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Consistem na adição de corante fluorescente, para que o DNA e o RNA sejam corados. Ao receber um feixe de laser, cada célula emite fluorescência, a qual é captada pelo sistema óptico e, com isso, o número de células é determinado.

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Material: citômetros de fluxo, como são chamados os equipamentos utilizados para esse fim, têm como princípio básico aspirar células ou partículas de uma suspensão previamente preparada e forçá-las a passar por uma câmara especial (flow cell) que faz com que as células fiquem envolvidas e centralizadas num fluxo contínuo de líquido (sheath fluid) e saiam desta câmara uma atrás da outra de modo que uma única célula seja interceptada pelo laser. Uma vez interceptada pelo laser, dois tipos de fenômenos físicos ocorrem e fornecem informações acerca da célula. Existem basicamente dois tipos de citômetros de fluxo disponíveis comercialmente. Um tipo, chamado de citômetro de bancada (banch-top flow cytometers), empregados principalmente em laboratórios clínicos, realizam somente as análises multiparamétricas das células. Já o outro tipo, chamado de cell sorters (separadores de células), apresentam mais recursos que os anteriores (até 11 cores), possuem lasers mais potentes refrigerados à água e possuem ainda a capacidade de separar fisicamente as células seletivamente de uma suspensão heterogênea (sorting).

1. Reagentes: Os fluorocromos oferecem um método sensível para obter informação acerca da estrutura, função e vitalidade das células. Existam dois modos de uso: (1) ligação covalente do fluorocromo à moléculas que se unem especificamente a componentes celulares, e (2) fluorocromos que variam suas características em função do microambiente que os cerca.

2. Técnicas imunofluorescentes - marcadores fluorescentes de ligação covalente: são fluorocromos que reagem e se usam para marcar proteínas, lipídeos ou outras moléculas biológicas. Devem ser suficientes seletivos e reativos. Se empregam cromóforos como grupos isotiocianato, clorotrirzinil, e ésteres de succinimida, por sua capacidade de união.

3. Fluorocromos que se ligam não covalentemente à estruturas celulares: são fluorocromos que devido a sua composição molecular especial se unem a determinados componentes celulares.

4. Marcadores fluorescentes que são sensíveis ao microambiente: certos fluorocromos podem ser empregados para estimar as propriedades do ambiente em que se encontram, posto que variam seu espectro de excitação ou emissão em função das características do microambiente que os cerca.

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Alguns dos parâmetros que podem ser medidos através da citometria de fluxo são, por exemplo, o volume das células e a complexidade morfológica, o DNA, o RNA, a viabilidade celular, a fluidez membranar, antígenos nucleares, a atividade enzimática, o ph, a análise e a classificação dos cromossomos, a apoptose, entre outras coisas. A lista de parâmetros é grande e cresce cada vez mais. As principais aplicações desta técnica são na área de hematologia, de cancerologia e de imunologia. Na área de hematologia é um procedimento muito realizado com a finalidade de diagnosticar e tratar diferentes complicações. É possível fazer uma análise das funções de células sadias de forma a evidenciar a natureza patológica. Na cancerologia é muito utilizado na detecção da célula patológica essencialmente através da medição de conteúdos anormais de DNA no seu núcleo. Já na imunologia a citometria de fluxo é usada principalmente para a identificação de subtipos de células que estariam levando às disfunções de imunidade.

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                    Princípio da Técnica:

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                    Princípio da Técnica:

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A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta que possibilita realizar a separação, a contagem individual de células e detecção de biomarcadores proteicos. A partir de um feixe de laser incidente, é feita a medição da dispersão e da fluorescência do feixe de laser refletido pela da amostra celular. A dinâmica funcional de um citômetro é composta por cinco sistemas: fluido, óptico, eletrônico, de amplificação e computacional. Um feixe de luz de um único comprimento de onda é direcionado a um meio líquido em fluxo. Um número de dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC). Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou juntos a partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada individual partícula. FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partícula (por exemplo: forma do núcleo, quantidade e tipo dos grânulos citoplasmáticos e rugosidade da membrana). A categoria do teste consiste em ligação primária.Esse teste permite a ligação do Antígeno (Ag) e Anticorpo (Ac), e então mede os imunocomplexo (reação Ag- Ac) formados. Para a medição dessas reações um dos reagentes deve ser marcado quimicamente por marcadores fluorescentes, radioisótopos, metais coloidais e enzimas.

