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Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos con bacterias

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INTRODUCCIÓN

En México, por medio de una Auditoría Ambiental se identificaron 800 toneladas de suelo contaminado por hidrocarburos producto de la minería de los 90's (1995).

El estudio realizado permitió a los investigadores identificar a los microorganismos como la primera fuente de biodegradación para este tipo de contaminantes.

La eficiencia de esta técnica se ve determinada por las características del medío que las rodea. En este aspecto los lodos provenientes de las aguas domésticas son una rica fuente de nitrógeno inorgánico, fósforo y materia orgánica.

La bioestimulación de estos lodos ha demostrado ser una fuente sustanciosa y efictiva para un crecimiento progresivo.

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biorremediacion de suelos contaminados por hidrocaruros con lodos

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Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos utiizando estiercol y aserrin

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Efectividad de los bioestimuladores de compost, lombricompost para biorremediacion de suelos contaminados

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biorremediacion de suelos contaminados por hidrocaruros Utilizando Bacillus pumillus

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En este estudio de investigación realizada Vizueta, Pascual, Taco y Morales (2020) nos menciona lo siguiente:

La explotación petrolera en el Ecuador abarcó dos épocas importantes en el periodo 1911 - 1960, siendo la península de Santa Elena la primera zona de exploración y explotación.

La explotación en la Amazonía ecuatoriana es responsable de la deforestación de 2 millones de hectáreas, además el derrame de 650 000 barriles de crudo en bosques, ríos y esteros de sustancias tóxicas.

Debido a los numerosos derrames de petróleo, varias empresas decidieron estudiar tecnologías de biorremediación.

Los microorganismos son muy usados para los temas de descontaminación, debido a que estas usan como fuente de carbono al petróleo y sus componentes para hacer su metabolismo.

La recuperación de un ambiente contaminado con hidrocarburos por medio de la biorremediación requiere un adecuado estudio y caracterización de los microorganismos presentes.

En cuanto a las bacterias, son más de 100 las especies existentes , distribuidas en 30 géneros microbianos, capaces de usar los hidrocarburos como fuente de carbono, como el Achromobacter, Acinetobacter, Bacillus entre otros.

Los microorganismos necesitan de buenos medios que permitan su aislamiento a partir de muestras contaminadas con hidrocarburos, asimismo se deben analizar todos los factores como pH, temperatura, proporción etc.

Se determina también el uso de otros organismos como hongos, algas, Cianobacterias y Actinomicetos para la degradación de compuestos tóxicos en el suelo.

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Se efectuó a través de pruebas a escala de laboratorio en 2 dos etapas y una en piloto.

La procedencia del suelo a tratar es de los talleres del grupo Goldcorp México.

Los lodos residuales (biosólidos) se recolectó de la PTAR.

La concentración de hidrocarburos del petróleo se determinó empleando la técnica TNRCC Method 1005.

Pruebas de degradabilidad.

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En estas etapas se realizaron por un periodo de 50 días, lo cual se monitoreó pH, CE y la concentración de HTP.

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Para determinar la relación C:N se calculó mediante la ecuación de Tchobanoglous.

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Se realizó el balance de nutrientes de acuerdo a las pruebas de laboratorio, empelando un fertilizante comercial y sulfato de amonio.

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OBJETIVO
Evaluar la efectividad de los bioestimuladores compost, lombricompost y abono verde en la biorremediación de suelo contaminado con aceite automotriz de talleres de mantenimiento.

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MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar de ejecución

En el Invernadero del campus de la Universidad Peruana Unión altura del Km 7 de la carretera salida Arequipa – Juliaca.

Los análisis Físicos con certificación en el laboratorio RHLAB S.A.C., ubicado en la provincia de San Román - departamento de Puno.

Y el análisis de hidrocarburos totales de petróleo se enviaron a la ciudad de Lima por contacto de RHLAB S.A.C. Juliaca.

MUESTREO DE SUELOS PARA REALIZAR LA CONTAMINACIÓN:

Se recolectar 4 kg de suelo.

