# data[].attributes.body
식당주인밭에 있는 옥수수에 Cry1Ia12 단백질을 발현하는 Cry gene expression cassette가 홍천의 최박사 연구소의 옥수수 밭으로부터 도입되었다.

-> PCR을 통해 식당 옥수수에 cry 발현 유전자 존재 유무 확인

# data[].attributes.headline
Amy가 홍천 외각의 맛나 식당에서 저녁

# data[].attributes.body
Amy가 홍천 외각의 맛나 식당에서 저녁을 먹었다

# data[].attributes.body
식당주인밭에 있는 옥수수에 Cry1Ia12 단백질을 발현하는 Cry gene expression cassette가 홍천의 최박사 연구소의 옥수수 밭으로부터 도입되었다.

# data[].attributes.body
식당 옥수수에서 Cry1Ia12 단백질이 발현되었다

# data[].attributes.body
식당 옥수수에서 Cry1Ia12 단백질이 발현되었다.

-> Western Blot을 통해 식당 옥수수에 cry 단백질 존재 유무 확인

# data[].attributes.headline
Amy는 저녁을 먹은 직후 호흡곤란으로 

# data[].attributes.body
Amy는 저녁을 먹은 직후 호흡곤란으로 병원에 입원하였고 죽었다

# data[].attributes.body
Anaphylatic shock가 사인일 것이라는 소견서를 받았다

Amy가 옥수수/땅콩 떡에 대해 알러지 반응을 보였다

# data[].attributes.body
식당주인밭에 있는 옥수수에 Cry1Ia12 단백질을 발현하는 Cry gene expression cassette가 홍천의 최박사 연구소의 옥수수 밭으로부터 도입되었다.

-> PCR을 통해 유전자 발현 유무 확인

# data[].attributes.headline
홍천의 최박사가 연구소장으로 있는 옥수수

# data[].attributes.body
홍천의 최박사가 연구소장으로 있는 옥수수 연구소가 있다

genetically modified corn이 연구목적으로 재배되고 있다

# data[].attributes.headline
연구소가 옥수수를 형질 전환 할 때 ve

# data[].attributes.body
연구소가 옥수수를 형질 전환 할 때 vector(pCAMBIA 1300)의 multiple cloning site에 들어있던 Bacillus 유래의 cry gene expression cassette를 사용하고 있다

# data[].attributes.headline
식당 주인이 연구소 포장에 근접한 밭에서

# data[].attributes.body
식당 주인이 연구소 포장에 근접한 밭에서 옥수수를 직접 재배하고 있다

# data[].attributes.body
1. genomic DNA extraction

2. primer 제작 및 주문

3. PCR

4. DNA sequencing

# data[].attributes.body
DNA extraction kit를 사용해 각 sample의 DNA를 추출한다.

# data[].attributes.body
샘플 옥수수

핀셋

튜브

액체질소

막자사발

micropipette, tip

water bath, centrifuge

DNA extraction kit

# data[].attributes.body
cry expression gene sequence를 파악 -> 유전자 내 특정 서열로 primer 제작

# data[].attributes.body
IDT를 통해 주문

Forward : 11,600원

Reverse : 12,760원

# data[].attributes.body
-> Conventional PCR을 이용해 target DNA를 증폭

: cry expression gene이 식당 밭에 있는 옥수수에 들어있는지 확인하기 위함

# data[].attributes.headline
Cry1Ia12 단백질의 알러지 반응 가능성 존재

# data[].attributes.subject
Cry1Ia12 단백질의 알러지 반응 가능성 존재

# data[].attributes.body
Anaphylaxis

Cry1Ac 단백질이 mice에게 소량씩 투여될 경우 Anaphylaxis를 일으킨다.

