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Quelle est la différence entre la spectroscopie et la spectrométrie ?

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Quelle est la différence entre la spectroscopie et la spectrométrie ?

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La spectroscopie est essentiellement l'étude de l'énergie rayonnée et de la matière pour déterminer leur interaction, et elle ne produit pas de résultats par elle-même. La spectrométrie est l'application de la spectroscopie pour obtenir des résultats quantifiables qui peuvent ensuite être évalués.

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changement de couleur

changement de pH

solution conductive

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par retour=par difference

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Le titrage destructeur en chimie fait référence à une méthode de titrage dans laquelle l'échantillon est consommé ou détruit au cours de la réaction chimique, de sorte qu'il n'est plus disponible après l'analyse. Contrairement aux méthodes non destructrices, où l'échantillon reste intact, ici la réaction chimique entraîne une modification irréversible de l'analyte ou la production de produits qui empêchent toute récupération de l'échantillon initial.

En résumé, les titrages destructeurs sont largement utilisés pour leur précision, mais l'analyte est détruit pendant l'analyse, ce qui peut poser problème pour certains types d'échantillons.

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Caractéristiques du titrage destructeur :

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Caractéristiques du titrage destructeur :

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1. Consommation de l'échantillon : L'analyte réagit complètement avec le réactif, et il est souvent transformé en d'autres composés qui ne peuvent pas être reconvertis en leur forme originale.

2. Réactions irréversibles : Les réactions mises en jeu sont généralement irréversibles, telles que des réactions d'oxydo-réduction, acido-basiques, ou de précipitation.

3. Méthode courante : La majorité des titrages en chimie analytique, comme le titrage acido-basique ou le titrage redox, sont destructeurs parce que l'analyte est entièrement utilisé dans la réaction.

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1. Titrage acido-basique :

L'analyte (acide ou base) réagit avec un réactif titrant (base ou acide) pour former de l'eau et des sels. Par exemple, le titrage d'un acide avec une base forte détruit l'acide présent dans l'échantillon, qui ne peut plus être récupéré.

HCl+NaOH→NaCl+H2OHCl+NaOH→NaCl+H2​O

2. Titrage redox :

Dans un titrage redox, l'analyte subit une réaction d'oxydation ou de réduction. Par exemple, lors du titrage du fer Fe2+Fe2+ avec le permanganate de potassium KMnO4KMnO4​, le fer est oxydé en Fe3+Fe3+, et ne peut pas être récupéré sous sa forme initiale.

5Fe2++MnO4−+8H+→5Fe3++Mn2++4H2O5Fe2++MnO4−​+8H+→5Fe3++Mn2++4H2​O

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Avantages :

Méthodes très précises : Les titrages destructeurs sont souvent très précis et bien adaptés pour déterminer la concentration exacte d'une substance donnée.

Facile à mettre en œuvre : Ils sont couramment utilisés et bien documentés, avec des équipements standard facilement accessibles.

Inconvénients :

Échantillon perdu : Comme l'échantillon est consommé, il ne peut pas être réutilisé ou analysé par d'autres méthodes.

Pas adapté aux échantillons rares : Si l'échantillon est précieux ou rare, cette méthode peut être désavantageuse.

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Ce type de titrage repose sur la réaction entre l'analyte et un réactif pour former un précipité insoluble, ce qui permet de déterminer indirectement la concentration de l'analyte.

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Pourquoi le dosage par précipitation est-il simple ?

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Pourquoi le dosage par précipitation est-il simple ?

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1. Facilité de mise en œuvre : Il ne nécessite souvent pas de réactifs complexes ou de conditions spéciales de température ou de pression.

2. Indicateur visuel : L'apparition ou la disparition d'un précipité sert souvent d'indicateur pour marquer la fin de la réaction (point équivalent).

3. Méthodes bien établies : Des titrages classiques comme le titrage de Mohr (précipitation de chlorure avec nitrate d'argent) ou le titrage de Volhard sont couramment utilisés pour leur simplicité et leur fiabilité.

4. Pas de besoin de suivi précis : Contrairement à certains titrages acido-basiques ou redox, le point final peut souvent être identifié visuellement, sans avoir besoin de pH-mètre ou d'électrodes spécialisées.

