# data[].attributes.body
Auftrennen der DNA- Fragmente anhand ihrer Größe

Vorbereitungen:

Agarose- Gel (Zucker) wird in eine Kunststoffbehälter mit einem Slotkamm gegeben

Nach Festigung des Gels wird der Slotkamm entfernt

—> Gruben entstehen

Gel wird von einem Strom leitenden Puffer überflutet

Ablauf:

DNA wird mit Bromphenolblau gefärbt

DNA wird in die Slots gefüllt

1. Slot = Längenstandard/Leiter  —> DNA einer bekannten Mischung

In die weitern Slots kommen die unbekannten DNA- Probe

Letzter Slot = Negativ Kontrolle

DNA- Fragmente wandern von der Katode zur Anode, da sie negativ geladen sind

Kurze Stücke wandern schneller und weiter als lange, da sie besser dich die Poren des Gels durchkommen

Dünne Banden = wenig DNA- Produkt

Dicke Banden = viel DNA- Produkt

Abhängig von den Zyklen bei der PCR

1-2 Stunden warten

# data[].attributes.body
-       DNA-Doppelstrang von zwei zu vergleichenden Lebewesen wird auf über 90°C erhitzt

->zerfällt somit in zwei Einzelstränge

-       Bei der Abkühlung werden beide Einzelstränge zusammengefügt

-       Kommt es zur Verbindung zweier Einzelstränge mit nur teilweise komplementären Basensequenzen, nennt man dies Hybridisierung

-       Je höher die Anzahl der komplementären Basensequenzen, desto schneller bildet sich der neue DNA-Doppelstrang und ist umso hitzeresistenter

->eine hohe Schmelztemperatur ist somit ein Indiz für einen hohen Verwandtschaftsgrad

Beispiel:
DNA                     Schmelzpunkt (°C)
Mensch                88,2°C
Schimpanse        88,2°C
Gorilla.                  88,2°C

Hybrid-DNA       Schmelzpunkt (°C)
Mensch-Schimpanse -> 86,4°C
Mensch-Gorilla.           -> 85,8°C

=> Mensch und Schimpanse sind näher verwandt als Mensch und Gorilla

# data[].attributes.headline
PCR = künstliche Vervielfältigung der DNA (Luise)

# data[].attributes.subject
PCR = künstliche Vervielfältigung der DNA (Luise)

# data[].attributes.body
- Vervielfältigung kleinster DNA-Proben

- Benötigt werden:

1. die zu vervielfältigende DNA

2. die vier DNA-Nucleotide

3. zwei Primer

4. die Taq-Polymerase (spezielle DNA-Polymerase)

- Läuft nach dem Prinzip der DNA-Replikation ab

-> Zyklen mit wiederholenden Schritten

1. Denaturierung: Erwärmung auf ca. 95 °C:

- Trennung der DNA-Doppelhelix in zwei Einzelstränge

2. Hybridisierung: bei ca. 60 °C:

- Anlagerung der zwei Primer

3. Polymerisation: Temperaturoptimum der Taq-Polymerase (72 °C):

- Neue Synthese erfolgt

- Bildung eines jeweils von den Primern ausgehender Strang in Richtung von 5‘ nach 3‘ durch die Taq-Polymerase

- Erneute Denaturierung: Abbruch der Replikation

- DNA-Stränge als Einzelstränge

- Wiederholen des Zyklus

- Nach 20 Zyklen -> mehr als eine Million DNA-Kopien
- Als gute Wiederholung dient natürlich auch der PCR-Song 😉

# data[].attributes.body
Antikörper wirken spezifisch gegen Antigene → Phänomen lässt sich nutzen, um Ähnlichkeit von Proteinen zu bestimmen

Bspw. Verwendung von im Blutserum gelösten Eiweißen (Serumproteine) → je ähnlicher diese denjenigen sind, gegen die die  gebildet wurden, desto stärker ist die Präzipitation

Ablauf:

Injektion des Serums z.B. eines Menschen, also die Blutflüssigkeit ohne Blutzellen und Gerinnungssubstanzen, in ein Tier, meist Kaninchen

Immunsystem des Kaninchens bildet Antikörper, die spezifisch gegen Serumproteine des  Menschen wirken

Vermischung des Kaninchenserums mit „Anti-Mensch-Antikörpern“ mit Seren anderer Tiere, die getestet werden sollen

Je ähnlicher die tierischen Serumproteine den menschlichen sind, desto stärker werden sie von den durch das Kaninchen gebildeten Antikörpern ausgefällt (präzipitiert) → es entstehen Agglutinationen (durch Antigen-Antikörper-Reaktion bewirkte Verklumpen partikulärer Antigene)

als Bezugsgröße dient die Ausfällung von menschlichen Sperumproteinen (=100%)

-      Nachteil= ähnliche Proteine könnten sich auch konvergent entwickelt haben, sodass der Test ungenauer als andere Verfahren ist.

