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Parece uma tarefa difícil falar sobre a origem e a evolução dos antibióticos... e realmente é. Durante toda a evolução da humanidade temos os relatos de várias tentativas do uso de substâncias e materiais com a intenção de secar lesões supurativas, curar febres, melhorar as dores etc. A medicina era observacional. A clínica foi o recurso diagnóstico mais importante que existiu e ainda existe, porém naquela época era o único.

A definição do termo antibiótico também tem história. O termo inicial proposto por Vuillemin em 1889 era "antibiose" e que definia o antagonismo dos seres vivos em geral. O nome antibiótico foi primeiramente usado por Waksman em 1942, meio século após Vuillemin, e deu uma redefinição necessária como substância produzida por microorganismos (bactérias, fungos, actinomicetos), antagonista ao desenvolvimento ou à vida de outros microorganismo em altas diluições no meio bioquímico do nosso corpo (é necessário que isto seja dito para excluirmos substâncias que quando puras tem uma potente ação antimicrobiana como certos produtos metabólicos como os ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio e o álcool).

Entretanto, o uso diário do termo, incluiu os agentes antibacterianos sintéticos, como as sulfonamidas e as quinolonas, que não são produzidos por microorganismos. Waksman e outros microbiologistas notaram que algumas bactérias tinham a capacidade destruir ou inibir outras estudando amostras de fezes, cuja flora bacteriana é complexa e que depende dessa capacidade para sua manutenção.

Alguns autores dividem toda essa história em 3 grandes eras. A primeira, conhecida também como a era dos alcalóides, data de 1619 de onde provém os primeiros registros do sucesso do tratamento da malária com extrato de cinchona e do tratamento da disenteria amebiana com raiz de ipecacuanha. Durante muito tempo esses extratos e seus derivados (alcalóides, quinino e a emetina) formaram um grupo único de recursos terapêuticos conhecidos.

Em meados de 1860, Joseph Lister foi o primeiro cientista a estudar o efeito inibitório de substâncias químicas sobre as bactérias e aplicar seus conhecimentos diretamente na medicina. Lister usou fenol para esterilizar instrumentos cirúrgicos com importante diminuição nas taxas de morbidade e mortalidade associadas à cirurgia. Alguns autores dizem que esse evento marcou o surgimento da era antimicrobiana. Estudando tais efeitos, Pasteur e Joubert foram os primeiros a reconhecerem o potencial clínico dos produtos microbianos como agentes terapêuticos em 1877. Eles observaram que o bacilo anthrax crescia rapidamente quando inoculado em urina estéril mas parava de se multiplicar e morria se qualquer simples bactéria da ar fosse inoculada junto com o bacilo ou após ele na mesma urina.

Czech, Honl e Bukovsky em 1889 fizeram uso local de extrato de Pseudomonas aeruginosas que era um excelente produto conhecido como "piocianase" comercializado por muitos anos. Outros pesquisadores usaram extratos de Penicillium e Aspergillus, os quais continham, provavelmente, pequenas quantidades de antibióticos que produziam efeitos locais e transitórios.

A segunda era, conhecida como a dos compostos sintéticos, foi marcada pela descoberta do salvarsan por Paul Ehrlich (Alemanha) em 1909 para o tratamento de tripanossomas e outros protozoários. Em 1910 Ehrlich testou o 606º composto arsênico e viu que ele era ativo contra o treponema causador da sífilis. Esse composto foi usado como tratamento de escolha da sífilis até 1940 quando foi substituído pela penicilina. Na época imperava um pensamento: os protozoários eram susceptíveis às drogas e as bactérias não. Os treponemas não eram considerados bactérias, mas uma classe a parte. A idéia apresentada à pouco foi abandonada com a descoberta e o uso do Prontosil. O Prontosil é uma sulfonamida que foi sintetizada por Klarer e Meitzsch em 1932. Seus efeitos e resultados foram descritos por Gerhard Domagk., o que lhe valeu o Prêmio Nobel de Medicina em 1938.

A penicilina já havia sido sintetizada por Alexander Fleming em 1929, mas seu potencial não havia sido explorado devido à sua labilidade. O livro de Hare intitulado "O Nascimento da Penicilina" ("The Birth of Penicilin") descreve muito bem como Fleming descobriu a penicilina em 1928.Os escritos originais de Fleming atribuem o uso da penicilina em meios de cultura para suprimir os crescimento da flora oral e facilitar o isolamento do Haemophilus influenzae. A corrida para as sulfonamidas havia começado, sediada na Alemanha e anunciada em 1935.Quando o efeito curativo da sulfonamida foi demonstrado em ratos, iniciou-se estudos em pacientes com erisipela e outras infecções.

Em 1935 Domagk publicou as informações sobre seus estudos ao mesmo tempo em que eram publicados estudos semelhantes por Hörlein sobre os achados feitos em Londres. Esses estudos foram posteriormente continuados em outros países. Um dos mais notáveis estudos da época foi o de Kolebrook e Kenny (Inglaterra) em 1936 que demonstrou a imensa eficácia da droga na febre puerperal com quedas assustadoras no número de mortes entre os nascidos vivos de mães com febre puerperal. A posterior introdução da penicilina tenha sido, talvez, o maior impacto sobre a febre puerperal. O aumento dessa incidência em meados de 1950 foi devido à redefinição da febre puerperal como qualquer aumento de temperatura acima de 38°C, o que antes era definido quando essa temperatura era mantida por mais de 24 horas ou era recorrente.

