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Motilidade - AMOSTRA 1 DE URINA

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🟤Tubo desaminação da fenilalanina: -
🟤Tubo vermelho de metila (VM): +
🟤Tubo Voges-Proskauer (VP):  -
(os princípios dessas provas foram descritos anteriormente)

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RESULTADO E IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA 3 - FEZES 

# data[].attributes.subject
RESULTADO E IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA 3 - FEZES 

# data[].attributes.body
🟤AMOSTRA 3 DE FEZES (Kit da Laborclin, cujos princípios foram descritos anteriormente):
Lactose -
Oxidase -
Desaminação do triptofano -
Produção de gás +
Produção de H2S +
Descarboxilacao de lisina +
Descarboxilacao de ornitina +
Motilidade +
Indol -
Fermentação da rhamnose +
Citrato +
Desaminação de fenilalanina -
Vermelho de metila +
Voges-Proskauer -
IDENTIFICAÇÃO
Diante desses resultados, conclui-se que a AMOSTRA 3 DE FEZES é positiva para Salmonella spp.

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🔴 AMOSTRA 2 DE URINA
Lactose -
Oxidase -
Desaminação do triptofano +
Produção de gás -
Produção de H2S +
Hidrólise da uréia +
Descarboxilação da lisina -
Motilidade +
Indol -
Citrato +
Desaminação da fenilalanina +
Vermelho de metila +
Voges-Proskauer -
IDENTIFICAÇÃO
Diante desses resultados, conclui-se que a AMOSTRA 2 DE URINA é positiva para Proteus mirabilis.

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🔴AMOSTRA 1 DE URINA:
Lactose +
Oxidase -
Desaminação do triptofano -
Fermentação da glicose +
Produção de gás +
Produção de H2S -
Hidrolise da ureia -
Descarboxilacao de lisina +
Descarboxilacao de ornitina +
Motilidade +
Indol +
Rhamnose +
Citrato -
Desaminação de fenilalanina -
Vermelho de metila +
Voges-Proskauer -
IDENTIFICAÇÃO
Diante desses resultados, conclui-se que a AMOSTRA 1 DE URINA é positiva para Escherichia coli.

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🟡Tubo desaminação da fenilalanina: A desaminação de fenilalanina forma ácido fenilpirúvico. Entre os membros da família Enterobacteriaceae, apenas as espécies de Proteus, Morganella e Providencia possuem a fenilalanina desaminase. O aparecimento de uma coloração verde escura após adição de uma solução de cloreto férrico a 10% indica resultado positivo.
+ = cor verde garrafa no ápice
- = sem essa coloração
🟡Tubo vermelho de metila:  Detecta a presença de grandes concentrações de produtos finais ácidos a partir da fermentação da glicose.
+ = tubo inteiro fica vermelho
- = não muda a coloração
🟡Tubo Voges-Proskauer:  Determina a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol. A adição do reagente de Barritt’s (solução 40% KOH e solução de anaftol em etanol absoluto) permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol.
+ = anel vermelho no ápice
- = sem anel vermelho no ápice

# data[].attributes.body
As enterobactérias são caracteristicamente bacilos gram negativos, não esporulados, com motilidade variada, oxidase negativo e capazes de crescer em meio rico e também seletivo.
As provas de identificação das enterobactérias foram realizados  realizadas em 5 tubos com meios diferentes, contendo componentes, que apresentam mudanças em sua coloração devido a mudança de pH ou produção de gazes. E associadas à provas complementares.