# data[].attributes.body
Die molekulare Uhr ist in der Genetik ein Begriff, um den Zeitpunkt der Aufspaltung zweier Arten von einem gemeinsamen Vorfahren zu bestimmen. Dadurch kann die Evolutionsdauer abgeschätzt werden. Je mehr Mutationen entstanden sind, desto länger hat die Entwicklungszeit der Arten angedauert. Durch Sequenzvergleiche von Genen und Proteinen der Arten kann bestimmt werden, ob die Arten miteinander verwandt sind. Die Analyse der DNA- Sequenzen erstrecke sich meist über die nichtcodierenden Bereiche von Genen, da deren Evolutuion schneller verläuft und Mutationen nicht zur Veränderung von Genprodukten führen.

# data[].attributes.body
Proteine, die sich
bestens für molekulare Uhren eignen, sind z. B. Cytochrom c, Hämoglobin und Fibrin, da sie eine Schlüsselposition im Stoffwechsel der Lebewesen haben und grundsätzlich konservativ bewahrt werden.

# data[].attributes.body
zentraler Bestandteil der Atmungskette in den Mitochondrien aller Eukaryoten -> wichtige Funktion in der Zellatmung

ca. alle 100 Millionen Jahre eine Mutation zu erwarten, die keine Funktionsverschlechterung darstellt -> Träger können sich weiter fortpflanzen

je ähnlicher sich die Aminosäuresequenzen zweier Arten sind, desto näher sind sie miteinander verwandt

Daher kann beim Vergleich von Proteinen verschiedener Arten anhand der Anzahl der Unterschiede der Zeitpunkt der Trennung bestimmt werden

Unterschiede in den Aminosäuren und die zeitliche Auseinanderentwicklung einiger Organismengruppen, dargestellt am Cytochrom c:

# data[].attributes.body
Danach wird der Behälter mit UV- Licht bestrahlt und man kann die DNA- Banden sehen und auswerten

# data[].attributes.body
Methode zur Bestimmung von unterschiedlicher DNA-Mengen und zur Bestimmung relativer Änderungen der Genexpression

Genexpression ---> Ausprägung des Genotyps, also welche Gene aktiv sind

1. mRNA wird isoliert aus zwei Zellen (von beispielsweise zwei unterschiedlichen Geweben)

man benötigt die aktive Sequenz der DNA, deshalb braucht man auch die mRNA

2. Reverse Transkriptase (Enzym) stellt complementaryDNA, also cDNA, her (komplementär zu mRNA)

DNA=komplett mit aktiver und inaktiver Sequenz

mRNA= nur aktive Sequenz der DNA (Exons)

cDNA= exakte Kopie der DNA ohne die inaktive Sequenz

3. Markierung der cDNA mit fluoreszierender Farbe

4. In jedes Feld des Genchips kommt cDNA von beiden Geweben

Genchip enthält viele kleine Felder mit Gensonden

Gensonden sind kurze Basenabfolgen der DNA

5. Abschnitte der cDNA, die komplementär zu den Gensonden sind, hybridisieren (binden)

Bsp. cDNA besitzt die Abfolge GUCAAU, dann bindet sie sich an die Abfolge CAGTTA der Gensonde

6. Anschließend wird der DNA-Chip abgespült

am Ende durchleuchtet man die einzelnen Felder und sieht, welches Gewebe seine Spuren hinterlassen hat durch die fluoreszierende Farbe

7. Man erkennt, welche Abfolge der Gensonden aktiv in welchem Gewebe ist, und wenn beide Gewebe in derselben Gensonde hybridisiert haben, hat es die Farbe, die entsteht, wenn man beide fluoreszierenden Farben, die man verwendet hat, mischt. Bsp.: Das eine Gewebe ist rot markiert und das andere blau dann erscheint es lila

# data[].attributes.body
Gen-Datenbanken sind eine Spezialisierung von Biobanken. Biobanken ist eine Sammlung von Stoffen, Körperflüssigkeiten und Geweproben die zu bestimmten Organismen zusortiert und gespeichert werden. Biobanken kann man in verschiedenen Bereichen anlegen, z.B der Humanmedizin um Krankheitsverläufe von unterschiedlichen Krankheiten zu dokumentieren, Einfluss von Umweltfaktoren auf Krankheiten zu untersuchen und verschiedene Individuen mit ihren Krankheiten zu vergleichen. Gen-Datenbanken speichern ausschließlich Genetische Informationen von Organismen, wie z.B ein DNA-Profil von Personen. (Genetischer Fingerabdruck). Verwendung finden Gen-Datenbanken in der Strafverfolgung, in der Medizin, von der Verträglichkeit von Organtransplantationen und in der Biologie zur Rüclverfolgung von Verwandschaftsfragen von Spezies.

