# data[].attributes.attachment_caption
Mastermix. Klik op het figuur om in te zoomen

# data[].attributes.body
Hier staan nog wat extra hints als je het moeilijk vindt

# data[].attributes.body
Welke monsters en controles zijn nodig om te zien of je resultaat betrouwbaar is?

Hints hierover staan in het ballonetje 8 'keuze monsters'. Kijk ook naar het plaatje met een suggestie voor het begin van een monstertabel

Kunnen alle monsters met dezelfde reactiemix?

# data[].attributes.body
Nu weet je de opzet voor je analysemonster en controles. Je hoeft alleen nog pipetteerschema's te bedenken aan de hand van de hints in de padlet, je kan voor de mastermix ongeveer dezelfde denkstappen doorlopen als voor een reactiemix..

# data[].attributes.body
Gebruik BLAST om te kijken met wat voor resultaat je verwacht bij detectie van 35S in je analysemonster

Verwacht je 0, 1, of meer bandjes?

Hoe groot is / zijn verwachte bandje(s)?

# data[].attributes.body
Verzamel en noteer relevante informatie uit de opdracht

Welke materialen zijn beschikbaar?

...

Welk DNA ga je gebruiken voor het analysemonster?

...

En voor de positieve controle?

...

Wat is / zijn de sequenties van dat DNA?

...

...

Dit staat in het document bij studiematerialen op moodle 'DNA sequenties primers ladders'

Welke primers ga je gebruiken?

...

Wat zijn de sequenties van die primers?

...

Dit staat in het document bij studiematerialen op moodle 'DNA sequenties primers ladders'

Hoe bedenk ik de voorspelling van het resultaat?

...

Welke voorschriften zijn er nodig?

...

# data[].attributes.body
Bedenk en noteer: wat is het doel en wat zijn de eisen?

Wat wil je bereiken met dit experiment? --> Wat wil je aan het eind van de labdag weten of hebben?

...

# data[].attributes.body
Als je het moeilijk vindt om vanuit deze opdracht te bedenken hoe het experiment opgezet kan worden staan hieronder stappen die je kan volgen

# data[].attributes.attachment_caption
Tabel voor monsters en controles bij Lambda DNA PCR, dubbelklik op de figuur om in te zoomen

# data[].attributes.body
Bij elk experiment heb je analysemonsters en zijn er controles nodig om te weten of de data van het analysemonster betrouwbaar is. Beschrijf hier welke monsters je wilt maken.

Bij een PCR heeft een duplo analysemonster geen meerwaarde

Beschrijf per controle:

Wat je controleert

Welk DNA wel of niet in het monster moet

Welke primers er wel of niet in het monster moeten

Hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt

wel / geen bandje

Hoeveel bp is een verwacht bandje

In bovenstaand figuur zijn controles gesuggereerd en staat een voorbeeld meetmonster ingevuld. Je mag zelf meer of andere controles uitvoeren als je die nuttig vind, maar het hoeft niet.

Beschrijf in je labjournaal in een overzichtelijke tabel of lijst de monsters en welke DNA ladder je gekozen hebt.

Vul de verwachting aan met verwachtingen voor je controles

analyse: monster zonder snp (799bp dus bandje daar)

neg controle: monster met SNP (50.000bp dus smeer?)

pos controle: ???

analyse: 2 analysemonster met of zonder SNP

neg controle:

-geen DNA

-met mutant DNA

pos controle:

-met wildtype DNA

# data[].attributes.body
Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften.

Deze week ga je een PCR resultaat digitaal voorspellen, de PCR uitvoeren, het product daarvan op agarosegel analyseren:

A

K

L

# data[].attributes.attachment_caption
Een voorbeeld van een BLAST resultaat van een listeria monocytogenes PCR ter onderbouwing van een verwachting. Source: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer

# data[].attributes.body
Informatie figuur: Een voorbeeld van een BLAST resultaat van een listeria monocytogenes PCR ter onderbouwing van een verwachting. A: informatie over ingevoerde data (hier is gekozen voor organisme listeria monocytogenes). B: informatie over de primers op zich. C: Verwachte PCR producten. Bij deze PCR geven de primers altijd 2 bandjes: 1 van 64 bp en 1 van 448 bp. Meestal geeft 1 primerset 1 bandje als resultaat.

Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment
Noteer je verwachting over:

Het analysemonster wanneer het wiltdtype lambda DNA bevat (wel of geen bandje, hoeveel bp is het bandje)

Het analysemonster wanneer het een puntmutatie bevat (wel of geen bandje, hoeveel bp is het bandje)

Elke controle (wel of geen bandje, hoeveel bp is het bandje)

Dit kan natuurlijk pas wanneer je de controles bedacht hebt

Onderbouw je verwachting met prinscreen-plaatjes van de BLAST resultaten (in silico-versie van het experiment). Je kan het organisme in BLAST instellen als lambda DNA of zelf de lambda DNA sequentie in BLAST plakken.