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Em ágar MacConkey, as colônias se apresentaram majoritariamente puntiformes; circular (h); convexas (c); com bordas lizas (c); sua superfície aparenta uma consistência mucoide, brilhosa e opaca.
Em ágar Salmonella-shigella,

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Segue os mesmos princípios observados nos tubos da Laborclin, sendo observados os seguintes resultados:
🔵Testes do tubo nº 1: EPM
a) produção de gás:
+ = bolhas ou rachaduras
- = sem bolhas ou rachaduras
b) produção de H2S:
+ = enegrecimento do meio
- = sem enegrecimento
c) hidrólise da uréia:
+ = aparecimento de coloração azul ou verde azulada na base
- = não aparece essa coloração
d) desaminação do triptofano:
+ = surge a cor verde garrafa na superfície do meio
- = não surge essa cor
🔵Testes do tubo nº 2: MILi
a) motilidade:
+ = turvação do meio
- = sem turvação do meio
b) descarboxilação da lisina:
+ = semmpre que o meio não estiver amarelo ou estiver púrpura
- = sem mudança na coloração
c) produção de indol:
+ = surge anel rosa ou vermelho após a adição do reagente de Kovacs
- = não surge esse anel rosa ou vermelho
🔵Testes do tubo nº 3: citrato de Simmons
+ = cor azul na superfície
- = sem alteração na cor da superfície

# data[].attributes.body
⚫Testes do tubo nº 2: LMI
a) descarboxilação da lisina: A lisina descarboxilase promove a remoção do CO2 da lisina, produzindo uma amina (cadaverina) e alcalinizando o meio, que adquire a cor púrpura em toda a sua extensão.
+ = cor passa do amarelo para o púrpura
- = meio fica amarelo
b) motilidade
+ = turvidez total o parcial do meio
- = sem turvidez
⚫Testes do tubo nº 3: MIO
a) descarboxilação da ornitina: A ornitina descarboxilase promove a remoção do CO2 da ornitina, produzindo uma amina (putrescina) e alcalinizando o meio, que adquire a cor púrpura em toda a sua extensão.
+ = cor passa do amarelo para o púrpura
- = meio fica amarelo
b) motilidade
+ = turvidez total o parcial do meio
- = sem turvidez
c) indol: A enzima triptofanase age sobre o triptofano, resultando na liberação do indol. Esta reação é evidenciada pela adição do reativo de kovacs, produzindo uma coloração rosa- avermelhada.
+ = surgimento de um anel vermelho
- = não surge essa coloração
⚫Testes do tubo nº 4: meio de ramnose
a) ramnose: A fermentação do caldo ramnose é revelada por uma mudança de cor do roxo para o amarelo (acidificação).
+ = mudança de roxo para amarelo, com turvação
- = permanece roxo, com turvação
⚫Testes do tubo nº 5: citrato
citrato: As bactérias que produzem enzima citratase conseguem utilizar o citrato como única fonte de carbono e utilizam o nitrogênio do sal de amônio produzindo amônia, alcalinizando o meio. O indicar utilizado é azul do bromotimol, que em pH ácido é amarelo/verde e em pH alcalino é azul.
+ = meio azul e com crescimento
- = meio com coloração inalterada e sem sinais de crescimento

# data[].attributes.body
⚫Testes do tubo nº 1: RUGAI
a) desaminação do L-triptofano: na presença da enzima L-triptofano desaminase (LTD), ocorre a desaminação oxidativa do aminoácido L-triptofano, convertendo-o em ácido indol pirúvico, o qual reage com sais de ferro originando um composto cíclico de cor verde escura.
+ = ápice do tubo verde garrafa
- = ápice do tubo permanece verde azulado
b) fermentação da glicose:  Todas as enterobacterias fermentam a glicose para formar o ácido pirúvico.
+ = cor amarela no fundo do tubo
- = fundo do tubo permanece verde azulado (não é enterobacteria)
c) Produção de gás a partir de glicose: caso ocorra fermentação de glicose pode ser produzido CO2.
+ = bolhas ou rachaduras
- = meio se mantém íntegro
d) produção de gás sulfídrico (H2S): A enzima tiossulfato-redutase age sobre o tiossulfato de sódio, produzindo H2S, o qual é evidenciado através da reação com o citrato férrico amoniacal, que originará um sulfeto de ferro insolúvel de cor negra.
+ = cor negra no fundo do tubo
- = fundo sem coloração negra
Obs.: o resultado positivo pode mascarar o resultado de outras reações devido a coloração escura.
e) hidrólise da uréia: A urease desdobra a uréia em CO2 e NH3, o qual se dissolve sob a forma de carbonato de amônia, alcalinizando o meio. Neste caso, a base do meio fica azul.
+ = azul na base do tubo
- = sem cor azul na base do tubo

