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Arellanes carranza Abner Isaac

Avante Valencia Rosa Laura

Castillo Cordova Zeltzin Xochiketzalli

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1. El glucógeno obtenido en la práctica anterior (4a) se resuspende en 4 ml de PBS o agua bidestilada

2. Se preparan 8 tubos de ensayo y se marcan del 1 al 8. Se añaden a cada uno de ellos el glucógeno (excepto al primero que lleva agua) y la solución de HCl
incubación.

3. Se colocan los tubos 3 a 8 en un baño de agua hirviendo para que 3.1.2. Se colocan los tubos 3 a 8 en un baño de agua hirviendo para que transcurra la reacción. Los tubos 1 y 2 no se meten en el baño. A los transcurra la reacción. Los tubos 1 y 2 no se meten en el baño. A los tiempos indicados en la Tabla 1, se saca cada tubo y se le añade el

tiempos indicados en la Tabla 1, se saca cada tubo y se le añade el NaOH, que neutraliza la acción del HCl, y por tanto se detiene la NaOH, que neutraliza la acción del HCl, y por tanto se detiene la hidrólisis. Se agita fuertemente.

hidrólisis. Se agita fuertemente.

4. Se dejan reposar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente 3.1.3. Se dejan reposar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente hasta que concluye la última incubación.

3.1.4. Se añade el reactivo 3’5’DNS a todos los tubos y se introducen de nuevo en el baño hirviendo durante 5 minutos. En estas condiciones, el 3’5’DNS reacciona con los grupos reductores y se convierte en 3- amino-5-dinitrosalicílico.

3.1.5. Pasado este tiempo, se enfrían con agua del grifo.

hasta que concluye la última incubación.

5. Para el siguiente paso se requiere del control positivo que es 1 ml de la solución de glucosa mezclada con la cantidad indicada del reactivo de Benedict

6. Se añaden 2.5 ml del reactivo de Benedict a todos los tubos y se introducen de nuevo en el baño hirviendo durante 5 minutos. 7. Pasado este tiempo, se enfrían y se observan cualitativamente los tubos que presentan una reacción de Benedict positiva, esto es la formación de un precipitado rojo, naranja o verdoso

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PROCEDIMIENTO

1. Pesar 4 g de hígado de pollo, macerarlo en mortero e introducirlo a un tubo de ensayo

2. Añadir al macerado de hígado 3 ml de solución de hidróxido de potasio al 30%

3. Calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 20 min con MUCHO CUIDADO

4. Enfriar el tubo una vez acabada la digestión (comprobar con el dorso de la mano)

5. Añadir 0.2 ml de solución saturada de Na2SO4 y mezclar fuertemente

6. Reposar por 5 min

7. Añadir 7 ml de etanol al 95% para precipitar el glucógeno 8. Agitar y dejar en hielo por 5 min

9. Pasar la solución a un tubo cónico y centrifugar a 5000 x g durante 5 min

10. Desechar el sobrenadante y colocar el tubo invertido sobre papel secante

11. Añadir 5 ml de TCA al 10% y disolver totalmente el sedimento agitando fuertemente.

12. Centrifugar a 5000 x g por 5 min

13. Pesar un tubo cónico de plástico junto con su tapa y anotar el peso

14. Añadir el sobrenadante obtenido en la centrifugación al tubo cónico previamente pesado

15. Agregar 10 ml de etanol al 95% y dejar reposar por 5 min para precipitar el glucógeno

16. Centrifugar durante 5 min a 5000 x g

17. Desechar el sobrenadante y dejar secar en la estufa a 37oC hasta su utilización.

18. Pesar el glucógeno purificado y determinar que % de glucógeno obtuvo, teniendo en cuenta que partió de 4 g de hígado.

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MATERIALES Y REACTIVOS• Tubos de ensayo • Baño maría • Pipetas • Gradilla • Cronómetro • Solución de glucosa al 5% • Solución de HCl 2M • Solución de NaOH 1.2M • Buffer salino de fosfatos (PBS) • Reactivo de Benedict 

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MATERIALES Y REACTIVOS• Tubos de ensayo • Baño maría • Pipetas • Gradilla • Cronómetro • Solución de glucosa al 5% • Solución de HCl 2M • Solución de NaOH 1.2M • Buffer salino de fosfatos (PBS) • Reactivo de Benedict 

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4. Considerando el % de glucógeno reportado, analice sus resultados y de una posible explicación de los mismos.En la hidrólisis ácida como enzimática deben corresponderse con un aumento de dicha hidrólisis a lo largo del tiempo. Este aumento debe ser proporcional, aunque ésta puede perderse en los últimos minutos si ya se ha conseguido hidrolizar prácticamente todo el glucógeno de la muestra. También se puede perder la proporcionalidad si no se añade el NaOH, en el caso de la hidrólisis ácida, o el DNS, en el de la hidrólisis enzimática, en los tiempos indicados pues no se pararía la hidrólisis de glucógeno de forma adecuada

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4. Considerando el % de glucógeno reportado, analice sus resultados y de una posible explicación de los mismos.En la hidrólisis ácida como enzimática deben corresponderse con un aumento de dicha hidrólisis a lo largo del tiempo. Este aumento debe ser proporcional, aunque ésta puede perderse en los últimos minutos si ya se ha conseguido hidrolizar prácticamente todo el glucógeno de la muestra. También se puede perder la proporcionalidad si no se añade el NaOH, en el caso de la hidrólisis ácida, o el DNS, en el de la hidrólisis enzimática, en los tiempos indicados pues no se pararía la hidrólisis de glucógeno de forma adecuada

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3. A qué vías catabólicas se puede incorporar el glucógeno y para qué.