# data[].attributes.body
Foward ,Reverse primer

DNA template

Taq PCR PreMix

D.WTaq

Micropipette, tip

PCR기기

# data[].attributes.body
1. sample protein extraction

2. 단백질 정량

- Bradford assay

3. Western blot

# data[].attributes.body
Dyne Taq (Standard PCR)

58,000원

# data[].attributes.body
식당 옥수수에서 Cry1Ia12 단백질이 발현되었다.

-> Western Blot을 통해 식당 옥수수에 cry 단백질 존재 유무 확인

# data[].attributes.body
-> 838bp

# data[].attributes.body
1. Denaturation (94℃ 1분)

: DNA를 두 가닥으로 나누어줌

2. Annealing (55℃ 1분)

: primer가 DNA의 특정 부위에 붙음

3. Extension (72℃ 50초)

: 새로운 DNA 가닥을 합성

-> 30 cycle 진행

# data[].attributes.body
1. Pre-denaturation (94℃ 5분) - 1 cycle

2. Denaturation (94℃ 1분) - 30 cycle

3. Annealing (55℃ 1분) - 30 cycle

4. Extension (72℃ 50초) - 30 cycle

5. Final extension (72℃ 4분) - 1 cycle

# data[].attributes.body
PCR로 증폭시킨 DNA가 cry expression gene인지 확인

# data[].attributes.body
각각의 옥수수 sample에서 실험에 사용할 단백질을 추출한다.

# data[].attributes.body
각 옥수수 sample

핀셋

액체질소

막자사발

tube

pipette

RIPA lysis buffer

# data[].attributes.body
선택한 추출법 : 계통추출법

-> 확률 표본 추출 방법 중에 표본 오차를 줄이고 무작위성을 높이기 좋은 방법이기 때문

# data[].attributes.body
상황 설명

알고있는 사실

가설 설정

가설 검증 실험

- PCR

- Western Blot

결론

참고문헌

# data[].attributes.body
Mr.Craig(34세)는 딸 Amy(3세 여아)와 함께 강원도 홍천 외각의 '맛나 식당'에서 저녁을 먹었고 딸 Amy는 저녁을 먹은 직후 과민성 알러지 반응을 일으키며 사망하였다.

-> Mr.Craig는 맛나식당에서 재배 중인 옥수수 밭 인근에 형질전환 옥수수를 재배중인 연구소가 있다는 사실을 알게 되었고, 이 형질전환 옥수수로부터 온 꽃가루가 맛나식당 밭의 옥수수에 수정되어 cry 단백질이 발현되었다고 주장

# data[].attributes.body
1. 각각의 옥수수 sample을 준비한다.

2. 각 sample을 액체질소에 넣었다 뺀 후 막자사발에 갈아 가루로 만든다.

(protein은 상온에 오래 노출되면 좋지 X)

3. 파쇄한 가루를 20ml 1X Protein extraction buffer(RIPA buffer)에 넣는다.

4. 10000Xg에서 10분간 centrifuge(4℃) 후 pipette으로 상등액만 취한다.

5. 상등액을 차가운 tube에 옮긴 후 protease inhibitor cocktail을 첨가해 -70℃에서 보관한다.

- 단백질은 가능한 저온에서 처리하고 보관한다. (효소활성 억제)

- 가능한 빠른 시간 내에 처리한다.

- 장기보존의 경우 동결보존한다.

- protease inhibitor를 꼭 첨가한다.

- 적당한 pH에서 보존한다.

# data[].attributes.body
단백질 정량

-> 농도를 이미 알고 있는 단백질을 표준 물질로 하여 standard curve를 그려 각 sample 단백질 양을 계산할 수 있다.

# data[].attributes.body
Western blot 전 단백질을 정량하는 이유

단백질을 정량하면 각 sample에 동일한 양의 단백질을 loading할 수 있어 실험 결과의 재현성과 신뢰도를 높일 수 있다.

정량화된 단백질을 사용함으로써 샘플 간 발현 차이를 비교할 수 있으며, 발현량 차이에 따른 신호 강도의 차이가 실제 단백질 발현 차이임을 확인할 수 있다.

western blot을 하기 위해서는 일정 농도 이상의 단백질이 필요하기 때문에 western blot 전 sample 단백질의 농도를 계산할 필요가 있다.