# data[].attributes.body
As amostras de coprocultura são constituidas fezes com o intuito de identificar microrganismos de maior importância clinica, causadores de patologias gastrointestinais.
Distúrbios gastrointestinais, são patologias que afetam os órgão do sistema digestivo, sendo muitasvezes, causas por bactérias comensais, via desequilíbrios endógenos ou exógenos ou por microrganismos patológicos, na maioria das vezes advindo da ingestão de alimentos contaminados.
Na cultura das fezes são geralmente encontrados, comumente: Salmonella spp, Escherichia coli e Campylobacter spp. Todavia, mediante solicitação médica, também podem ser pesquisados a Yersinia spp, Vibrio spp, Clostridioides difficile.

# data[].attributes.body
Nesse meios as colônias das bactérias cresceram apresentando coloração negra que evidencia a produção de sulfeto de hidrogênio (V).

AMOSTRA 3: Houve crescimento das colônias, e produção de gás H₂S.
H₂S +

# data[].attributes.body
Nesse meios as colônias das bactérias gram negativas fermentadoras mudam a  coloração rosa enquanto as não fermentadoras são não alteram a cor.

AMOSTRA 3: Houve crescimento das colônias, porem não houve fermentação de lactose.
Lactose -

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5.2 Prova da oxidase
É importante para diferenciar  Pseudomonadaceae (Oxidase positiva) e Enterobacteriaceae (Oxidase negativa). O teste da oxidase é baseado na produção de uma enzima chamada citocromo-oxidase. Esta enzima oxida um corante (presente no tira) que resulta em uma mudança de cor amarela para roxo escuro (observe na imagem o controle positivo).
RESULTADOS:
AMOSTRAS 1 E 2 DE URINA: OXIDASE NEGATIVO

# data[].attributes.body
5.3 Identificação bioquímica
Para as provas biquímicas foram utilizados para a AMOSTRA 1 DE URINA o kit da Laborclin e para a AMOSTRA 2 DE URINA o kit da Probac.
Além disso, ambas as amostras passaram pelas seguintes provas separadamente: vermelho de metila (complementar), Voges-Proskauer (complementar) e desaminação de fenilalanina.

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URINA AMOSTRA 2 - CLED

# data[].attributes.body
URINA AMOSTRA 1 - CLED

# data[].attributes.body
A semeadura foi realizada por meio da técnica de esgotamento os meios, MacConkey que, possui em sua composição cristal violeta e sais biliares que inibem o
crescimento de bactérias gram positivas, o que favorece o isolamento os bacilos gram
negativos, sendo também capaz de diferenciar os microrganismos fermentadores dos não fermentadores de lactose; e o meio Salmonella-Shigella  é um meio diferencial seletivo utilizado no isolamento de enterobactérias, favorecendo  especialmente o crescimento  de Salmonella spp e Shigella spp.

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As amostras de fezes devem ser coletadas no inicio dos episódios diarreicos, isto é, em até 7 dias, pois, a positividade diminui com o tempo.
Deve ser coletada um volume de 1 a 2g, em um recipiente limpo, seco e estéreo sempre que possível, ou com um swab imerso em meio de transporte líquido com conservante em caso especiais como os recém nascidos.

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Corpocultura é o nome dada a pesquisa bacteriológica nas fezes, neste cenário, a humana. Ele é empregado com o objetivo de identificar a espécie do microrganismo capaz de provocar alterações gastrointestinais.