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Exemple courant : Le titrage des ions chlorure par le nitrate d'argent

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Exemple courant : Le titrage des ions chlorure par le nitrate d'argent

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L'analyte contient des ions chlorure (Cl−Cl−).

On ajoute une solution de nitrate d'argent (AgNO3AgNO3​), qui réagit avec les ions chlorure pour former un précipité d'argent chlorure (AgClAgCl).

La réaction est :

Ag++Cl−→AgCl (s)Ag++Cl−→AgCl(s)

En suivant la formation du précipité, on peut déterminer la concentration initiale d'ions chlorure dans l'échantillon.

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Avantages :

Simple et rapide à mettre en œuvre.

Ne nécessite pas d'équipements sophistiqués.

Applicable à un grand nombre d'analytes ioniques.

Limites :

Doit être utilisé uniquement avec des analytes qui forment un précipité net avec le réactif.

La méthode peut ne pas être aussi précise que d'autres techniques, notamment si la fin de réaction n'est pas bien visible.

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Elle consiste en un dosage argentimétrique des ions chlorures par le nitrate d'argent en présence de chromate de sodium. Ce dernier est l'indicateur coloré qui réagit en fin de dosage pour former le chromate d'argent, apparaissant comme un précipité rouge brique.

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La méthode de Charpentier-Volhard se place dans un domaine de pH acide puisqu'elle s'effectue en présence d'acide nitrique. A une prise d'essai de la solution d'ions halogénure à doser, on ajoute un excès connu de nitrate d'argent. L'excès d'ions Ag⁺ est dosé par une solution de thiocyanate de potassium KSCN.

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1. Méthodes immunochimiques :
1.1. Principe général
Les méthodes immunochimiques font appel à un anticorps spécifique de la molécule à doser ainsi qu'une forme marquée de ce même composé. La mise en présence d'une quantité connue d'anticorps, de molécule spécifique marquée et d'une quantité inconnue de molécules à doser provenant d'un échantillon, va entraîner la formation de deux types de complexes antigène-anticorps entrant en compétition, l'un avec la molécule marquée, l'autre avec la molécule à doser. Le nombre de molécules marquées se fixant à l'anticorps est inversement proportionnel au nombre de molécules non marquées initialement présentes dans l'échantillon à doser. Il existe ensuite deux méthodes principales de quantification de la réaction : les méthodes en phase homogène et les méthodes en phase hétérogène. Ces dernières nécessitent la séparation des formes liées et des formes libres car il n'existe pas de différence entre les signaux produits par chacune des formes. C'est le cas notamment de la radio-immunologie, mais ces techniques, nécessitant une étape supplémentaire, ne sont plus utilisées dans le dosage du médicament. À l'inverse, lorsque le marquage est réalisé par une enzyme ou un fluorophore, la mesure est réalisée par un changement optique généré par une différence de comportement entre la forme libre et la forme liée. Ce sont les méthodes en phase homogène, plus rapides et entièrement automatisables.
1.2. Méthodes en phase homogène
Deux méthodes de quantification du complexe antigène-anticorps sont utilisées : la technique Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) et l'immunopolarisation de fluorescence (FPIA).

Dans la méthode EMIT (figure 1), le marquage est réalisé par une enzyme. La fixation de l'anticorps à cette molécule marquée masque l'enzyme. L'introduction d'une molécule non marquée (molécule à doser) libère une partie des molécules marquées, pouvant réagir alors avec un substrat. L'intensité de la réaction sera donc proportionnelle à la quantité de molécules à doser. La quantification de la réaction enzymatique est le plus souvent réalisée par lecture optique dans l'ultraviolet (340 nm) en mesurant la consommation de nicotinamide dinucléotide oxydé (NAD+), cofacteur de la réaction.

M + M-E + Ac + Substrat + NAD+ à M-Ac + M-E-Ac + M-E + NADH,H+

(inactif)
où M est la molécule à doser, M-E est la molécule marquée, Ac est l'anticorps spécifique de la molécule à doser et NADH est le NAD réduit.