Para la construcción de las biopilas, se fabricaron nueve cajas de 25 cm ancho, 35 cm de largo y 15 cm de alto, éstas hechas de material triplay.

PREPARACIÓN DE TRATAMIENTOS
COMPOST

Marca: J. Bonanza
Tipo: Abono Natural
Composiciones: Origen vegetal (Residuos Orgánicos)
Fuente: promart.pe

LOMBRICOMPOST

Marca: J. Bonanza
Tipo: Abono Natural
Composiciones: Origen animal (humus de lombriz)
Fuente: promart.pe

ABONO VERDE

Restos de RAY GRASS que se desechan de las áreas verdes de la UPeU

DOSIS DE LOS TRATAMIENTOS

Con 4 kg de suelo en bolsas de polipropileno fueron instaladas en las nueve biopilas.

Luego se midió un 1L de aceite lubricante automotriz en la probeta de 1000 ml, se mezclo.

Para los tratamientos de:

Compost y lombricompost se pesó 4 kg de suelo se mezcló con 1 kg compost, haciendo un total de 5 kg.

Abono verde, se pesó 1 kilo de RAY GRASS para mezclar con el suelo de 4 kg, haciendo un total de 5 kg.

Se acondiciono a los tratamientos

ACONDICIONAMIENTO DE LOS TRATAMIENTOS:  El experimento se instaló en el invernadero de la Universidad Peruana Unión.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Es el Diseño Completamente al Azar (DCA),  con tres repeticiones obteniendo un total de 18 muestras, a estas se realizaron 5 análisis físicos.
MATERIALES Y EQUIPOS:

Materiales de laboratorio

Probeta de 1000 ml

Embudo

Papel filtro

Pipeta 10 ml

Crisol

Varilla

Vaso precipitado

Desecador de vidrio

Pinza

Materiales de campo

Bolsas de polipropileo

Guantes látex

Pala grande

Pala pequeña

Cámara fotográfica

Etiquetas

Reactivos

Agua destilada

Equipos

Multiparametro WTW modelo MULTI3620IDS

Cromatógrafo de columna

Estufa marca Binder FD 23

Balanza analítica marca Sartorius modelo ENTRIS64-1S, 60 x 0.0001 g

Materiales de las biopilas

Madera triplay

Cintas de madera

Cola sintética

Clavos de 2cm

Cinta métrica

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Los resultados de la investigación son de análisis físicos y contenido de hidrocarburos de petróleo en el suelo de los tratamientos realizados.
4.1 Resultados:
4.1.1. Caracterización del suelo
Se obtuvo pH 6.48, conductividad eléctrica 783.45, Capacidad de campo 16.87, humedad 16.08 y temperatura 20.57. En cuanto al pH se observa que es ligeramente acido esto afirma que son de suelos ácidos de 5.6 – 6.5.  En cuanto a la conductividad eléctrica es 783.45 es inferior a 800 por lo tanto se recomienda trabajar hasta con este límite de contaminación
4.1.2. Hidrocarburos totales de petróleo
Tipo de muestra: Aceite lubricante residual:
a:  Los resultados obtenidos en el tratamiento de compost se observan que está bajo los estándares de calidad ambiental.
b:  En el segundo tratamiento con lombricompost obtuvo una disminución similar al primer tratamiento de LD 1.5 se obtiene un resultado de <1.2
c:  En el tercer tratamiento con abono verde se obtuvo un resultado mucho menor que los tratamientos anteriores, es decir, menor a 1.1 la representación proporcional de LD 1.5; por lo tanto, indica que hay menor presencia de hidrocarburos.
4.2 Supuestos:
4.2.1. Prueba de normalidad
Para la prueba de normalidad de los tratamientos con respecto al pH, se opta por la prueba de Shapiro – Wilk, ya que es utilizada cuando la muestra es menor a 50 datos.
4.2.2. Prueba de homogeneidad de varianzas
Para la prueba de homogeneidad de varianzas se usó el estadístico de Levene, el cual nos permite contrastar la hipótesis de igualdad de varianzas poblacionales. En este caso el grado de significancia de los resultados tiene una distribución normal; porque son mayores a 0.01; por lo tanto, aceptamos la igualdad de varianzas.
4.3. Análisis de varianza:
El análisis de varianza se realizó por el método de Anova, se determinó que, en cuanto a conductividad eléctrica, no existe un grado de significancia, es decir no hubo variabilidad de resultados con los tratamientos, entonces aceptamos la hipótesis nula y concluimos que no hay suficiente evidencia estadística para inferir que la hipótesis nula es falsa.
Por el método de Anova también se determinó que en éste parámetro no existe diferencia estadística significativa, es decir no hubo variabilidad de resultados con los tratamientos, entonces aceptamos la hipótesis nula.  También en la tabla ANOVA de tratamientos se determinó que en éste parámetro (humedad) no existe un grado de significancia.
4.4. Comparaciones:
El análisis paramétrico se realiza para hacer comparaciones múltiples, en este caso cuál de los tratamientos fue el mejor; para esto se usó las pruebas de Tukey y Duncan.
Estos indica que en la relación AV-C, existe una diferencia mínima, en AV- LC existe una gran diferencia de resultados, y la relación LC-C no existe variabilidad notable; en cuanto a la relación con el LC se debe a que el lombricompost trabaja con una temperatura constante de 20 °C – 30 °C por lo que indica mayor temperatura a diferencia de los tratamientos con abono verde y compost que no se limitan a una temperatura definida