# data[].attributes.body
Coomassie Blue G-250의 dye를 이용해 흡광도 차이를 확인해서 단백질의 농도를 측정하는 방법이다.

염색약과 단백질이 결합하여 복합체를 이루게 되면서 용액이 푸른색으로 변하고, 그 흡광도를 측정한다. 이때 standard 물질인 BSA를 기준으로 하여 sample에 단백질이 얼만큼 들어있는지를 측정하고 농도를 계산할 수 있다.

# data[].attributes.body
-> Lowry 방법보다 빠르고 정확하며 BCA 방법보다 간단하다는 장점이 있다. 또 SDS나 Triton X-100과 같은 detergent와 호환이 가능하여 보편적으로 많이 이용된다.

# data[].attributes.body
Coomassie Brilliant Blue  G-250 dye

Phosphoric Acid 85% EP

Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)

Ethyl Alchol 95% EP

BSA

# data[].attributes.body
-> 단백질 사이의 특이적인 상호작용을 이용하여 특정 단백질을 검출하는 방법

: 표적 단백질 (cry 단백질)을 검출 -> 식당 옥수수에 cry 단백질이 존재하는지 확인하기 위함

# data[].attributes.body
1. SDS-PAGE

2. Transfer

3. Blocking

4. 항원-항체 반응

5. Detection

# data[].attributes.body
전기영동을 통해 단백질을 크기별로 분리한다.

# data[].attributes.body
5% stacking gel

8% separating gel

: cry 단백질은 648 aa -> 1 aa는 대략 110 Da이므로 cry단백질은 대략 71.3kDa이기 때문에 8% gel이 적당함

# data[].attributes.body
전기영동으로 분리된 단백질에 항체가 붙을 수 있도록 분리한 단백질을 membrane으로 이동시켜 준다.

# data[].attributes.body
NC membrane

SDS PAGE가 끝난 gel

Transfer buffer

- 25 mM Tris

- 192 mM Glycine pH8.3

- 20% Methanol

Ponceau S 염색액

filter paper

transfer cassette

pipette

roller

# data[].attributes.body
membrane의 종류에는 NC, PVDF, Nylon이 있다. 이 중 가격이 저렴하고 과정이 번거롭지 않은 NC membrane을 사용하기로 했다.

NC membrand은 표면적이 넓어 한 번에 많은 antibody가 흡착할 수 있고, 가격이 경제적이다. 또 methanol로 전처리하는 과정이 필요없다.

# data[].attributes.body
wet vs semi-dry vs dry

세 가지 방법 중 wet 방법 사용

-> wet 방식은 transfer 과정 중에 온도 조절이 가능하고 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다.

semi-dry 방식은 빠른 시간 안에 할 수 있어 효율은 좋지만 background가 많이 발생할 수 있고, 일부 단백질은 잘 transfer되지 않는다.

# data[].attributes.body
단백질이 transfer 되지 않은 부분이 오염되거나 다른 단백질이 antibody에 붙을 수 없도록 skimmed milk 또는 BSA 로 blocking 해주는 과정

-> 단백질이 안 붙어있는 membrane부분에 blocking buffer 속 단백질이 달라붙는 것

= nonspecific한 항체의 binding을 차단하기 위한 코팅 과정

# data[].attributes.body
skim milk

TBST buffer

10mM Tris-HCl pH 7.4

100mM NaCl, (단백질 안정화)

0.1%(V/V) Tween 20(단백질 간 nonspecific interaction 막음)

# data[].attributes.body
1. 5% skim milk에 transfer가 완료된 membrane을 넣고 상온에서 1시간 정도 shaking하며 incubation한다.

2. Membrane을 TBST buffer에 5분간 washing하는 과정을 3회 반복한다.

# data[].attributes.body
-> 국내에서 sequencing에 경쟁력이 있는 회사이며, 가격도 6500원으로 합리적이기 때문

# data[].attributes.body
표적 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 가진 항체인 1차 항체와 반응시켜, 1차 항체가 표적 단백질에 결합하게 한다.

이후, 표적 단백질에 결합하지 않은 여분의 1차 항체를 씻어 낸 다음, 1차 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체를 1차 항체에 결합시킨다.