Observou-se que o Prontosil não tinha atividade antibacteriana in vitro e alguns trabalhos sugeriram que sua atividade era pela liberação no corpo de p-aminobenzeno sulfonamida (sulfonilamida). Isso foi provado por Fuller em 1937. A sulfonilamida demonstrou ação inibitória para estreptococos in vitro. Isto foi fortemente contestado por Domagk. A sulfonilamida tomou força e em pouco tempo era fabricada por várias drogarias com mais de 70 nomes conhecidos. Muitos químicos da época ficaram entretidos tentando modificar a molécula para melhorá-la. Com isso surgiu a sulfapiridina em 1938, a primeira droga a ser efetiva no tratamento das pneumonias pneumocócicas e com maior espectro antimicrobiano para a época. Depois vieram a sulfatiazolina e a sulfadiazina que melhoraram a cianose e os vômitos causados pelas sulfas mais antigas.

A terceira era, conhecida como a era moderna dos antibióticos, foi marcada pelo controle das infecções por estreptococos e pneumococos com o uso que já vinha sendo feito das sulfonamidas. Alguns autores marcam a entrada dessa era com o início do uso clínico das sulfonilamidas em 1936. No final da década de 1940 apareceram as resistências de estreptococos hemolíticos, gonococos e pneumococos à sulfonamida.

Após uns 20 anos, os meningococos também tornaram-se resistentes à sulfonamida. Essa era é a que perdura até hoje e a mais ampla e difícil de ser relatada. Com o aparecimento da resistência bacteriana houve um empenho pela busca de novas substâncias e assim, em 1939, René Dubos (Nova Iorque) descobriu a tirotricina (gramicidina + tirocidina) formada pelo Bacillus brevis que embora muito tóxica para o homem, tinha um efeito curativo sistêmico em ratos. Esse fatos foram importantes pois influenciaram Howard Florey e seus colegas na descoberta de novas substâncias no final da década de 1940 sendo a penicilina a próxima droga a ser estudada por eles.

Alguns autores mencionam como o início da terceira era sendo em 1940 com os primeiros relatos sobre as propriedades do extrato de Penicillium notatum (hoje conhecida como penicilina) feitos em Oxford por Chain e seus colaboradores que haviam mostrado grande interesse pela descoberta feita por Fleming em 1929. Após sua síntese e estudos, começou a ser produzida pela "School of Patology at Oxford", porém quando administradas em seres humanos com infecções, era rapidamente excretada, necessitando de novas administrações. A produção de Oxford era insuficiente. Sendo assim, uma maneira para manter o suprimento da substância era reaproveitá-la na urina dos pacientes, isolando-a e administrando-a novamente a esses ou a outros doentes. Mostraram que a penicilina curava infecções estreptocócicas e estafilocócicas em ratos e o sucesso com o uso em humanos foi verificado rapidamente. Alguns anos mais tarde haveria a completa purificação da penicilina.

Muitos dos estudos com a penicilina feitos durante a Segunda Guerra Mundial perderam-se, pois circulavam de forma secreta e obscura. Dessa forma, a penicilina descoberta em 1929 e com seu uso clínico definido em 1940 deu origem à mais variada e mais utilizada classe de antibióticos: os b -lactâmicos.

Na tabela abaixo há algumas datas de descobertas dos antibióticos e as bactérias das quais foram extraídas a substância.

Em 1944, Selman Waksman a procura de antibióticos com efeitos menos tóxicos, junto com seu aluno Albert Schatz, isolou a estreptomicina de uma cepa de Streptomyces, a primeira droga efetiva contra a tuberculose e por isso recebeu o Prêmio Nobel da Medicina em 1952. Waksman isolou também a neomicina em 1948, além de outros 16 antibióticos durante sua vida (grande parte deles sem uso clínico pela alta toxicidade). O método de procura por novos antibióticos utilizado por Waksman na descoberta da estreptomicina dominou a indústria dos antibióticos por décadas.

Dois eventos importantes ocorreram em meados de 1950 levando ao desenvolvimento de penicilinas semi-sintéticas. Primeiro, foi conseguida a total síntese do ácido 6-aminopenicilânico (6APA). Segundo, Rolinson e seus colaboradores mostraram que muitas bactérias produziam acilases capazes de quebrar 6APA da benzilpenicilina. Em 1945 Edward Abraham e seus colegas da Universidade de Oxford estudaram o fungo de Brotzu Cephalosporium acremonium isolando desta cepa o terceiro antibiótico conhecido: cefalosporina C. A cefalosporina C era estável na presença da penicilinase produzida pelos estafilococos.

Sabemos hoje que todos os agentes terapêuticos que tiveram sucesso tinham certamente propriedades em comum. Eles devem exercer uma atividade microbiana letal ou inibitória e em altas diluições no complexo meio bioquímico do corpo humano. Estando em contato com os vários tecidos do corpo, devem não influenciar a função do órgão ou tecido e não ter efeitos danosos. Devem ter bom gosto, ser estáveis, solubilidade livre, baixa taxa de excreção e ter ótima difusão. Isso tudo levou aos estudos sobre o modo de ação dos antibióticos.