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Al evaluó la efectividad de los bioestimuladores:

Compost Lombricompost Abono verde

En la biorremediación de suelo contaminado con aceite automotriz.

En la eliminación de hidrocarburos:

Abono verde presentó mayor eficiencia con (27%) logrando un resultado (<1.1), comparando con la normativa está dentro del rango aceptable para suelos contaminados

Lombricompost en (20%) y compost (20%).

Concluyendo que el abono verde es el método más efectivo para la eliminación de hidrocarburos.

Se recomienda:

Analisis de Hidrocarburos
Uso de Compost de estiércol
Uso de plantas nativas o especies tolerantes a los hidrocarburos.
Trabajar con pH 7 y T° 24.
Tener buenas condiciones de humedad para el desarrollo de las lombrices.

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Se desarrolló bajo un enfoque cuantitativo, en la modalidad experimental de tipo exploratoria.
- Se utilizaron 81 bacterias aisladas a partir de suelo contaminados por petróleo.
Los cultivos fueron recibidos en forma de suspensiones de células en glicerol al 20% (w/v) de la Colección de Cultivos del Departamento de Ciencias Biológicas de la  Escuela Superior Politécnica de Chimborazo . Estos fueron preparadas en un medio basal compuesto por:
-  Glucosa (4 g/l)
- Solución de sales traza (100mg/ml)
- Fosfato ácido de potasio (K2 HPO4 , 4 g/l)
- Agar(15 g/l)
- Nitrato de potasio (KNO3 , 2 g/l)

Fueron incubados a una temperatura de 28°C durante 5 días. Su crecimiento fue evaluado con códigos binarios:
- (1) Presencia de crecimiento.
- (0) Ausencia de crecimiento.

El objetivo fue comprobar si las bacterias usaron el nitrógeno del nitrato de potasio (KNO3 ) para su crecimiento como única fuente de nitrógeno.

Características Generales
- Forma
- Elevación
- Margen

-  Para determinar la capacidad degradadora se preparó un medio de cultivo enriquecido con petróleo, gasolina, y diésel.  Los suelos usados contenían diferentes valores de hidrocarburos, fueron de: 31000 ppm de hidrocarburos para suelo arcilloso y 46000 ppm para suelo arenoso.  Se incubaron a 28°C durante un mes, con revisiones periódicas cada cinco días.
Se realizó un diseño experimental AxB con dos repeticiones. El factor A estuvo relacionado a las diferentes cepas bacterianas aisladas de suelos contaminados con petróleo. El factor B constituyó los diferentes hidrocarburos usados en los medios de cultivo (arenoso y arcilloso).
Los datos fueron analizados con el programa estadístico Design, Management, and Statistical Research Tool (MSTATC)
En el cual se determinó el análisis de varianza y en los casos en que el análisis de varianza mostró diferencias significativas, se utilizo la prueba de Tukey al 5% de significancia.

