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Détection des protéines après l'avoir purifiée

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Détection des protéines après l'avoir purifiée

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La matrice doit:
- etre chimiquement inerte
- avoir une grande porosité
- pérsenter de nombreus groupements fonctionnels

L'agarose est le plus souvent utilisé

Liaisons:
- Réaction d'agarose avec du bromure de cyanogène
- Produit donnée par covalence

Bras espaceur souple utilisé lorsque la matrice et le ligand ne peuvent pas se liés ensemble (ex: époxy)

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- Ca2+
-Biotin
-Amylose
-His-Tag

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Quantité de ligand retenue dépend de:
- du Kd
- Concentration de protéines dans l'extrait
- Degré de liaison du ligand à la matrice

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Un ligand qui se lie à la protéine est fixé de manière covalente à une matrice poreuse inerte

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Un ligand qui se lie à la protéine est fixé de manière covalente à une matrice poreuse inerte

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Liée au ligand = protéine immobilisée

Modifications:
1. Ajout un excès de ligand libre

2. Changer le pH ou la Température

*Permet de purifier la protéine en une seule étape

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Filtre avec un cut-off permettant le passage de toutes les protéines plus petites que X

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Permet de séparer les protéines selon leur taille grâce à l'utilisation de membranes semi-perméables

- petites molécules peuvent diffuser à travers la membrane
- membranes utilisées à base de Cellophane

*SALTING OUT

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Ce ne sont pas toutes les protéines qui peuvent passer dans les pores. Les protéines qui ne passent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidemment.

Porosité dépend de:
- masse moléculaire du polymère
- nombre de liaisons croisées

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1. Liaison à la colonne: les protéines se lient aux échangeurs par des forces électrostatiques

2. Lavage: utilisation d'une solution tampon qui vient laver la colonne.

*Plus l'affinité d'une protéine est forte, plus la migration sera retardée

3. Élution: utilisation d'un gradient linéaire (KCl ou NACl)

*Le sel déplace directement la protéine; le sions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine

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- Sulfonates (fort)
- CM (faible)

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- QAE (fort)
- DEAE (faible)

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- Les protéines portent à la fois des charges + et -

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L'affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d'ions dépend de

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L'affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d'ions dépend de

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1) pH de la solution: charge nette des protéines varie selon le pH
2) Nature & Concentrations des autres ions en solution: compétition pour les sites de liaisons de l'échangeur d'ions

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Utilisation de matrices à base de polymères à base de polysaccharides avec pores (ex: Dextrane, Agarose, Polyacrylamide)

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Utilisation de matrices à base de polymères à base de polysaccharides avec pores (ex: Dextrane, Agarose, Polyacrylamide)

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Séparer les protéines de tailles différentes

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Séparer les protéines de tailles différentes

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- Grandes tailles: Déplacent vers le fond
- Petites tailles: Entrent dans les billes et se déplacent plus lentement

*molécules séparées selon leur taille et leur forme

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Chromatographie d'affinité

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Chromatographie par échange d'ions

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Chromatographie par gel-filtration (tamis-moléculaire)

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Méthode utilisée pour séparer des mélanges complexe