.
Agentes reductores: Los agentes reductores de tiol como el 2-mercaptoetanol βME y el ditiotreitol (DTT) interrumpen los enlaces disulfuro intramoleculares e intermoleculares y mantienen a las proteínas en sus estados completamente reducidos.

Agentes caótropicos: Un agente caotrópico es una sustancia que desorganiza la red tridimensional del agua influyendo en la organización de sus moléculas a través de sus enlaces de
hidrógeno.

Buffer y sales: Muchas proteínas son más solubles a un pH más alto, por lo que a menudo se incluye Tris base para elevar el pH.

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Antes de intentar purificar una proteína hay con considerar la fuente del material de inicio.
• De qué tipo de célula proviene---¿dondé es mas abundante?
• De qué parte de la célula---¿algunas fuentes son mas accesibles que otras?
• En el caso de proteína intracelular puede estar a muy baja concentracion y acompañada de
millares de proteínas y otras macromoleculas.
• En el caso de proteínas extracelulares pueden estar en baja concentración y también acompañadas o ser el principal producto extracelular.
• Con el uso de técnicas de DNA recombinante muchas proteínas pueden expresarse en células
bacterianas y eucariontes y de manera subsecuente obtenerse cantidades relativamente grandes
de proteínas.

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1. CONOCIMIENTO DE LAS CARACTERISTICAS BIOLOGICAS (QUIMICAS Y FISICOQUIMICAS)

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1. CONOCIMIENTO DE LAS CARACTERISTICAS BIOLOGICAS (QUIMICAS Y FISICOQUIMICAS)

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Se de suma importancia conocer las propiedades bioquímica y físico- químicas, secuencia de aminoácidos, carga,
peso molecular, hidrofobicidad, función, incluso qué moléculas y parámetros físicoquímicos pueden
modificar estas propiedades así como los mecanismos por el cual llevan a cabo esta alteración de la molécula.

• La función de la proteína de interés es determinante durante el proceso de purificación.
• Considerando que la muestra se dividirá en fracciones a lo largo de todo el proceso de purificación, la
identificación de la proteína de interés será mediante su función.