Figure 1. Principe de la méthode EMIT
On utilise un antigène marqué par une enzyme. Exemple d'enzyme : glucose 6-phosphate deshydrogénase. Cette technique est fondée sur la compétition entre la molécule à doser (Ag) et l'antigène marqué par une enzyme (G6PDH) pour occuper les sites de liaison des anticorps. La fixation de l'Ag (médicament) à l'Ac libère l'Ag marqué par l'enzyme qui va pouvoir réagir avec un subtrat : l'enzyme passe alors de la forme inactive à la forme active et devient donc capable d'hydrolyser le substrat (exemple de substrat : glucose 6-phosphate). La lecture est obtenue dans l'UV par la réduction de nicotinamide dinucléotide (NAD), cofacteur de la réaction, qui se transforme en NADH absorbant à 340 nm. L'absorbance ou la variation d'absorbance engendrée par la réaction permet la quantification de la molécule à doser par comparaison à une courbe de référence.
Dans la méthode par polarisation de fluorescence (FPIA, figure 2), le marquage de la molécule est réalisé par un composé fluorescent. La révélation du complexe antigène-anticorps est basée sur la différence de rotation de la lumière induite par la forme libre ou liée de la molécule marquée. À l'état libre, la molécule marquée tourne librement et rapidement induisant une polarisation faible. Lorsqu'il n'y a pas de molécule à doser, la molécule marquée se fixe sur l'anticoprs, formant une grosse molécule à rotation faible, induisant une polarisation élevée de la lumière incidente.

Figure 2a. Méthode FPIA : mécanisme - peu de substance à doser

Figure 2b. Méthode FPIA : mécanisme - beaucoup de substance à doser
La lumière polarisée est émise vers le milieu réactionnel et la polarisation de la lumière réémise est mesurée. S 1.3. Dosages possibles en immunochimie i peu de médicament dans l'échantillon : les molécules de traceur se fixent sur les Ac. Il y a donc une majorité de grosses molécules fluorescentes, qui tournent lentement : la polarisation mesurée est élevée (peu de dépolarisation de la lumière initiale) (figure 3a). Si beaucoup de médicament dans l'échantillon : les molécules à doser occupent la majorité des sites Ac. Le traceur se trouve à l'état libre, sous forme de petites molécules qui tournent rapidement : la polarisation mesurée est faible (forte dépolarisation de la lumière initiale) (figure 3b). 2.1. Méthodes en chromatographie gazeuse
Il s'agit d'une réaction Ag-Ac où l'on met en présence un antigène (la substance à doser), une quantité connue du même antigène marqué à la fluorescéine (traceur), une quantité connue d'anticorps (Ac) spécifique de l'Ag. Lors de la réaction, il y a compétition entre l'antigène marqué et la substance à doser pour se fixer sur l'Ac, du fait du nombre limité de sites à occuper. Si la substance à doser est en faible quantité dans l'échantillon (figure 2a), beaucoup de traceur sera fixé sur l'Ac. Au contraire, si la quantité de substance à doser est importante, le traceur sera peu fixé à l'Ac et restera libre dans le milieu réactionnel (figure 2b).

Figure 3a. Mesure de la polarisation de fluorescence - peu de substance

Figure 3b. Mesure de la polarisation de fluorescence - beaucoup de substance
2.2. Méthodes en chromatographie liquide
2 . Méthodes chromatographiques :

Deux types de méthodes chromatographiques existent pour le dosage du médicament : les méthodes par chromatographie gazeuse et celles par chromatographie liquide.

Figure 4 : Méthodes en chromatographie gazeuse

6.4.3.figure4.jpg L'étape séparative est réalisée sur une colonne contenant une phase stationnaire liquide ou solide tandis qu'un flux de gaz vecteur réalise l'élution des composés et les entraîne vers un détecteur. Après introduction des molécules à séparer dans la colonne, les molécules vont se répartir entre la phase stationnaire et la phase gazeuse. La séparation des molécules va reposer sur un gradient de température appliquée à la colonne. Les molécules ayant le plus d'affinité pour la phase stationnaire y séjournent plus longtemps, atteignant le détecteur plus tardivement. Celui-ci produira alors un signal proportionnel à la quantité de molécule à doser. Dans des conditions prédéfinies de chromatographie, chaque produit sera caractérisé par un temps de rétention caractéristique de ce composé.