# data[].attributes.body
Primary antibody

Secondary antibody

Antibody Dilution Buffer

TBST buffer

Developing solution

# data[].attributes.body
-> 정확한 binding이 필요하므로 monoclonal 사용

국내 업체 중 'BIONEER'에서 monoclonal 항체를 제작해주기 때문에 주문 제작할 예정

# data[].attributes.body
Cry1Ia antibody

가격 : 233,000원

Target : Cry1Ia

Host : Rabbit

Isotype : IgG

Form : Liquid

용도 : ELISA, Western Blot

Size : 50ul

# data[].attributes.body
가격 : 314,000원

Target species : Rabbit

Host : Goat

Target isotype : IgG

Conjugation : HRP

용도 : IM, ELISA, ICC, IHC-Fr, IHC-P, WB

# data[].attributes.body
1차 혹은 2차 항체에 결합된 물질 or 효소에 따라 적절한 방법을 이용하여 항체를 검출

-> 항체에 결합된 표적 단백질을 검출

# data[].attributes.body
HRP가 ECL의 luminol을 산화시켜 방출되는 빛을 detect한다.

# data[].attributes.body
ECL 시약

pipette

투명시트 보호필름

가위

테이프

카세트

# data[].attributes.body
항체와의 반응이 일어났다면

-> Cry 단백질이 발현되었다

항체와의 반응이 일어나지 않는다면

-> Cry 단백질이 발현되지 않았다.

# data[].attributes.body
sequencing 결과 Cry gene이 존재한다면

-> 가설 2 진행

sequencing 결과 Cry gene이 존재하지 않는다면

-> 식당 옥수수에는 cry 단백질 발현 유전자가 존재하지 않으므로 cry 단백질도 존재하지 않고, 따라서 Amy의 죽음과는 무관할 수도 있다.

# data[].attributes.body
https://mj-lahong.tistory.com/151 표본추출법 종류 설명

https://www.kci.go.kr/kciportal/ci/sereArticleSearch/ciSereArtiView.kci?sereArticleSearchBean.artiId=ART002629074

https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%A4%91%ED%95%A9%ED%9A%A8%EC%86%8C_%EC%97%B0%EC%87%84_%EB%B0%98%EC%9D%91

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4759279/#B54

Synthetic construct Cry1Ia12 delta endotoxin gene, partial cds - Nucleotide - NCBI

PrimerQuest - design qPCR assays | IDT

https://www.bioneer.co.kr/

All about Conventional PC.. : 네이버블로그

DNA 정제_1 (DNA extraction) : 네이버 블로그

https://genome.cshlp.org/content/23/2/300.full

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/mb/c2mb25100k#fig3

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S089339522204306X?via%3Dihub

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278691510006666?via%3Dihub

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567576918302467?via%3Dihub

https://idisk.kribb.re.kr:5991/api.link/3d_baLMMHrreR-QD_A~~.pdf

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2939432/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4759279/#B54

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https://www.abcam.com/products/secondary-antibodies/goat-rabbit-igg-hl-hrp-ab6721.html

https://www.arp1.com/cry1ia-antibody-csb-pa673817za01bdc.html

https://m.blog.naver.com/summerh_/221122051482

KWCh1iqAqgEAAYASAAEgKDEvD_BwE

https://www.origene.com/support/learning-resources/protocols/antibodyprotocol?gad_source=1&gclid=EAIaIQobChMIsqWIgtCTggMVT

# data[].attributes.body
실험군

: 식당 옥수수 밭의 옥수수

대조군

positive control (형질전환 O)

: 연구소의 형질전환 옥수수

negative control (형질전환 X)

: 시중에서 판매하는 식당 옥수수와 같은 품종의 일반 옥수수

-> 각 25개

총 75개 sample

# data[].attributes.body
가설1과 가설2가 모두 참인 것으로 실험 결과가 나타난다면 Mr.Craig의 주장 중 Cry 단백질이 식당 옥수수에 발현되었을 것이라는 내용이 사실로 증명된다.

-> 이 결과는 Amy의 사망 원인을 밝혀내기 위한 중요한 단서가 될 수 있다.