Con los resultados de las pruebas fenotípicas y los valores obtenidos luego de realizar la prueba de Tukey, se construyó una base de datos.
La información fue procesada con el software estadístico NTSys.  Finalmente, los porcentajes fueron utilizados para construir un dendrograma mediante el uso del algoritmo Unweighted Pair Group Method with Aritmetic Means (UPGMA) del mismo programa.

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De los 90 cultivos recibidos, solamente 81 bacterias fueron recuperadas, purificadas y almacenadas, excluyendo del estudio 9 cepas porque no se lograron recuperar desde los stocks recibidos. En el caso de las tinciones, 5 bacterias resultaron Gram positivas, 66 bacterias fueron Gram negativas, 19 bacterias con presencia de capsula y 52 bacterias con ausencia de capsula.
Solamente 4 bacterias no crecieron a rangos de pH 4,5, 3,5 – 8,5 y 9,5, debido a que los suelos destinados a biorremediación no se encuentran a rangos de pH muy ácidos y básicos.

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La mayoría de bacterias dieron un resultado positivo en la determinación del uso de KNO3 como única fuente de nitrógeno ya que es un elemento fundamental en el metabolismo de los microrganismos.

La gran mayoría de bacterias resultaron ser Gram Negativas.

Se encontraron bacterias que soportaron temperaturas de:

37 °C , 50 °C ( bacterias que se podrían usar para la biorremediación de suelos en la Amazonía o lugares con temperaturas altas)

4 °C (12 bacterias que se pueden usar en derrames de petróleo a bajas temperaturas)

La gran mayoría de bacterias crecen en lugares con pH desde ácido a neutro.

Todos los 71 cultivos bacterianos crecieron en los cinco medios de cultivo estudiados. Estas bacterias son altamente eficientes para utilizar como fuente de carbono los hidrocarburos, el diésel, la gasolina y el petróleo, y que crecen bien en suelos con altos niveles de contaminación.

Los mejores resultados se obtuvieron con los medios de cultivo que se prepararon con extracto de suelo.

La cepa AX 67  e presentó un diámetro de crecimiento en los cinco medios de cultivo.

Los 18 grupos formados a partir de las 24 bacterias seleccionadas al azar, demuestran que existe una diversidad fenotípica muy grande,  siendo que varios de estos grupos de especie corresponden a nuevas especies de bacterias biodegradadoras.

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Se trabajó con dos lotes de suelo contaminados: HTP y textura.

51 191  ± 2 746 mg  HTP kg–1 suelo (ppm) E.L.

1752 ± 46 mg HTP kg–1 suelo E.P.

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Lee et al. (2007)

la adición de nutrientes tales como nitrógeno y fósforo en una relación de C:N:P .

trabajaron con volúmenes menores de suelo contaminado

Wan et al. (2001)

experimento en el cual mejoraron la degradación de hidrocarburos agregando materiales orgánicos (  lodos residuales ) .

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Proceso de biorremediación aerobia de suelo contaminado con hidrocarburos de petróleo
METAS :

tasas de remoción del 66 al 93 %.

mejor tratamiento fue el que contenía lodos residuales (biosólidos) .

La mineralización o madurez de los lodos influyó en la tasa de remoción de hidrocarburos .

La densidad como factor importante para aumentar el porcentaje de degradación .

Mantener los suelos a capacidad de campo y con aireación constante.

El empleo de desechos orgánicos de fácil degradación como aditivos o correctores de densidad .