Woods e Fields estudaram o modo de ação das sulfonilamidas iniciando os estudos sobre a estrutura das bactérias e o desenvolvimento de novas substâncias de acordo com cada microorganismo. Foram feitos avanços importante no conhecimento da anatomia, composição química e metabolismo da bactéria. Isso ajudou a indicar qual droga seria a mais adequada para ser usada em determinada bactéria, mas não ajudou na descoberta de novas drogas. A resistência bacteriana era o principal problema.

Os novos antibióticos produzidos eram derivados dos que já existiam, com propriedades semelhantes às conhecidas anteriormente. Vemos, apesar disso, que mesmo após quase um século de estudos e controle quase que total das infecções bacterianas, a resistência bacteriana ainda é o principal desafio.

Tivemos o desenvolvimento de drogas antifúngicas e antivirais, melhor estudadas no final da década de 1980 até hoje, devido à S.I.D.A. e que serão melhor discutidas em capítulos a parte. O mesmo ocorrerá com as drogas antiparasitárias e com as várias outras classes de antibióticos que surgiram após toda a história contada onde serão oportunamente abordadas.
Referências Bibliográficas:
1 - Chambers HF, Sande MA, Antimicrobial Agents,, Goodman & Gilman's The Farmacological Basis of Therapeutics, 1996, Hardman JG, Limbird LE, Molinoff PB, Ruddon RW, Gilman AG eds, cap. 43, pg. 1029.

2 - Livermore DM, Williams JD, b -Lactams: Mode of Action and Mechanisms of Bacterial Resistence, Antibiotics in Laboratory Medicine, 1996, Ed. Williams & Wilkins, Lorian V ed., cap. 12, pg. 502-503. 3 - Greenwood D, Historical Introdution, Antibiotic and Chemotherapy, 1997, Ed. Churchill Livingstone, O'Grady F, Lambert HP, Finch RG, Greenwood D eds, cap. 1, pg. 2-9.

Publicado por: Equipe Brasil Escola

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A História dos Antibióticos - Brasil Escola

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Parece uma tarefa difícil falar sobre a origem e a evolução dos antibióticos... e realmente é. Durante toda a evolução da humanidade temos os relatos de várias tentativas do uso de substâncias e materiais com a intenção de secar lesões supurativas, curar febres, melhorar as dores etc. A medicina era observacional.

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Fiocruz busca potencial farmacológico de fungos e bactérias

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Fiocruz busca potencial farmacológico de fungos e bactérias

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Com apoio do governo do Estado via Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (Fapeam), a pesquisadora do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz Amazonas), Ormezinda Fernandes, está desenvolvendo um estudo para buscar em fungos e bactérias da região Amazônica potencial farmacológicpara tratamento de doenças cardiovasculares. Para a pesquisa, Ormezinda realizou uma seleção de fungos e bactérias isolados de substratos amazônicos, como solo, água e ar. Esses micro-organismos são promissores produtores de proteases (enzimas que separaram aminoácidos de proteínas) que possuem ação fibrinolítica (processo de desfazimento de coágulos sanguíneos que ocorre em doenças cardiovasculares).

Estudo de pesquisadora da Fiocruz Amazonas pode oferecer uma nova opção na produção de medicamento direcionado para doenças cardiovasculares (foto: Érico Xavier/Fapeam)

Para a pesquisa foi realizada a seleção de aproximadamente 150 micro-organismos produtores de proteases. Cerca de 30% desses produtores são de ação fibrinolítica. Todos os testes foram feitos em laboratório em placas de fibrina que simulam a cascata de coagulação no organismo humano. "Esse é o primeiro passo para chegarmos ao medicamento. Temos que ter o microrganismo produtor do material e as condições prévias para essa produção. Isso já estamos fazendo. O próximo passo serão os ensaios clínicos, testar em pequenos animais, ou seja, estimular um coágulo sanguíneo e testar a enzima para saber de que forma ela está agindo", disse a pesquisadora.

O projeto de pesquisa está sendo desenvolvido com aporte financeiro da Fapeam no âmbito do Programa de Pesquisa para o Sistema Único de Saúde (PPSUS), desenvolvido em parceria com o Ministério da Saúde e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O programa apoia, com recursos financeiros, projetos de pesquisa que visem à promoção do desenvolvimento científico, tecnológico e de inovação na área de saúde no Amazonas.

O estudo pode oferecer uma nova opção na produção de medicamento direcionado para doenças cardiovasculares. Para a pesquisadora, com o surgimento de novos remédios, a tendência é que os produtos fiquem com o preço cada vez menor, devido à concorrência no mercado, beneficiando a população. "O que queremos mostrar é que a biodiversidade amazônica tem esse potencial de investimento biotecnológico, tanto que estamos encontrando esses microrganismos produtores dessas enzimas e, quando vamos relacionar com o que é encontrado na literatura com outros microrganismos de outras regiões, e de países, em alguns casos, nossa produção é bem melhor que a deles", afirmou Ormezinda.
Coleção de fungos e bactérias
Na Fiocruz Amazonas, existe uma coleção de fungos e bactérias que, segundo a pesquisadora, é responsável pela conservação de recursos genéticos ex-situ, que têm como função principal a aquisição, caracterização, manutenção e distribuição de micro-organismos autenticadas, permitindo o desenvolvimento das atividades com mais segurança nos resultados. Além disso, o estudo também é realizado em parceria com a Universidade Federal do Amazonas (Ufam), especificamente com o pesquisador Raimundo Felipe Cruz, do laboratório de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB).