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5 PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO

5.1 Meios de cultura
Os meios utilizados permitem identificar bactérias fermentadoras ou não de lactose, o ágar CLED muda de cor de verde para amarelo quando há fermentação e redução do pH do meio, e no ágar MacConkey as colônias das bacterias gram negativas fermentadoras tem coloracao rosa enquanto as não fermentadoras são incolores.
RESULTADOS:
Ambas cresceram no ágar MacConkey, logo, são gram negativas
URINA AMOSTRA 1: lactose +
URINA AMOSTRA 2: lactose -

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4 CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
URINA AMOSTRA 1:
As colônias são lisas, convexas e possuem bordas regulares, cor de rosa em ágar MacConkey e amarelas em ágar CLED.
URINA AMOSTRA 2:
As colônias são lisas, convexas e translúcidas no ágar MacConkey e no ágar CLED.

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3 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS
Foi realizada a semeadura quantitativa em placa de ágar CLED e semeadura em placa de ágar MacConkey.
Quando se trata de urina de gestante, deve ser utilizada também uma placa de ágar sangue, para identificação de Streptococcus agalactiae (beta hemolítico e mais comum em gestantes).
O ágar CLED é um meio nutritivo, não seletivo e mais utilizado para a cultura de urina. E o meio MacConkey é seletivo, diferencial, utilizado para isolamento e diferenciação de enterobactérias, gram-negativas e fermentadoras de lactose.

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2 CUIDADOS COM A COLETA
Para coleta é necessário orientar o paciente para limpeza dos genitais com água e sabão neutro, seguida de secagem com gaze estéril. A coleta deve ser realizada pela manhã, preferencialmente coletando o jato médio da primeira micção, ou após 2 a 3h de retenção na bexiga. Para mulheres também se recomenda afastar os grandes lábios vaginais no momento da coleta.
A coleta é realizada em frasco estéril que deve ser preenchido em cerca de 60 a 70% do seu volume. Caso respingue na face externa do frasco, deve-se lavar com água e sabão e enxugar.

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1 O TIPO DE AMOSTRA E INFECÇÃO
Para a urocultura a amostra coletada é a urina.
A infecção do trato urinário (ITU) pode acometar desde a uretra até os rins, obviamente a gravidade é maior quando bactérias colonizam o trato urinário superior, que é estéril. Ao acometer os rins, a infecção pode ocasionar sepse e complicações graves ao paciente. As ITUs são mais comuns em mulheres, o que é associado à localização da uretra muito próxima ao ânus, favorecendo anatomicamente a colonização por bactérias do trato gastrointestinal. As bactérias mais comumente associadas à ITUs comunitárias são:  Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus, espécies de Proteus e de Klebsiella e o Enterococcus faecalis. Quando de origem hospitalar, destacam-se: enterobactérias, com redução na frequência de E. coli, e um crescimento de Proteus sp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp, Enterobacter sp, Enterococcus faecalis e de fungos, com destaque para Cândida.

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UROCULTURA
Foi realizada a semeadura quantitativa de duas amostras de urina em ágar CLED e ágar MacConkey.

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REFERÊNCIAS
ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, v. 1, n. 1, p. 381, 2004.

ANVISA.  Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos. 2004.

LABORCLIN. Kit enterobacterias. Disponível em: <https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/kit_enterobacterias_bula_25012019.pdf> Acesso em 20/11/2021.

LABORCLIN. Tira de oxidase. Disponível em: <https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/05/tira_de_oxidase_570661.pdf> Acesso em 20/11/2021.

PROBAC. Enterokit B. Disponível em: <http://www.probac.com.br/Anexos/Bulas/Identifica%C3%A7%C3%A3o/Enterokit%20B%20rev.03.pdf> Acesso em 20/11/2021.

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6 SEMIQUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO
Através do emprego da técnica de semeadura por esgotamento é possível semiquantificar o microorganismo isolado. Para as duas amostras foi observado o crescimento de colônias nas áreas 1, 2 e 3 do meio de cultura, indicando crescimento intenso ou abundante, reportado como numerosas colônias: 3+.