# data[].attributes.body
- Methode, bei der die Abfolge der Aminosäuren, die ein Protein/ Peptid hat, ermittelt wird.
- Über die Abfolge der Aminosäuren kann auch auf die DNA-Sequenz geschlossen werden (Code-Sonne).

Ermittlung der Abfolge der Aminosäuren:
Edman-Abbau- Methode(Klassisch):
- Wird in einem sogenannten Protein-Sequenator durchgeführt:
Dort wird von dem Protein schrittweise immer eine Aminosäure (beim N-Terminal beginnend) abgespalten und anschließend identifiziert.
Schlack-Kumpf-Abbau:
Dasselbe nur dass beim C-Terminal* des Proteins begonnen wird.

Massenspektrometrisches Verfahren: (häufig verwendet, weil das zu analysierende Protein wenig Vorraussetzungen haben muss)
1.Proteine werden ionisiert (Elektrospray- Ionisation) (→ Vorgang, bei dem aus einem Atom/Molekül ein oder mehrere Elektronen entfernt werden, sodass das Atom/Molekül als positiv geladenes Ion (Kation) zurückbleibt)

2.Ionen werden durch ein elektrisches Feld stark beschleunigt, so gefiltert und dem sogenannten Massenspektrometer hinzugefügt
3.Dort werden die Teilchen nach dem Maße-zu-Ladungs-Verhältnis sortiert
4.Das Gerät kann nun die ionisierten Aminosäuren registrieren

Evolutionsaspekt:
Je ähnlicher die Aminosäuresequenzen zweier Organismen zueinander sind, desto näher verwandt sind sie miteinander. Auf Basis dieses Wissens können Stammbäume erstellt werden.

# data[].attributes.body
Definition
->DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül
->nennt man auch Kettenabbruchmethode
- Basenfolge ist von Interesse
- wird genutzt zur Untersuchung genetisch bedingter Krankheiten und Entwicklung neuer Impfstoffe

# data[].attributes.body
Mitochondrien-DNA (mtDNA): wird besonders häufig genutzt, da maternale Vererbung, also nur über mütterliche Linie und durchläuft keine Meiose oder Rekombination

Vererbung ist leichter rekonstruierbar, Verwandtschaftsgruppen können schneller aufgedeckt werden

mtDNA mutiert mit sehr konstanter Rate, sodass man relativ genau sagen kann wie nah (zeitlich) zwei Organismengruppen verwandt sind, d.h. wann sich Vorläufer dieser Stämme trennten

Nicht codierender, hochvariabler Bereich auf der mtDNA wird für Analyse bevorzugt

# data[].attributes.body
-Definition
->DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül
->nennt man auch Kettenabbruchmethode

-Ablauf

1. Vervielfältigung durch PCR:
-> DNA wird künstlich repliziert (DNA-Replikation)
2.Denaturierung:
->DNA wird in zwei Einzelstränge aufgespalten , durch die Erhitzung des Doppelstrangs bei 94 °C
3.Markierung:
->radioaktiver Primer wird am codogenen Strang gebunden
->der Einzelstrang wird hybridisiert
4.Kettenabbruchverfahren:
->DNA wird in vier Reagenzgläser aufgeteilt und Abbruch-Nukleotide wird hinzugefügt
->da diesen Verfahren beliebig oft wiederholt werden kann entstehen vers. lange DNA-Stücke -->das letzte Nukleotid ist immer das Abbruch-Nukleotide
5.Gelelektrophorese:
->Veränderung der Basen wird durch radioaktiv markierten Primer sichtbar gemacht
-Bedeutung für Evolution
->mit der DNA-Sequenzierung  können die Verwandtschaftsgrade zwischen verschiedenen Organismen untersucht und Informationen über ihre Evolution gewonnen werden

# data[].attributes.body
DNA-Vergleiche werden immer häufiger mit Genen durchgeführt, die nicht für Proteine oder RNA codieren

DNA-Abschnitte, die nicht der Selektion unterliegen, also keine Proteine, und sich aus diesem Grund verhältnismäßig gleichmäßig über Generationen verändern, eignen sich besser

Genetische Marker: DNA-Abschnitte, die für Klärung bestimmter Fragestellungen gewählt wurden

Welcher Abschnitt geeignet ist, hängt von betrachteter Organismusgruppe und von Fragestellung ab

Kurze DNA-Abschnitte lassen sich zwar einfacher untereinander vergleichen, haben aber auch geringeren Informationsgehalt

Zur Analyse der Verwandtschaft übergeordneter Verwandtschaftsgruppen eignen sich stark konservierte Regionen der Kern-DNA, d.h. Bereiche in denen nur sehr selten Mutationen auftreten

Zur Analyse von vermutlich erst kurz voneinander unabhängigen (divergierten) Organismengruppen bedient man sich am besten Regionen mit besonders hohen Mutationsraten, z.B. Mikrosatelliten-Fragmente → in anderen Regionen häufig keine Unterschiede

# data[].attributes.body
Was ist das?

Genetische Informationen beliebig vieler Menschen, Tiere, Pflanzen oder Mikroorganismen gespeichert

Speicherung einzelner Sequenzen oder ganzer Genomen

Woher kommt es?