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Microorganismos para Biodegradación de Petróleo en Suelos

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Microorganismos para Biodegradación de Petróleo en Suelos

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La  utilización  de  microorganismos  para  la boiodegradación

de  suelos  contaminados  ha contribuido a gran escala a la

implementación de esta tecnología. Según Higa  y Parr (1994)

los microorganismos  eficientes  consisten  en  cultivos  mixtos  de  microorganismos  beneficiosos  que pueden  ser  de  rigen  natural  autóctonos, además las  investigaciones  han  demostrado  que  la inoculación  de  estos  microorganismos  en  el  suelo  puede  mejorar la  calidad y mitigar  la contaminación.

Los  microorganismos  eficientes  residen  en  la  elección  de  especies  predominantes  de bacterias y hongos donde la capacidad de degradación de las comunidades microbianas aumenta la eficiencia de remediación transformando las sustancias tóxicas en menos tóxicas o la inexistencia de dichos compuestos (Dellagnezze, Gomes , & de Oliveira , 2018).

Hongos Biodegradadores.

Una nueva tecnología que atrae a la comunidad científica es la biodegradación mediante hongos,  debido  a  las  características  que  presentan  estos  microrganismos  que  cuentan  con  un sistema enzimático bien evolucionado que le permite crecer en cualquier medio, estos beneficios les otorgan las facilidades para degradar cualquier tipo de sustancias que pueden ser absorbidas y metabolizadas en sus células (Sardrood , Goltapeh , & Varma)

Trichoderma sp.

El género Trichoderma fue explicado por primera vez en 1794 por Persoon posteriormente,  Rifai  hizo  la  primera  asociación  en  especies  agregadas  que  se  maneja  hasta  la actualidad, siendo una especie de difícil identificación por presentar similitudes morfológicas. Son hongos saprofitos del suelo y de la madera con un crecimiento muy acelerado, las especies de este género se  pueden  encontrar  con  mucha  facilidad  en  cualquier  parte  del  globo  terráqueo,  pero

abundan en sitios donde existe mayor cantidad de materia orgánica en descomposición (Martínez & Infante, 2013).

Bacterias Biodegradadoras.

Las  comunidades  bacterianas  son  microorganismos  más  populares  al  momento  de  la degradación  de  hidrocarburos  de  petróleo  y  se  consideran  como  los  mayores  degradadores  de derrames  de  petróleo,  tienen  la  capacidad  de  alimentarse  exclusivamente  de  los  hidrocarburos (Mahmoud & Bagy , 2018).

Bacillus pumilus.

B.  pumilus  es  un  microorganismo  no  patógeno  que  se  halla  ya  sea  en  el  suelo o  agua; también conocido como la cepa QST 2808, además, es una bacteria formadora de esporas su forma es muy parecida a bastones el B. pumilus

es una bacteria Gram positiva, aeróbica y posee actividad

antifúngica y antibacteriana (Chamberlain & Chang, 2012).

Según Patowary, Saikia, y Kalitam (2014). En su estudio demostró que el B. pumilus tiende a  degradar  un  84,44%  de  TPH  a  las  cuatro  semanas  de  incubación  esta  bacteria  tiene  la particularidad de producir biosurfactantes.

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Determinar la capacidad para biodegradar hidrocarburos a base de bacterias nativas aisladas de suelos contaminados con petróleo.

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Porcentaje de Peso Húmedo y de Materia Orgánica.

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Porcentaje de Peso Húmedo y de Materia Orgánica.

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Esterilización del Suelo:    Instalación del Ensayo :        

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Esterilización del Suelo:    Instalación del Ensayo :        

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Preparación del Suelo y Adición del Hidrocarburo (Diésel).

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Preparación del Suelo y Adición del Hidrocarburo (Diésel).

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Este  estudio demuestra estar en lo correcto al momento de usarse un bioproducto basado en bacterias para la implementación de programas de biorremediación in situ o ex situ en la recuperación de suelos contaminados con hidrocarburos.
Solamente 71 bacterias del stock inicial mostraron crecimiento en el medio de cultivo con  KNO3, las cuales fueron usadas en la determinación de la capacidad biodegradadora.