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                         Interpretação do Resultado:

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                         Interpretação do Resultado:

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Um exemplo de como fazer o diagnostico:
Frente a um caso de metástase, deve, a partir da morfologia tumoral, solicitar painel imunohistoquímico, levando-se ainda em consideração o sexo, idade e dados clínicos do paciente. A interpretação da imuno-histoquímica deve levar em conta o padrão de marcação e o tipo celular marcado. Enfatiza-se que, em anatomia patológica, a reação da imuno-histoquímica é um método auxiliar importante para definir o tipo histológico tumoral, principalmente em neoplasias pouco diferenciadas, porém ela não pode ser avaliada isoladamente, devendo-se considerar a morfologia histopatológica e dados clínicos para o diagnóstico final. Determinação do local de origem de neoplasias muitas vezes é possível e necessário para o manejo clínico adequado dos pacientes. O primeiro passo na avaliação de um tumor metastático é a determinação da linhagem do tumor (por exemplo, células epiteliais, mesenquimais, melanocíticas). Marcadores para a determinação de linhagem devem ser incluídos em um painel; tanto colorações positivas como negativas são esperadas em diferentes linhagens em estudo. Os marcadores inicialmente avaliados utilizados rotineiramente com esse propósito são: AE1/AE3+ (pan-citoqueratina) que, caso positivo, indica neoplasia de origem epitelial; CD45 (LCA), que é um marcador leucocitário e, quando positivo, aponta para linfoma; e vimentina, que é um marcador de células de origem mesenquimal, indicando sarcoma quando positivo. Outros marcadores realizados rotineiramente são os marcadores melanocíticos HMB45 e S100, na suspeita de melanoma. Depois de uma metástase ter sido determinada como um carcinoma, por exemplo, um painel de tecidos ou órgãos marcadores específicos podem ser usados em uma tentativa de determinar ou sugerir a origem. Realiza-se então, painel conforme a linhagem do tumor: caso origem epitelial, painel para pesquisa do sítio primário com CK7 e CK20; caso origem leucocitária, painel para linfoma e caso origem mesenquimal, painel para sarcoma.

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Preservação por fixação ou congelamento em nitrogênio liquido. Fixadores: formaldeído 4 e 10%, paraformaldeído 4%, periodato-lisina-paraformaldeído (PLP), glutaraldeído, Carnoy etc. A desidatração é feita com álcool absoluto. O clareamento é feito  com o xilol. Inclusão em bloco de parafina, a temperatura não deve ultrapassar 60°C. Obter secções em micrótomo e re-hidratar com xilol e álcool em diferentes concentrações. A fixação utiliza formalina, que pode mascara alguns epítopos antígenos, fazer ligação cruzada ou destruí-los.Por esse motivo torna-se necessário realizar o desmascaramento, facilitando o acesso do anticorpo ao epítopo. A recuperação antigênica pode ser feita por diversas técnicas:
- Digestão enzimática proteotíca: tripsina, quimotripsina, pepsina, proteinase K.
- Pelo calor: micro-ondas, banho-maria, panela de pressão.
- Froma combinada: digestão enzimática + calor.