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5.3 Coloração de Gram
A técnica de Gram tem como objetivo principal diferenciar as bactérias de acordo com as características da parede celular. Assim, de acordo com as características observadas no microscópio, as bactérias podem ser classificadas em:

Bactérias Gram-positivas, que são visualizadas com a coloração azul devido ao fato de não serem descoradas pelo álcool, pois possuem parede celular mais espessa, rica em pepetideoglicano e os seus poros contraem-se quando expostos ao lugol;

Bactérias Gram-negativas, que são visualizadas com a coloração rosa/roxo devido ao fato de serem descoradas pelo álcool, pois apresentam uma ou poucas camadas de peptideoglicano, e são coradas pela fucsina.

RESULTADOS: Foi preparada uma lâmina para cada amostra. E foi observado no microscópio a morfologia e coloração das bactérias, identificadas como cocos gram positivos, para ambas as amostras .

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5 PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
5.1 Meios de cultura diferenciais
Antes da realização das demais provas de identificação, o cultivo das bactérias em dois meios diferentes já fornece um parâmetro acerca de suas características. Os meios utilizados foram o ágar sangue e o ágar MacConkey. O ágar sangue é um meio não seletivo e diferencial para hemólise.
RESULTADOS: no ágar sangue as bactérias de ambas as amostras cresceram e formaram halos de hemólise. O MacConkey é seletivo para bactérias gram-negativas e não houve formação de colônias de nenhuma das duas amostras semeadas. Indicando que as bactérias são hemolíticas e gram-positivas (Amostras 1 e 2)

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4 CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
Placa 1:
As colônias eram predominantemente puntiformes, com elevação convexa, bordas  lisas e formato arredondado.
Também apresentavam superfícies lisas, mucoide e  de aparência opaca. Devido ao uso da mascara não foi possível observar odor nas colônias.

Placa 2:
As colônias eram predominantemente puntiformes, mas também haviam colônias médias e grandes, todas com elevação convexa, bordas  lisas e formato arredondado.
As superfícies se configuravam lisas, com textura mucoide e  de aparência opaca. Devido ao uso da mascara também não foi possível observar odor nas colônias.

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3 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS
Ágar manitol é um meio cuja finalidade é observar a capacidade do microrganismo crescer e fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio. Esta composição inibe parcial ou completamente o crescimento de outras bactérias.
Os resultados do teste são expressos através de uma reação colorimétrica, isto é, quando ocorre formação  de halo amarelo ao redor das colônias, indica Staphylococcus aureus.
Quando a cor do meio permanece inalterada, o resultado aponta para outras espécies Staphylococcus coagulase negativa.

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2 CUIDADOS COM A COLETA
Para a coleta de amostras de feridas da pele, o ideal é que ocorra antes do início do tratamento com antibióticos. A coleta pode ser realizada com swab, apenas quando não for possível a biópsia  ou o aspirado com agulha e seringa. O material deve ser coletado preferencialmente das margens da lesão e na parte mais profunda, evitando a parte purulenta que é rica em resíduos celulares. Em feridas abertas, pode ser necessário o desbridamento antes da coleta.
Após a coleta o swab é colocado imediatamente em meio de transporte e levado ao laboratório para semeadura e análise.

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Teste complementar da Fermentação em Manitol

# data[].attributes.subject
Teste complementar da Fermentação em Manitol

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O manitol possui em sua constituição 7,5% de NaCl, que inibe o crescimento parcial ou completo de outras bactéria, mas o S. aureus é resistente e consegue não só crescer como também fermentar o meio deixando amarelado.
Quando não ocorre mudança de cor, pode indicar S. epidermidis.