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Fiocruz busca potencial farmacológico de fungos e bactérias

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Com apoio do governo do Estado via Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (Fapeam), a pesquisadora do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz Amazonas), Ormezinda Fernandes, está desenvolvendo um estudo para buscar em fungos e bactérias da região Amazônica potencial farmacológicpara tratamento de doenças cardiovasculares.

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Bio-Manguinhos/Fiocruz apresenta o processo de fabricação de uma vacina.

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Os microrganismos são utilizados há milhares de anos na produção de bebidas e alimentos através do processo de fermentação, empiricamente mesmo quando as pessoas não sabiam direito o que eram microrganismos. Frutas e cereais são empregados na fabricação das mais variadas bebidas alcoólicas, como o vinho e a cerveja, e, posteriormente, destilando certos fermentados obtém-se as chamadas bebidas destiladas, como o uísque, vodka, saque e cachaça. Alimentos como os muitos tipos de queijos existentes são obtidos através da fermentação do leite.

Porém com os avanços dos conhecimentos sobre os microrganismos, houve não só a melhoria das técnicas tradicionais na produção de bebidas e queijos, como também nas técnicas de esterilização de embalagens e na pasteurização de alimentos. Não só a industria alimentícia se beneficiou, pois há várias aplicações de microrganismos para a produção de medicamentos, na bioengenharia e no controle de pragas e descontaminação ambiental.

A produção de medicamentos a partir de microrganismos, como a penicilina obtida de fungo, também foi melhorada e outros medicamentos foram produzidos, contudo a biotecnologia, originária dos avanços do conhecimento e das técnicas de recombinação genética, abriu novos horizontes para a indústria farmacêutica. O melhor exemplo é a produção de insulina, que anteriormente era de origem bovina, o que acarretava altos custos de produção e beneficiamento do produto, além de não ser apropriada a muitos insulinodependentes, porém com a obtenção de bactérias transgênicas, nas quais são inseridas as informações genéticas humanas para a produção de insulina, estes microrganismos a produzem não só somente em grande quantidade, com custo relativamente mais baixo, mas como também o produto final é perfeitamente compatível com todos os usuários, pois a insulina produzida é, geneticamente, de origem humana.

Uma doença bastante comum em certas culturas é a galha da coroa, causada por uma bactéria, Agrobacterium tumefaciens, que penetra no tecido vegetal e cria tumores causada pela indução de um crescimento desordenado das células. Esta capacidade de penetração foi utilizada pelos especialistas em genética para a criação de versões transgênicas da Agrobacterium, substituindo as informações genéticas que produzem tumores por informações de interesse, como produção de substâncias inseticidas ou resistências a pesticidas. Há ainda a utilização de outras bactérias e vírus tanto em produção agrícola quanto na pesquisa em técnicas com tecidos animais.

Algumas culturas sofrem grandes perdas devido à ação direta de insetos que as danificam ou, indireta, por serem vetores de outras pragas, assim, tem-se empregado atualmente microrganismos para seu controle biológico. A utilização de microrganismos é muito menos nociva a saúde humana que os inseticidas industriais e esta prática aponta como uma vertente econômica bastante viável. Esta é a técnica usada, por exemplo, na produção de alimentos orgânicos.

Sendo muitos microrganismos capazes de metabolizar inúmeros compostos químicos que os organismos superiores não conseguem, estes estão sendo empregados atualmente em na biorremediação, a fim de limpar lixo tóxico e poluentes eliminados no meio ambiente. Alguns fungos, mas principalmente bactérias, utilizam-se destas substâncias como forma de energia e os resíduos por elas gerados são na maioria das vezes inócuos ou de menor toxicidade.
Microrganismo X Saúde humana
Quando pensamos na relação entre os microrganismos e a saúde humana, a primeira ideia que nos surge é uma só: doenças. Sem dúvida este é um aspecto importante, mas a nossa relação com os microrganismos é muito mais do que isso. Em nossa pele, ouvidos, cavidade oral e vias aéreas superiores, órgãos genitais e principalmente no aparelho digestivo, mais significativamente nos intestinos pululam microrganismos, especialmente bactérias, sendo as mais comuns dos gêneros Staphylococcus e Streptococcus. Esta relação é tão íntima e importante que alguns pesquisadores chegam a afirmar que não somos inteiramente humanos. Parece exagero, porém há muito se sabe que 50% a 70 % do peso seco das fezes humanas é composto de microrganismos. Mas, os números são mais surpreendentes ainda. Há estimativas de que algo em torno de 90% das células que formam nosso intestino são compostas por bactérias - são aproximadamente 100 trilhões de microrganismos, com mais de mil espécies. Estima-se também que somente na boca haja pelo menos 800 espécies.