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Este método de diagnóstico é rotineiramente usado para diagnosticar células anormais, como por exemplo, as encontradas em neoplasias

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Imuno-histoquímica (IHQ) é o método de identificação de antígenos nos tecidos, utilizando o princípio da ligação específica de anticorpos e antígenos. Para a detecção IHQ de antígenos nos tecidos, existem duas estratégias: método indireto e método direto. O método direto é considerado um método de coloração de um passo (one-step), e engloba um anticorpo marcado conjugado que se encontra reagindo diretamente com o antígeno que está na amostra de tecido. Este é um procedimento simples e rápido, pois utiliza apenas um anticorpo. Contudo, pode passar por determinados problemas, como sensibilidade, em conseqüência da diminuta amplificação de sinal, sendo utilizado em menor proporção quando comparado com o método indireto. O método indireto abrange um anticorpo primário não-marcado que reage com o antígeno presente no tecido, e um anticorpo secundário marcado, capaz de reagir com o anticorpo primário. Esse método é mais sensível do que o anterior por apresentar a amplificação de sinal por meio de diferentes reações de anticorpos secundários com distintos sítios antigênicos de anticorpo primário. A camada de anticorpo secundário pode ser marcada com corante fluorescente ou uma enzima.O método indireto, além de apresentar alta sensibilidade, apresenta a vantagem de que apenas uma pequena quantidade de anticorpos secundários conjugados necessita ser produzido.

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Os resultados do teste por imunocromatografia de fluxo lateral podem ser visualizados na forma de ponto, linha ou banda colorida, dependendo do fabricante.

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Utilizam uma membrana de nitrocelulose subdividida em quatro áreas:

- Área de amostra (A), onde é aplicada a amostra e a solução tampão.

- Área intermediária (I), que contém o conjugado, geralmente composto de ouro coloidal ligado a anticorpos (imunoglobulinas).

- Área de teste (T), que contém os antígenos fixados à membrana de nitrocelulose, onde se lê o resultado da amostra testada.

-Área de controle (C), local de controle da reação e que permite a validação do teste.

Reagente: Quando houver formação de duas linhas coloridas: uma, na área de teste (T) e outra, na área de controle (C).

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om o objetivo de desenvolver produtos para o diagnóstico in vitro rápido baseado na tecnologia da imunocromatografia (Lateral Flow Test). A idéia é acelerar o processo de descoberta de doenças como: dengue, malária, rubéola e tuberculose, além da adaptação de produtos para o diagnóstico in vitro rápido de leishmaniose tegumentar e visceral e leptospirose.

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O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA). São testes rápidos- TR

-Testes de ligação primária: mensura diretamente a ligação do Ag x Ac

-Testes de ligação secundária: mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.

-Testes terciários: compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em um animal.

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O teste de ELISA é responsável pela detecção de diferentes doenças infecciosas, uma vez que a maioria dos agentes patológicos leva à produção de imunoglobulinas. Também pode ser utilizado no diagnóstico de doenças auto-imunes ou alérgicas.

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                           Execução da Técnica: 

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                           Execução da Técnica: 

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Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac).
-Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag).
-Controles (positivo, negativo, ponto de corte) nos ensaios qualitativos 5 padrões ( soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) nos ensaios quantitativos.
-Placa de poliestireno
-Tampão de lavagem, utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez  e outras moléculas interferentes.
-Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima.
-cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática produz cor.
-Leitura de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultante ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica-DO).

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A enzima mais comumente usada nesta prova á a peroxidase, responsável por catalisar a reação de desdobramento da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2.

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O teste de ELISA baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio de reações enzimáticas (teste imunoenzimático).

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Considera-se como título ideal do conjugado a maior diluição que apresentar: fluorescência uniforme em toda a membrana do parasita no soro controle positivo; ausência de fluorescência no controle negativo e no PBS.