Les détecteurs sont multiples, les plus répandus étant les détecteurs à ionisation de flamme, les détecteurs thermoioniques, les détecteurs à capture d'électrons et les détecteurs de type spectromètre de masse, présentant une sensibilité et une spécificité accrue. La chromatographie en phase gazeuse est utilisée pour les molécules volatiles et thermostables compte tenu des températures élevées utilisées dans cette méthode.

Figure 5 : Méthodes en chromatographie liquide

En chromatographie liquide, appelée chromatographie liquide haute performance ou CLHP, une phase mobile constituée par un mélange de solvants traverse une colonne contenant la phase stationnaire constituée de billes de faible diamètre (le plus souvent inférieur à 5 µM). La séparation des composés de l'échantillon peut être améliorée en appliquant un gradient de solvants au sein de la phase mobile au cours de la chromatographie.

Les détecteurs les plus utilisées sont le détecteur UV-visible, à fluorescence, électrochimique, à barrette de photodiodes permettant l'acquisition du spectre UV complet de la molécule détectée et donc une meilleure spécificité et la spectrométrie de masse alliant là encore spécificité et sensibilité.

La chromatographie liquide permet l'accès au dosage de molécules instables thermiquement ou non volatiles.

3 . Validation d'une méthode de dosage :

Toute méthode de dosage de médicament utilisée par un laboratoire doit avoir été validée préalablement à son utilisation en routine. Concernant les méthodes immunologiques, cette validation a lieu nécessairement avant la mise sur le marché du réactif de dosage, condition exigée auprès de la société qui commercialise le kit pour obtenir l'autorisation de mise sur le marché (AMM). Concernant les méthodes chromatographiques, chaque laboratoire doit valider ses techniques.

La validation d'une méthode permet d'en déterminer ses performances ainsi que ses limites. Une validation de méthode va permettre de définir :

- la spécificité : garantit que le signal mesuré est uniquement dû au médicament à doser.
- la sélectivité : capacité d'une méthode à différencier le médicament d'autres substances (notion d'interférences analytiques).
- la linéarité : fourchette pour laquelle le signal obtenu est directement proportionnel à la concentration du médicament.
- l'exactitude ou justesse ou biais : écart entre la valeur théorique d'un standard et les valeurs expérimentales mesurées de ce standard.
- la précision ou fidélité : écart entre les différentes valeurs mesurées d'un standard au cours du temps. Elle est exprimée par un coefficient de variation de ces valeurs mesurées dans une même série (variation intra-jour) et dans plusieurs séries (variation inter-jour).
- la limite de détection : plus faible concentration du médicament qui peut être différenciée du bruit de fond mais pas nécessairement quantifiée.
- la limite de quantification : plus faible concentration du médicament à doser qui peut être quantifiée avec exactitude et précision.

Après la validation initiale, la qualité des analyses est vérifiée par :

- des contrôles de qualité internes. Ce sont des échantillons avec une concentration connue de médicament, qui sont analysés dans les mêmes séries que les échantillons de patients. Si le résultat obtenu est trop éloigné de la valeur attendue, les conditions techniques doivent être vérifiées.
- des contrôles de qualité externes. Ce sont des échantillons préparés par un laboratoire extérieur (national ou international), reçu 3 ou 4 fois par an, dont on ne connaît pas la concentration, et qui permettent une validation externe des résultats rendus par le laboratoire. Ils permettent également de vérifier l'homogénéité des résultats des différents laboratoires participants.

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Principes des méthodes de dosage - notion de sensibilité et précision...

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1. Méthodes immunochimiques : 1.1. Principe général Les méthodes immunochimiques font appel à un anticorps spécifique de la molécule à doser ainsi qu'une forme marquée de ce même composé.

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Le dosage en retour est une méthode de détermination indirecte de la quantité de matière à doser. On fait réagir la substance à doser avec une quantité connue et en excès de réactif titrant puis on neutralise l'excès de réactif titrant avec un autre réactif.

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L'étalonnage non destructeur en chimie est une méthode utilisée pour calibrer un instrument de mesure sans endommager ou altérer l'échantillon analysé. Cela est particulièrement important lorsque les échantillons sont rares, coûteux ou fragiles. Ce type d'étalonnage permet de vérifier la précision d'un instrument en utilisant des échantillons ou des matériaux de référence dont on connaît déjà les caractéristiques sans les consommer ni les modifier de manière significative.