Mas, qual a importância delas para nós? Nossos intestinos são somente um reservatório de bactérias e outros microrganismos? A resposta é também surpreendente, pois estes minúsculos seres, que formam a chamada flora intestinal, realmente tiram proveito do local em que se encontram, obtendo proteção e nutrientes, mas nós também dependemos deles para as mais variadas funções. Muitas bactérias que ali residem sintetizam vitaminas como a K e algumas do complexo B, ajudam a degradar substâncias do nosso próprio metabolismo e outras como fibras e açúcares que não somos capazes de metabolizar. Além disso, a competição com outros microrganismos danosos ao nosso organismo que eventualmente venham a invadi-lo garante que estes não se proliferem. Muitas doenças estão relacionadas a este desequilíbrio entre a presença ou ausência dos microrganismos que residem em nós. Há ainda muito a ser investigado sobre a nossa relação com os microrganismos.

Mas, os microrganismos que se encontram harmonicamente vivendo em determinada região do nosso corpo, quando por qualquer motivo venham a parar em outra região, podem causar sérios danos. E há além desses, aqueles provenientes do ambiente externo, trazidos pela ingestão de água e alimentos, pelo ar, por aberturas na nossa pele e pelo contato com sangue ou fluídos corporais de uma pessoa infectada, além de picadas de insetos ou mordidas de animais. A lista de doenças de origem microbiana é imensa, assim como as formas de tratamento e profilaxia, variando conforme o organismo em questão. Cada grupo de microrganismo possui características diferentes e mesmo dentro de um determinado grupo há um universo de formas de ação, assim bactérias, por exemplo, muitas vezes liberam toxinas que podem causar sérios danos ao organismo, ou vírus que infectam células específicas, a fim de se reproduzir, levando-as a destruição.

Fonte: Acervo Pessoal Rosemary Araújo

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Os microrganismos são utilizados há milhares de anos na produção de bebidas e alimentos através do processo de fermentação, empiricamente mesmo quando as pessoas não sabiam direito o que eram microrganismos. Frutas e cereais são empregados na fabricação das mais variadas bebidas alcoólicas, como o vinho e a cerveja, e, posteriormente, destilando certos fermentados obtém-se as chamadas bebidas destiladas, como o uísque, vodka, saque e cachaça.

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Bom Dia Amazônia | Pesquisadores amazonenses estudam microrganismos para produção de medicamentos | Globoplay

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Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina

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Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina

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MEDICINA VETERINÁRIA

Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina

Production of biocompounds with antimicrobial activity of Streptomyces sp. Isolated in face of goat mastitis

I Universidade Federal Rural de Pernambuco - Recife, PE

II Universidade Federal do Amazonas - Coroado Manaus, AM

III Unidade Acadêmica de Garanhuns - Universidade Federal Rural de Pernambuco - Garanhuns, PE

RESUMO

Actinomicetos são um dos principais produtores de enzimas, vitaminas e metabólitos secundários, destacando-se o gênero Streptomyces, o qual tem uma ampla capacidade de produção de antibióticos eficazes no combate a diferentes microrganismos, entre eles o Staphylococcus sp. Em virtude dessa eficiência no combate a patógenos, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana produzidos por 67 Streptomyces isolados de liquens da região amazônica, ante isolados de mastite caprina ( Staphylococcus aureus) do estado de Pernambuco, Brasil. Foi utilizado um planejamento fatorial para avaliar a influência das fontes de carbono (glicose) 0%, 0,5% e 1% e de nitrogênio (farinha de soja) 1%, 2,5% e 4% na produção dos antimicrobianos, bem como das variáveis pH, biomassa e atividade antimicrobiana. Dos Streptomyces estudados, o DPUA 1566 foi o que se destacou por formação de halos de inibição entre 18 e 26mm ante os isolados de mastite caprina. Foi possível verificar que a fonte de carbono inibiu a produção de antimicrobianos quando submetidos a uma concentração de glicose de 1%; com a retirada desta, os Streptomyces apresentaram uma elevada capacidade de produção de metabólitos com atividade antimicrobiana tendo potencial para o tratamento de mastite caprina.

Palavras-chave: cabra, actinomicetos, Staphylococcus aureus, mastite

ABSTRACT

Actinomycetes are a leading producer of enzymes, vitamins and secondary metabolites, especially the genus Streptomyces, which have a large capacity for the production of natural antibiotics and are effective against various micro-organisms including Staphylococcus sp. Due to this efficiency in combating micro-organisms, the aim of this study was to evaluate the production of metabolites with antimicrobial activity produced by Streptomyces isolated from lichens 67 in the Amazonia, compared to isolates from goat mastitis (Staphylococcus aureus) in the state of Pernambuco, Brazil. We used a complete factorial design to evaluate the influence of concentrations of carbon sources (glucose) at 0%, 0.5% and 1% and nitrogen (soybean flour) at 1%, 2.5% and 4% in the production of antimicrobial metabolites, and the influence of the pH, microbial biomass and activity variables. Of the studied Streptomyces DPUA 1566 what stood out was the formation of inhibition halos between 18 to 26 mm compared to the isolates from goats mastitis. It was noted that the carbon source inhibited the production of antimicrobial metabolites when subjected to a glucose concentration of 1%. However, after the discontinuation, Streptomyces showed a high capacity to produce metabolites with antimicrobial activity, which has an excellent potential for the treatment of mastitis in goats.