Kies aan de hand van de verwachte resultaten een geschikte ladder en noteer deze bij je monsters.

Benodigde informatie om een verwachting op te stellen:

DNA sequentie lambda DNA

Primersequenties

BLAST (hoe werkt dat)

zonder:

...799bp analyse

met snp:

155000(?) want deze heeft een snp waardoor primer er niet op kan

referentie

50bp of 100 bp

...

...

# data[].attributes.attachment_caption
Voorbeeld van hoe je een planning kan noteren. Deze kan je op een los papier mee zodat je kan afvinken

# data[].attributes.body
Heb je de 'checklist voorbereiding labvaardigheden' volledig afgevinkt?

Bedenk dat het PCR-programma veel cycli heeft, bereken hoe lang het duurt voordat het hele programma afgerond is. Reken daar nog 20% tijd bij omdat het apparaat tussen elke stap moet opwarmen of afkoelen

Bedenk dat runnen van gel elektroforese ook tijd kost, langer dan de vorige weken wanneer je een hoger % agarosegel gebruikt. Beschrijf welke kleur uit de loading dye hoe ver gerund moet zijn wanneer je de gel wilt stoppen

Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:

Materialen verzamelen

Gelplek inrichten

Epjes beschrijven

agarosegel oplossing maken

agarosegel gieten

agarosegel laten stollen

PCR runnen (... tijd)

Bereken dit en bedenk een deadline (hoe laat wil je dat het apparaat uiterlijk aan gaat)

Loading dye toevoegen aan DNA monsters

DNA monsters in de gel doen

Gel runnen (stroom erop zetten)

Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen

Opruimen

# data[].attributes.body
Noteer hier instellingen voor te gebruiken apparatuur

PCR: noteer het programma en aantal cycli

Agarose gelelectroforese: noteer het voltage dat je wilt gebruiken, hoelang je schat dat het duurt en hoe ver de loading dye gerund moet zijn voor je stopt (is de gele, paarse of blauwe band onderaan de gel)

Tip: een 1,5% gel runt langzamer dan een 0,7% gel. Hoe hoger het voltage, hoe sneller de gel runt, maar ook hoe slechter de bandjes gescheiden worden.

PCR programma:
....................................................................

Agarose gel instellingen:
....................................................................

# data[].attributes.attachment_caption
Agarosegel schema, teken hier evt je verwachte resultaten in. Image created using biorender.com

# data[].attributes.body
Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier of maak een extra kolom in je monsterlijst voor de locatie in de gel.

Om voor jezelf heel duidelijk te maken wat je verwachtingen zijn en op het lab te kunnen controleren of je experiment aan de verwachting voldoet kan je in dit schema ook verwachte resultaten intekenen.

1:
2:
3:
4:
5:
6:
7:
8:
9:
10:
11:
12:
13:
14:
15:
Images created with biorender.com

# data[].attributes.body
Noteer hier het pipetteerschema voorhet toevoegen van loading dye aan de DNA monsters voor je ze op gel zet

Loading dye heeft een concentratie van 6x. Je wilt een eindconcentratie van 1x en een eindvolume van 12 ul.

loading dye ..............ul
DNA ..........................ul
eindvolume .........12 ul

# data[].attributes.headline
11 Pipetteerschema monsters bereiden uit mastermix

# data[].attributes.subject
11 Pipetteerschema monsters bereiden uit mastermix

# data[].attributes.body
Noteer hier hoe je het DNA verdunt voor het experiment en hoe je individuele monsters bereidt uit de mastermix

De precieze concentratie van gekocht DNA weet je niet. Noteer dus echt de berekening in het labjournaal zodat je het op het lab kan overdoen met de concentratie die op het epje staat.

In de voorbeeldberekening is uitgegaan van een DNA concentratie van 34 ng/ul.

De concentratie humaan DNA is waarschijnlijk ongeveer 100-200 ng/ul. Het kan dus dat je het nog moet verdunnen voor je het kan gebruiken.

ul mastermix             ul DNA
...                                   ...

Berekening: ...

# data[].attributes.attachment_caption
Voorbeeld van opzet voor pipetteerschema mastermix. Controleer altijd de stockconcentraties op het lab voor je pipetteert.

# data[].attributes.body
Noteer hier pipetteerschema's voor de mastermix

In het voorbeeldpipetteerschema is DNA grijs doorgestreept. Dit wordt wel genoteerd omdat je de hoeveelheid ul DNA nodig hebt om het aantal ul demiwater te berekenen, maar bij het bereiden van de mastermix voeg je het DNA nog niet toe.