Dans le cadre d'un processus non destructeur, l'échantillon reste intact. Des techniques telles que la spectroscopie infrarouge (IR), la résonance magnétique nucléaire (RMN), ou encore la chromatographie peuvent être utilisées avec des méthodes non destructives.

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Conservation des échantillons : Les échantillons ne sont pas détruits ni consommés pendant l'analyse.

Gain de temps : L'étalonnage peut être plus rapide, car il n'est pas nécessaire de préparer ou de remplacer les échantillons après chaque mesure.

Meilleure précision : Réduction des erreurs dues à la destruction de l'échantillon ou à des modifications chimiques ou physiques lors de l'étalonnage.

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Dosage direct : Le terme "dosage direct" fait référence à une méthode d'analyse qui permet de déterminer la concentration d'une substance chimique dans un échantillon de manière directe, sans nécessiter de réactions chimiques supplémentaires ou d'étapes complexes.

- Spectrophotométrie
- Potentiométrie

- Chromatographie

- Analyse gravimétrique
- Titration potentiométrique
- Dosage par fluorescence ou par luminescence

Il doit être :

Total

Rapide

Unique

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le dosage est l’action qui consiste à déterminer la quantité d’une substance précise présente dans une autre ou dans un mélange. Le but du dosage est de déterminer la concentration inconnue d’une espèce à l’aide d’une autre espèce de concentration connue.

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Déterminer avec précision la concentration d'une espèce dissoute en solution

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Un dosage indirect met en jeu deux transformations successives.

Dans un titrage indirect, on ajoute un excès connu d’un réactif R à une prise d’essai de l’espèce A à doser, la transformation A + R1 → C + D devant être totale et spécifique. Puis, par titrage direct, on détermine la quantité de matière restante de R. Par différence, on calcule la quantité initiale de A dans la prise d'essai.

Exemple de titrage par retour :

Dosage par Précipitation Indirecte

Dosage Par Complexométrie Indirecte

Dosage par Substitution

Dosage Par Réaction Chimique Intermédiaire (Volumétrique Indirect)

Dosage Redox Indirect

Dosage Par Dérivation (ou Dosage Dérivatif)

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Cette méthode consiste à faire réagir l'espèce dont on veut déterminer la quantité avec un réactif titrant en excès, puis à neutraliser l’excès de réactif avec un autre réactif. La quantité de l'espèce cherchée est ensuite déduite en soustrayant la quantité de réactif neutralisé de la quantité totale de réactif ajoutée.

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Cette méthode permet de mesurer la quantité de fluide qui traverse un point donné d’un système de canalisation. Elle utilise le principe de la dérivation, où une petite quantité de fluide est déviée d’un flux principal vers un capteur.

Dans ce contexte, la dérivation est provoquée en utilisant un élément de flux laminaire installé dans la canalisation principale, qui provoque une chute de pression et dévie une petite quantité de débit vers le tube du capteur.

Les résistances chauffantes enroulées sur les tubes mesurent la chaleur transférée au fluide, ce qui permet de déterminer le débit dérivé par le biais d'un calcul

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Les dosages indirects sont très utiles lorsqu'une mesure directe est difficile ou imprécise. Ils permettent de doser une substance par l’intermédiaire d’une autre, soit en passant par une réaction intermédiaire, soit en utilisant un produit ou un réactif secondaire. Ces méthodes sont souvent utilisées en chimie analytique, dans les laboratoires de recherche et dans le contrôle de la qualité industrielle.

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Le dosage, dans un contexte général, fait référence à la mesure ou à la détermination de la quantité ou de la concentration d'une substance spécifique dans un échantillon. Il est couramment utilisé dans de nombreux domaines, notamment en chimie, en médecine, en pharmacologie, en alimentation, en environnement, et dans d'autres sciences et industries. Voici quelques exemples de domaines où le dosage est appliqué :

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C'est la détermination de la quantité appropriée d’ingrédients pour obtenir un résultat culinaire attendu, comme un mélange de saveurs ou une texture spécifique.