Keywords: goat, Actinomycetes, Staphylococcus aureus, mastitis

INTRODUÇÃO

O Streptomyces é o principal gênero utilizado para a produção de antibióticos.O número de compostos antimicrobianos declarados oriundos de espécies desse gênero por ano aumentou quase exponencialmente em cerca de três décadas, demonstrando, assim, que esse grupo de microrganismos permanece sendo uma fonte promissora para a produção de novos agentes antimicrobianos. Devido a sua alta capacidade de produzir uma grande variedade de metabólitos (antibióticos, vitaminas e enzimas), os Streptomyces e outros actinomicetos são responsáveis por cerca de três quartos de todos os produtos conhecidos (Vijayakumar et al., 2011; Gama et al., 2012; Pacheco da Rosa et al., 2013).

O desenvolvimento de fármacos eficientes no combate a infecções bacterianas revolucionou o tratamento médico, ocasionando a redução drástica da mortalidade causada por doenças microbianas (Rang et al., 2003; Silveira et al., 2006). Entretanto, o uso inadequado e excessivo desses antimicrobianos leva ao desenvolvimento de microrganismos resistentes, tornando-se uma ameaça para a saúde pública.

Muitas infecções hospitalares, comunitárias e intoxicações são causadas principalmente por bactérias do gênero Staphylococcus, além de algumas doenças de importância veterinária, como a mastite. É a principal doença contagiosa em diversos rebanhos, como caprinos e bovinos, a qual constitui uma inflamação da glândula mamária, que aumenta a contagem de células somáticas (CSS) e diminui a produção e a qualidade do leite (Peixoto et al., 2013). A mastite é a principal doença dos rebanhos leiteiros no mundo inteiro, causando prejuízos econômicos tanto aos pequenos produtores de leite quanto à indústria de lacticínios, afetando toda a cadeia produtiva (Tozzeti et al., 2008; Mota et al., 2012).

A mastite pode reduzir a quantidade e a qualidade do leite produzido; o seu agravamento pode levar à perda total da capacidade secretora da glândula mamária (Ribeiro et al., 2003), somando-se a isso prejuízos ocasionados com gastos com medicamentos e assistência veterinária, inutilização de leite contaminado após tratamento, descarte precoce de animais doentes, o que pode prejudicar a cultura desses animais (Freitas et al., 2005; Cunha et al., 2006). A mastite clínica caprina é causada por S. coagulase positiva ( S. aureus), e a mastite subclínica, sobretudo, por S. coagulase negativa (SCN), sendo os principais SCN: S. epidermidis, S. chromogenes e S. simulans, S. caprae e S. agalactiae (Contreras et al., 2003 e Neves et al., 2010). A literatura evidencia que o S. aureus é o maior causador de mastite em ruminantes incluindo cabras leiteiras, acarretando casos mais severos de mastite (Taponen e Pyorala, 2009; França et al., 2012).

Em face da necessidade de desenvolvimento de agentes antimicrobianos eficientes ante agentes patogênicos resistentes, o presente trabalho tem como objetivo selecionar um Streptomyces isolado de liquens da região amazônica, produtor de biocompostos com atividade antimicrobiana, ante isolados de mastite caprina do estado de Pernambuco.

MATERIAL E MÉTODOS

As amostras de Streptomyces foram isoladas de liquens da região amazônica, pertencentes à coleção de culturas DPUA (Departamento de Parasitologia da Universidade Federal do Amazonas), totalizando 67 isolados. Os isolados foram mantidos no meio ISP-2 (Pridham et al., 1957), semeados em placas de Petri incubadas a 30ºC por 168 horas e preservados pelo método de Castellani (Castellani, 1939). Para a esporulação, foi utilizado meio ISP-2 modificado pela retirada de glicose.

Os microrganismos teste foram Staphylococcus aureus isolados de mastite caprina pertencente a rebanhos de fazendas da região agreste do estado de Pernambuco-Brasil. O ágar nutriente (AN) foi utilizado como o meio de manutenção, e os microrganismos foram preservados como cultura estoque em criotubos utilizando-se glicerol 10% (v/v), mantidos a -20ºC.

A produção de metabólitos foi estimada por meio da técnica de bloco de gelose (Brown et al., 1976), utilizando-se Staphylococcus aureus como microrganismo teste. Foi usado o meio de cultura ágar Müeller Hinton em placas de Petri (90x15mm de diâmetro). A superfície foi semeada em uma suspensão das células de S. aureus crescido previamente em TSB (Tryptic Soy Broth) por 24 horas, na concentração de 10 ⁸ UFC/mL.

Em cada placa teste foram sobrepostos fragmentos de 6mm, retirados da área central das culturas dos actinomicetos crescidos em meio ISP-2 sólido, que foi modificado pela retirada da glicose a 30ºC por 168 horas, e incubados por 24 horas a 37ºC. A produção de biocompostos com atividade antimicrobiana foi verificada pela formação de halos claros de inibição do crescimento microbiano e expressos em milímetros (mm). O efeito inibitório ante os microrganismos testados foi classificado de acordo com Sahin e Ugur (2003), sendo o tamanho da zona de inibição dividido em quatro grupos distintos: grupo passivo - zona de inibição menor que 10mm; grupo ligeiramente ativo - zona de inibição entre 11 e 20mm; grupo moderadamente ativo - zona de inibição entre 21 e 30 mm; e grupo altamente ativo, cuja zona de inibição é maior que 31mm.