Wanneer je in dit experiment kiest voor 2 analysemonsters, 1 positieve controle met lambda DNA en lambda primers, 1 negatieve controle met primers en geen DNA en 1 negatieve controle met DNA, maar geen primers, dan maak je dus een mastermix voor 2 analyse + 1 pos ctrl + 1 neg ctrl zonder DNA + 1 overmaat --> dit is dus voor 5 reacties. De hoeveelheden voor 1 reactie doe je dan *5.

Inhoud                     1 reactie (ul)         ___ reacties (ul)

template DNA x

demiwater x

PCR buffer 5

BSA

dNTPs (0,2mM) 1 (0,2pM)

primer F 1 (0,2pM)

primer R 1 (0,2pM)

taq polymerase (1x) 0,2 (als 5U/ul)

tot vol 50

# data[].attributes.body
Kies aan de hand van tabel 2 in de voorschriften een percentage voor de agarosegel

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

0,7%

Agarose                 0,35              g

TAE                                     50  ml

eindvolume                         50 ml

ul DNA dye toevoegen 2 ul

# data[].attributes.attachment_caption
Verzameling van alle gevaarssymbolen en een voorbeeld van een ingevulde veiligheidskaart.

# data[].attributes.body
Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan.
Doe de paginas met informatie over alle stoffen voor dit experiment vooraan in de map.

# data[].attributes.attachment_caption
Schematische weergave van het lambda DNA genoom. bron: snapgene.com

# data[].attributes.body
Opdracht

Kader:

Het J-gen van lambda DNA is onderdeel van de central tail fiber en is betrokken bij hechting van het virion aan een host cell. Je supervisor wil lambda DNA gebruiken als vector om genen in bacteriën tot expressie te brengen en wil het proces van virusbinnenkomst in de bacterie efficiënter maken. Hiervoor heeft je supervisor puntmutaties aangebracht bij het nucleotide op bp 15789 van lambda DNA. Het J gen wordt gecodeerd van basenpaar 15505 t/m 18903 op het genoom van lambda DNA.

Jouw deel:

Om te onderzoeken of het geïsoleerde lambda DNA wildtype of de gewenste mutant is ga jij dit analyseren met PCR. De primers zijn zo gekozen dat de verwachte mutatie aan het eind van de forward primer zou moeten zitten. Primer Lambda_J_wt_F: gacggtgctgggtacggaagtgaaa herkent wildtype lambda DNA en kan niet binden als een mutatie gacggtgctgggtacggaagtgaax aanwezig is, er wordt dan ook geen PCR product gevormd (x is een notatie die betekent dat ere een willekeurige base aanwezig kan zijn). Bij snapgene (link) kan je een kaart van het genoom van lambda DNA inzien.

In p3 vaardigheden ga je alleen het PCR deel van dit experiment uitvoeren, er is dus geen vervolg. Je gaat door een PCR op lambda DNA uit te voeren analyseren of je analysemonster wildtype lambda DNA is of dat je analysemonster een puntmutatie bevat. De resultaten analyseer je op agarosegel.

Gebruik controles om te bepalen of je PCR goed werkt (geeft het altijd een product bij wildtype lambda DNA, geeft het niet per ongeluk producten wanneer er geen wildtype lambda DNA aanwezig is) en kies een ladder die informatief is bij de grootte van het PCR product dat je verwacht te zien.

Voorspel van tevoren digitaal het resultaat van de PCR met BLAST om een goede verwachting op te kunnen stellen.

Op het lab zijn de volgende specifieke materialen aanwezig:

Primers:

Lambda_J_wt_F: 5’ gacggtgctgggtacggaagtgaaa 3’

Lambda_J_wt_R: 5’ gttccataccggcatacagcgcatc 3’

Positieve controle: wildtype lambda DNA

Negatieve controle: escherichia phage T4 DNA

2 Analysemonsters: lambda DNA met of zonder puntmutatie

Standaard reagentia  voor PCR en agarose gelelectroforese

# data[].attributes.body
Bij PCR is lab-hygiene extra belangrijk: 1 foutje laat het experiment voor jou, of zelfs voor iedereen na jou mislukken. Je bent verantwoordelijk voor de reagentia voor jouw klas, als deze vervuild raken hebben je er volgende week zelf last van.
Kijk in het voorschrift om te zien waar je rekening mee moet houden.

# data[].attributes.body
Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren

Materiaal, concentratie, fabrikant
...     ...     ...
...     ...     ...
...     ...     ...

# data[].attributes.body
Wat is het doel van het experiment?

Voor het doel staan vaak hints in de opdracht tekst

Welke vraag beantwoord je met je analysemonster? Wat weet je over het aangeleverde DNA als je dit experiment hebt uitgevoerd? Noteer dit in je labjournaal

Het doel van dit experiment is Van lambda dna monster, meer lambda dna maken

# data[].attributes.body
Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?
Wat gebeurt er bij PCR en waarom kan je PCR gebruiken om het doel van dit experiment te bereiken?

...