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Quando o teste da coagulase for negativo segue-se para o teste de sensibilidade a novobiocina. Nesse teste é realizado a semeadura no ágar e nele é colocado um disco banhado em novobiocina.
Quando não há formação de halo em volta do disco, ou esse halo é de 6 a 12 mm, o microrganismo é resistente, apontando para Staphilococcus saprophiticus.
Quando há formação de halo de 16 a 27 mm, o teste é sensível, que pode indicar Staphilococcus coagulase negativa.
AMOSTRA 2: Houve formação de um halo de 16 mm  no meio ágar sangue e de aproximadamente 32 mm no meio Mueller Hinton, conforme mostrado na imagem, sugerindo Staphilococcus coagulase negativa.

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Em caso de catalase +, partimos para o segundo teste, o teste da Coagulase. Na superfície da parede bacteriana é produzida a coagulase, uma enzima que em contando com o fatores de agregação do plasma de coelho, reage formando um complexo, que reage com fibrinogênio e fibrina formando coagulo.
Quando o teste é (+) -> A espécie mais provável é o S. aureus;
Quando o teste é (-) -> Está relacionado as demais espécies  relacionadas.
RESULTADO:
AMOSTRA 1: Positivo, pois, houve a formação do coagulo como mostrado na figura, indicando S. aureus.
AMOSTRA 2:  Negativo, pois, não houve formação do coagulo.

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o primeiro teste a ser feito é o teste da catalase, que é feito a partir de um esfregaço das bactérias coletadas na placa de cultura direto em uma lamina, então é adicionada peróxido de hidrogênio, que na presença da catalase, produzida pelas bactérias, é lizado em água e oxigênio.
O teste é positivo quando acontece formação de bolhas pela liberação de O2 .
Este teste é utilizado para diferenciação de Staphilococcus, Eterococcus e Streptococcus o unico positivo.
Todavia os macrófagos presentes no meio podem produzir peróxido de hidrogênio, por isto a necessidade de uma coleta superficial.
RESULTADO: Houve formação de bolhas nas duas amostras, o que indica resultado positivo, conforme mostrado na imagem.

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5.4 Demais provas
Coma já falamos, os meios de culturas proporcionam um crescimento seletivo, no entanto  o meio, não é único critério inequívoco para determinar a espécie do microrganismo, por este motivo usamos as provas.
Ao observamos o crescimento das bactérias em ágar sangue, provocando hemólise, e após visualização no microscópio de cachos, podemos constatar trata-se de uma bactéria gram +, então seguem-se os demais testes:

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Prática 2: provas de identificação de cocos gram-positivos

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Prática 2: provas de identificação de cocos gram-positivos

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1 TIPO DE AMOSTRA E INFECÇÃO
A professora nos informou que a amostra é advinda de uma infecção de pele. O agente causador da infecção varia de acordo com o local acometido e o tipo de lesão. Mas, dentre os agentes mais comumente encontrados em infecções da pele, estão o Streptococcus pyogenes e o Staphylococcus aureus, ambos cocos gram-positivos. O Staphylococcus aureus faz parte da nossa microbiota e é comumente encontrado na pele e mucosas, nas provas bioquímicas demonstra ser positivo para catalase e coagulase. O Streptococcus pyogenes é uma bactéria patogênica, catalase negativo e  beta-hemolítico do grupo A de Lancefield.
Outras bactérias também podem ser encontradas em feridas na pele, como as gram-negativas Pseudomonas aeruginosa, comum em queimaduras; e a Escherichia coli.

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Os meios de cultura fornecem as condições e nutrientes necessários para os microrganismos, por este motivo é possível diferenciá-los pelo crescimento ou inibição, como ágar sangue e o ágar MacConkey.

O ágar sangue  oferece ótimas condições de crescimento apara maioria dos microrganismos, no entanto a conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos,  que são úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.

O ágar MacConkey, é seletivo para Gram negativos, o  cristal violeta  presente na composição inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos.

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Nesta prática discutimos acerca da técnica de semeadura, isto é, a inoculação de microorganismos em um meio de cultura. Em seguida, realizamos a semeadura por esgotamento de duas amostras distintas, em dois meios de cultura o ágar sangue e o ágar MacConkey, para posterior identificação dos microorganismos, após o crescimento.