Para a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana pelo actinomiceto selecionado, foi utilizado o meio MS-2 (Porto et al., 1996); para a produção dos metabólitos com atividade antimicrobiana, este foi composto por: 2,0% (p/v) de farinha de soja, 0,06% (p/v) de MgSO ₄.7H ₂O, 0,1% (p/v) deNH ₄Cl, 0,435% (p/v) de K ₂HPO ₄ e 0,1mL de solução mineral (100mg de FeSO ₄, MnCl ₂. 4H ₂O, ZnSO ₄, CaCl ₂. H ₂ O em 100mL de água destilada, com pH inicial 7,0) modificado pela retirada da glicose.

Foram utilizados Erlenmeyers (250mL) contendo 60mL de meio de cultura, o inóculo de 10 ⁸ UFC/mL foi incubado em agitador orbital (200rpm) a 28ºC. O crescimento celular, a curva de pH e a determinação da atividade antimicrobiana foram determinados após 24, 48, 72, 96 e 120 horas de fermentação.

A atividade antimicrobiana foi estimada empregando-se o método da difusão em disco descrito por Ericsson e Sherris (1971) utilizando-se S. aureus, isolado de mastite caprina do estado de Pernambuco. Os sobrenadantes aliquotados a cada 24h durante a fermentação em MS-2 do isolado de Streptomyces sp. DPUA 1566 previamente selecionado foram utilizados para impregnar os discos de papel-filtro (com 5mm) e aplicados na superfície da placa teste (24h a 37ºC).

Os ensaios foram realizados como recomendado pelas normas da NCCLS (National..., 2003), com o meio de cultura ágar Müeller Hinton, onde foi inoculada, com auxílio de um swab estéril, uma suspensão dos microrganismos teste (10 ⁸ UFC/mL) crescidos em TSB por 24 horas. A atividade antimicrobiana foi detectada pela presença de zonas de inibição expressa em milímetros, considerando-se os valores médios das duas repetições.

Os estudos de produção foram realizados com um auxílio de um planejamento fatorial 22 com quatro pontos centrais, avaliando-se as concentrações de fontes de nitrogênio e de carbono ( Tab. 1). As variáveis respostas foram crescimento da biomassa, pH e atividade antimicrobian. Todos os resultados foram analisados com auxílio do software Statistica 8.0 (Statsoft Inc, 2008).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram analisados 67 isolados de Streptomyces para produção de metabólitos com atividade antimicrobiana, dos quais 10 apresentaram produção de biocompostos com atividade antimicrobian ante os S. aureus isolados de mastite caprina, correspondendo a aproximadamente 17% do total de isolados. As atividades foram verificadas com a presença de halos de inibição, os quais variaram de 10 a 26mm.

O espectro de ação das biomoléculas obtidas a partir de Streptomyces ante os isolados de mastite caprina apresentou perfil de inibição semelhante às atividades antimicrobianas dos Streptomyces, sendo estas classificadas em diversos grupos, de acordo com a Tab. 2.

Resultados obtidos por Sahin e Ugur (2003) corroboram os resultados relatados neste estudo, em que classificaram o Streptomyces isolates como moderadamente ativo ante os Staphylococcus xylosus (MU29), S. epidermidis (MU30), S. aureus (ATCC6538/P) e S. aureus (MU38), os quais formaram zonas de inibição maiores que 20mm. Mitra et al. (2011), ao estudarem 11 actinomicetos isolados de solo de estuário da ilha de Sagar, Índia, obtiveram, assim como os resultados apresentados neste trabalho, uma atividade antimicrobiana ante os S. aureus (MTCC 96) de 11 a 23mm de zona de inibição, confirmando os resultados encontrados na literatura.

Entre os actinomicetos estudados, o que apresentou melhor atividade antimicrobiana após 24 horas foi o Streptomyces sp. DPUA 1566, o qual obteve halos de inibição de 26mm ante os isolados de mastite caprina. O tamanho do halo de inibição de 26mm, obtido (DPUA 1566) encontra-se dentro dos padrões já descritos pela literatura. Al-Zahrani (2007) e colaboradores estudaram Streptomyces sp., isolado de Jazan (J12) ante os S. aureus e Bacillus subtilis, e obtiveram halos de inibição de 26mm e 25mm.

Os metabólitos secundários, como, por exemplo, os antibióticos, são sintetizados por várias vias metabólicas e também por espécies geneticamente distintas, sendo sua produção afetada por diferentes condições ambientais.

Parâmetros da fermentação, tais como: tempo, temperatura, pH e nutrientes, podem ser modificados visando ampliar a quantidade dos metabólitos secundários produzidos (Pfefferle et al., 2000). Em virtude desses parâmetros, foram estudados os componentes do meio de cultivo, ou seja, foram modificadas as concentrações da fonte de carbono (glicose) e da fonte de nitrogênio (farinha de soja) na produção de antibiótico por Streptomyces sp. DPUA 1566, sendo utilizado um planejamento fatorial completo para avaliação da influência desses componentes na produção do metabólito antimicrobiano ( Tab. 1).

