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BEATRIZ MOSCARDINI
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reacção em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo . Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. Para amplificar uma determinada região são necessários dois iniciadores complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar.

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LUIZA SANABIO

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.

Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos.

A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia.

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BEATRIZ MOSCARDINI
Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg²⁺. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:

Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias

Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)

Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)

O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente . Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 2²⁵ vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.

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LUIZA SANABIO
O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.
Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.
Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.
A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado. Hoje, existem termocicladores que, além de amplificar o DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em tempo real (qPCR).

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BEATRIZ MOSCARDINI
Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizável, as DNA polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reacção. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado após electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de DNA.

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ISABELLA FRANÇA
PCR (reação em cadeia da polimerase) refere-se a um método amplamente utilizado em biologia molecular para fazer muitas cópias de um segmento de DNA específico, enquanto a replicação de DNA refere-se ao processo biológico de produzir duas réplicas idênticas de DNA a partir de uma molécula de DNA original.

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O DNA ocorre em todos os organismos vivos, uma vez que oferece um método de fornecer informações genéticas de pais para filhos. Consiste em três etapas catalisadas enzimaticamente, a saber, iniciação, alongamento e término. A replicação do DNA pode ser feita artificialmente no laboratório. A PCR é realizada rotineiramente em laboratórios de biologia molecular, pois é um método fácil de produzir cópias de DNA.

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LUIZA SANABIO

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A replicação do DNA é o processo de duplicação da molécula de DNA. Nele ocorre a separação das duas cadeias de nucleotídeos e a formação de cadeias complementares. A replicação ocorre antes da divisão celular, durante a interfase.

O processo de replicação inicia-se com a separação das duas fitas que formam a molécula de DNA. Em seguida, ocorre a ligação dos nucleotídeos livres no núcleo a um nucleotídeo correspondente em uma das fitas. Tem-se agora duas moléculas de DNA, constituídas por uma fita antiga, pertencente à molécula original, e uma fita nova. Esse processo é considerado, assim, semiconservativo.

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A replicação do DNA ou duplicação do DNA é um processo de grande importância para a transmissão do material genético , pois, quando ocorre uma divisão celular, esse material será dividido de forma igual entre as células-filhas. A replicação ocorre antes do início da divisão celular, durante a fase S da interfase.

Na replicação, a molécula de DNA será duplicada . As duas moléculas formadas serão constituídas por uma fita que pertencia à molécula original e uma fita recentemente sintetizada. Pelo fato de as novas moléculas são constituídas por uma fita “antiga” e uma “nova”, esse processo é denominado semiconservativo . O processo de replicação é mediado por ação de algumas enzimas, como a helicase, responsável por desenrolar a hélice de DNA e separar as cadeias de nucleotídeos.

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ISABELLA FRANÇA

PCR e replicação de DNA são dois processos de síntese de DNA.

Ambos são reações em cadeia de polimerização. Portanto, a polimerização das duas fitas de DNA antiparalelas ocorre em direções opostas.

Além disso, as enzimas polimerizadoras de DNA realizam os dois processos. A principal função dessas enzimas é adicionar bases complementares ao fio em crescimento.

Ambos os processos utilizam iniciadores, que são pequenos fragmentos de oligonucleotídeos complementares ao DNA.

Os primers são responsáveis ​​pelo início da síntese de DNA.

Ambos os processos usam o DNA existente como modelo de DNA para a síntese de novo DNA. Portanto, eles ocorrem de maneira semiconservadora.

Eles usam nucleotídeos de desoxirribose como substratos.

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BEATRIZ MOSCARDINI

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Ocorrendo a fragmentação das moléculas de DNA, com o uso das enzimas de restrição, e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel, o próximo passo é multiplicar (clonar) o fragmento obtido e submetê-los à tecnologia do DNA recombinante.

A técnica de multiplicação da fita de DNA é chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase).

Na década de 1980, passou-se a utilizar a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único pedaço de DNA. Essa técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA).

Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.  Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes

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Técnica de PCR, passo a passo

Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.

A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.

Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.

Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.

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4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase.

5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.

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O procedimento de PCR ocorre em três etapas, são elas:
1-Desnaturação: Nessa etapa, o DNA genômico que contém a sequência que será ampliada é desnaturado a uma temperatura de 95°C há cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta e se torna uma única fita.
2-Anelamento: Para separar a região de interesse, são utilizados os primers , a uma temperatura aproximada de 40 °C para que se liguem a fita aberta e haja amplificação da região demarcada pelos primers.
3-Extensão: Depois que a área é demarcada pelos primers, a enzima Taq DNA Polimerase faz a extensão da fita a 70°C, com adição de bases nitrogenadas, sempre na direção 5'-3'.
.Observação: Essas etapas se repetem várias vezes, e a cada etapa há o aumento de DNA.

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Desnaturação:

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Anelamento:

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Extensão:

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Ao ocorrer a divisão das moléculas de DNA utilizando as enzimas de restrição (são as ferramentas básicas da engenharia genética, desempenhando função de clivagem (corte) da molécula de DNA em pontos específicos, em reconhecimento a determinadas seqüências de nucleotídeo) e o seu reconhecimento pela técnica de eletroforese em gel (utilizada para separar e purificar macromoléculas), o próximo passo é a multiplicação (clonação) do fragmento obtido e a submissão do mesmo à tecnologia do DNA recombinante. A essa técnica de multiplicação da fita de DNA, dá-se o nome de PCR.