Man wollte eine systematische Einordnung der Tiere

Jahr 2015: Wissenschaftler isolierten aus fossilen Knochen zwei Proteine und bestimmten Proteinsequenz

Suche nach ähnlichen Sequenzen anhand eines Programms

Anwendung

DNA wird extrahiert

DNA wird durch die PCR vervielfältigt und sequenziert

Suche nach ähnlichen Sequenzen und Vergleich durch Computerprogramm (Basic Local Alignment Search Tool = BLAST)

Z.B. Bestimmung von Verwandtschaftsgrad

DNA-Barcoding

Barcode-Sequenz = kurze Nucleotidsequenz eines standardisierten genetisches Bereichs

Barcode des Lebens wichtig für:

→ Identifizierung der Arten

→ Klassenzuordnung

richtet sich nach morphologischen Merkmalen

Barcode of Life Database (BOLD) → Analyse der Sequenzen

Wofür wird es verwendet?

in der Medizin:

→ z.B. Verträglichkeiten bei Organtransplationen zu klären

in der Strafverfolgung:

→ z.B. um Verdächtige anhand von am Tatort aufgefundenen DNA-Material als Täter zu überführen

in der Biologie:

→ z.B. Abstammungen und Verwandschaften zwischen verschiedenen Spezies rückzuverfolgen

→ Identifikation von Arten

Stammbäume mittels Datenbanken

in Gen-Datenbanken nicht nur Marker-Sequenzen, sondern auch Proteinsequenzen

man kann:

→ Stammbaum eines einzelnen Gens zwischen bestimmten Arten erstellen

→ Vergleiche ganzer Genome verschiedener Organismen anstellen

(Hanan und Melina)

# data[].attributes.body
Erste Generation – Sanger (Friedrich Sanger)

1.methode zur DNA-Sequenzierung

Verfahren: basenspezifischer Abbruch der DNA-Synthese & Auftrennung der Fragmente durch Gelelektrophorese

Grundprinzip mithilfe von Enzymen unterschiedlich lange DNA Abschnitte zu generieren, die sich jeweils um nur ein Basenpaar unterschieden → nach länge analysiert

Denaturierung ( bei 94°) doppelsträngigen DNA, deren Basenabfolge bestimmt wird, wird gespalten → zwei Einzelstränge → eine dient als Vorlage (Matrize) für die Sequenzierung

Primerhybridisierung– lagert sich jeweils ein aus wenigen Nukleotiden bestehender Starter (Primer) an den passenden (komplementären) Abschnitt auf dem DNA Vorlagestrang an.

4 parallele identische Reaktionsansätze werden hergestellt mit: :

den zu untersuchenden DNA Einzelstrangabschnitten (Matrize) mit angelagerten Primern

DNA Bausteine (Nukleotide) mit den 4 DNA Basen

das Enzym DNA Polymerase

Zusätzlich enthält jeder Ansatz jeweils spezielle Stopp-Nukleotide (Didesoxynukleotide). Sie besitzen die besondere Eigenschaft, dass sie sich nur an einer Seite mit einem weiteren Nukleotid verbinden können.
→ beim Einfügen eines der Stoppbausteine stoppt die DNA Synthese
→ deshalb der Name Kettenabbruchmethode

jeder Ansatz beinhaltet ein anderes  Stopp-Nukleotide (einer mit einem Adenin-Stoppbaustein, der Nächste mit Thymin, ein Weiterer mit Guanin und der Letzte mit Cytosin)

die DNA Polymerase beginnt und vom Primer ausgehend neue, passende DNA Bausteine können anlagern und miteinander verknüpft werden ( Polymerisation )

Die Polymerisation findet nun so lange statt, bis die DNA Polymerase ein Stopp-Nukleotid anlagert. ( passiert rein zufällig )Es kommt also immer an der selben Base zum Kettenabbruch, aber an einer unterschiedlichen Stelle. Ziel ist es, alle theoretisch möglichen Sequenzfragmente herzustellen

Mithilfe der Gelelktrophorese werden die Ansätze aufgetrennt
→ heute werden die ddAs mit vier Fluroszensfarbstoffen markiert

# data[].attributes.headline
* Bild zum N- und C- Terminus eines Proteins 

# data[].attributes.subject
* Bild zum N- und C- Terminus eines Proteins 