Foram observadas a fase característica de crescimento microbiano do Streptomyces DPUA 1566 em meio MS-2, a fase lag de 24 horas, ou seja, o período de adaptação do microrganismo ao meio de cultura, a fase exponencial característica com crescimento microbiano máximo em 72 horas e, em seguida, a fase estacionária e a de declínio com 120 horas de fermentação ( Fig. 1).

Apenas foi detectada atividade antimicrobiana no tempo 72 horas, ou seja, no final da fase exponencial e início da estacionária. Estes resultados estão de acordo com os descritos pela literatura. Yu et al. (1999) descreveram que a produção de metabólitos secundários pelos actinomicetos em meio líquido é limitada à fase estacionária, que frequentemente coincide com a escassez dos nutrientes do meio de cultura.

O pH do meio, que inicialmente foi 7,0, elevou-se a 8,0 no final da fermentação, o que corrobora os resultados apresentados por Carneiro da Cunha et al. (2010), que, ao utilizarem Nocardia sp. DPUA 1571, também em meio MS-2, tiveram o pH do meio de cultivo também aumentado de 7,0 para 8,5 ao final da fermentação.

O conteúdo proteico era elevado no início da fermentação, devido ao filtrado de farinha de soja, que é rico em proteínas, porém ocorreu uma diminuição das proteínas totais inicialmente, em razão da utilização dela pelo actinomiceto. Em seguida, foi observado um pequeno aumento no seu valor, possivelmente devido à produção de outros metabólitos microbianos de origem proteica.

Pode-se verificar que os ensaios fermentativos 3 e 4 ( Tab. 3) não apresentaram atividade antimicrobiana e ambos possuem como característica comum a concentração de glicose 1%. Esse comportamento foi confirmado por meio da análise estatística dos dados, a qual apresentou como única variável significativa a concentração de glicose, que apresentou um efeito negativo. Isso significa que o maior nível dessa variável foi prejudicial à produção de metabólitos antimicrobianos.

Sanchez e Demain (2002) afirmaram que, apesar de as fontes de carbono, como a glicose, serem comumente utilizadas para o melhor crescimento para produção de enzimas, antibióticos e outros metabólitos secundários, essa produção é frequentemente limitada devido à presença de um mecanismo regulador denominado de regulação do carbono catabólito (RCC). Este cataboliza rapidamente o suprimento de carbono e energia para o crescimento do microrganismo, reprimindo e esgotando o substrato primário, o que, consequentemente, prejudica a produção de enzimas e metabólitos secundários pelo microrganismo.

A Tab. 4 apresenta os efeitos estimados das variáveis e das interações entre elas (concentração de soja e concentração de glicose) sobre as respostas (atividade antimicrobiana, biomassa e pH). Os valores com asterisco foram os efeitos estatisticamente significativos, com nível de confiança de 95%. Fenômeno semelhante ao da atividade antimicrobiana ocorreu para o pH, ou seja, a concentração de glicose influenciou negativamente o pH, apresentando efeito significativo e negativo. Quando a concentração de glicose foi 1%, o pH do meio fermentado se acidificou (pH 5,0), enquanto no meio sem adição de glicose o pH ficou alcalino (pH 8,0). Esse comportamento pode ser explicado pela utilização da glicose pelos Streptomyces para produção de ácidos pela via glicolítica, segundo Dekleva e Strohl (1987).

Análise semelhante foi realizada para a resposta biomassa e verificou-se que também apenas a concentração de glicose apresentou efeito significativo, porém esse efeito foi positivo ( Tab. 3), ou seja, a adição de glicose 1% ao meio de cultivo favoreceu o crescimento da biomassa. Tal resultado difere dos estudos realizados por outros autores, como Moreira et al. (2001), que, ao utilizarem o mesmo meio de cultura MS-2 no crescimento de Streptomyces clavuligerus, sem, entretanto, adicionar 1% de glicose ao meio de cultura, obtiveram um decaimento da biomassa após 50 horas de crescimento, o que ressalta a influência da glicose no aumento da biomassa.

CONCLUSÕES

Estes resultados permitem concluir que o Streptomyces sp. DPUA 1566 foi capaz de produzir biocompostos com atividade antimicrobiana capaz de inibir o crescimento de cepas patogênicas de Staphylococcus aureus isolados de caprinos portadores de mastite. A fonte de carbono (glicose) apresentou efeito

negativo na fermentação do actinomiceto para a produção de metabólitos com atividade antimicrobiana, sendo sua ausência essencial para o desenvolvimento do biocomposto.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao auxílio financeiro concedido pelo PNPD/Capes e pelo CNPq.

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Recebido em 5 de julho de 2012

Aceito em 8 de maio de 2013

E-mail: analuporto@yahoo.com.br

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Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina

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MEDICINA VETERINÁRIA Produção de biocompostos com atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. ante isolados de mastite caprina Production of biocompounds with antimicrobial activity of Streptomyces sp.