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                         Execução da Técnica:

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                         Execução da Técnica:

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Utilizam-se anticorpos ou antígenos conjugados a moléculas reveladoras chamadas fluorocromos (os mais usados são a fluoresceína isocianetada (FITC) e rodamina); para visualização, utiliza-se microscópio de fluorescência.
Como exemplo, o T. cruzi: reagentes: o antígeno (fixado na lâmina, liofilizado ou em suspensão) , tampão fosfato PBS  ph 7,2, azul de Evans, conjugado anti-imunoglobulina humana (total ou IgG) conjugada ao FITC, glicerina tamponada ph (9 +- 0,5) e soros- controle (positivo e negativo); materiais: Relógio despertador (timer), lâminas demarcadas para IFI, microscópio de fluorescência, pipetas manuais de volume ajustável (5 µl a 50 µl, 50µl a 200 µl, 200 µl a 1.000 µl), ponteiras descartáveis para as pipetas manuais, balança semi-analítica e acessórios de pesagem, agitador tipo Kline (opcional), estufa com temperatura regulável a 37oC, câmara úmida.

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A IFI tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo pertence. Habitualmente, a imunofluorescência indireta é utilizada na detecção de doenças autoimunes, e também, na detecção de anticorpos anti-nucleares encontrados no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.

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A IFI é usada para identificar antígeno ou anticorpos. O teste é realizado em duas etapas. Na primeira etapa, anticorpos não-marcados são adicionados a células infectadas fixadas a uma lâmina de microscópio.
Após incubação, as lâminas são lavadas para remover anticorpos não-ligados. Na segunda etapa, um anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com fluoresceína é adicionado. O tipo de conjugado é determinado pela espécie do anticorpo usado na primeira etapa.

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A formação da linha de precipitação indica a presença de anticorpos específicos. Se na solução antigênica existirem diversos antígenos, irão se formar diversas linhas, uma para cada tipo de imunocomplexo.

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Em uma camada de agarose que recobre uma lâmina de vidro são feitos orifícios. Em um orifício é adicionado antígeno e em outro soro. A lâmina é incubada por 24/48 horas. Observa-se a linha de precipitação entre os orifícios.

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A técnica permite a comparação simultânea, por exemplo, de vários sistemas antigênicos contra o mesmo sistema de anticorpo de reatividade e especificidade conhecidas, desde que a interação antígeno-anticorpo tenha atingido a zona de equivalência e que esteja em quantidade suficiente para formar turvação ou precipitado visível. Esta técnica é muito utilizada na pesquisa e diagnóstico de determinadas doenças como cisticercose.

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O teste de imunodifusão radial simples permite determinar a concentração de uma amostra de antígeno. Durante a incubação ocorre a difusão do anticorpo e do antígeno na agarose, com a formação de complexos antígeno-anticorpo insolúveis, que precipitam e formam linhas entre os orifícios.

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Ac + Ag = Complexo precipitado. Testes feitos em diluições crescentes, com antígenos na mesma concentração, onde os resultados são expresso em título anti-soro - a máxima diluição onde ocorre a reação. Ex.: Tipagem sanguínea, Toxoplasmose, Salmoneloses, Tripanossomíase.

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Os testes de aglutinação direta geralmente são feitos em tubos, incubando amostras de soro em diluições seriadas diante da concentração constante de suspensão de células (antígeno).
Após o período de incubação de 30 a 90 minutos observa-se a formação de agregados visíveis. Também pode ser utilizado o recurso de corar as células bacterianas e realizar o teste em lâminas ou placas.
Também podem ser chamados de hemaglutinação direta os testes que utilizam hemácias como células antigênicas, como são a tipagem sanguínea de antígenos eritrocitários e a pesquisa de anticorpos heterófilos na mononucleose infecciosa.

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Na reação de aglutinação direta utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra ou fragmentada. Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser aglutinados diretamente por anticorpo.
Os testes para detectar anticorpos específicos são realizados empregando-se diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno.
Após um período de incubação, a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso como a máxima diluição em que ocorre a aglutinação.

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Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.
A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).
Os principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína - FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou sanduíche.  Aglutinação Direta para Leishmaniose Visceral;