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3. A qué vías catabólicas se puede incorporar el glucógeno y para qué.

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Carbohidratos: procesos bioquímicos de formación, ruptura y conversión de los glúcidos en los organismos vivos. Los glúcidos son las principales moléculas destinados al aporte de energía
Ácido láctico:transporta el oxígeno de los pulmones a otras partes del cuerpo. Normalmente, el nivel de ácido láctico en la sangre es bajo. Los niveles de ácido láctico aumentan cuando los niveles de oxígeno disminuyen
glucogénesis: tiene lugar la síntesis de glucógeno a partir de un precursor más simple, la glucosa-6-fosfato.

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Podemos observar y concluir que existen infinidad de enzimas que catalizan la hidrólisis de glucógeno dentro del cuerpo como lo es la a-amilasa y al final el producto de esta reacción es la formación de glucosa, maltosa e isomaltosa, así como todos los posibles oligosacáridos, estos como fuente de energía y sustento del cuerpo humano.

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Desde la práctica anterior podemos observar cómo es que se dan estos procesos de purificación molecular de lo que es el glucógeno, hasta su total obtencion de producto puro, lo cual nos permite ver la reacción de éste en presencia de grupos reductores de la hidrólisis hasta su posible deformación como fuente de energía final que el cuerpo humano genera, conocida como glucosa.

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Hidróxido de sodio.

El hidróxido de sodio es un sólido blanco e industrialmente se utiliza como solución al 50 % por su facilidad de manejo. Es soluble en agua, desprendiéndose calor. Absorbe humedad y dióxido de carbono del aire y es corrosivo de metales y tejidos.

Es usado en síntesis, en el tratamiento de celulosa para hacer rayón y celofán, en la elaboración de plásticos, jabones y otros productos de limpieza, entre otros usos.

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Ácido clorhídrico

Es una disolución acuosa del gas cloruro de hidrógeno (HCl). Es muy corrosivo y ácido. Se emplea comúnmente como reactivo químico y se trata de un ácido fuerte que se disocia completamente en disolución acuosa. Una disolución concentrada de ácido clorhídrico tiene un pH inferior a 1; una disolución de HCl 0,1 M da un pH de 1.

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Buffer salino de fosfatos (PBS)

Es una solución amortiguadora e isotónica, cuya función es mantener el pH y la presión osmótica lo más parecido al ambiente biológico natural.

El PBS está compuesto por una combinación como son:

sales, tales como cloruro de sodio

fosfato de sodio

cloruro de potasio

fosfato de potasio.

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Reactivo de Benedict

Es una disolución azulada de cobre que se utiliza para detectar la presencia de azúcares reductores: aldehídos, alfa-hidroxi-cetonas y hemicetales.

sirve para:

Detección de glucosa en la orina

Detección de varios monosacáridos y disacáridos

Los componentes del reactivo de Benedict son los siguientes:

sulfato de cobre pentahidratado

carbonato de sodio

citrato trisódico y agua destilada.

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Podemos observar en cada uno de los tubos, si existe la presencia de los grupos reductores por la hidrólisis del glucógeno, que son detectados por el reactivo de (3’-5’-DNS). Esté en presencia de los azúcares reductores pasa a ser reducido a 3-amino-5-dinitrosalicílico.

La hidrólisis de estos enlaces glucosídicos pueden ser catalizados por minerales, que permiten la disyunción de los enlaces que posteriormente permitirán la posible formación de los oligosacáridos y la conversión final de estos en glucosa.

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El glucógeno es el carbohidrato de almacenamiento de energía de los vertebrados está  formado por unidades de glucosa unidas entre sí mediante enlaces α 1-4 y con ramificaciones en α 1-6 cada 4 - 6 residuos.

Este polisacárido tiene un aumento en sus grupos reductores durante la hidrólisis y estos se detectan mediante el reactivo 3’-5’-dinitrosalicílico (3’-5’-DNS). Este reactivo en presencia de azúcares reductores se reduce a ácido 3-amino-5-dinitrosalicílico (producto coloreado que absorbe a 540 nm).

Se sabe de la existencia de diversas enzimas que catalizan hidrólisis más específicas, por ejemplo, la α-amilasa de la saliva humana.Cataliza la hidrólisis rápida de los enlaces internos α(1-4). No hidrolizan, en cambio, los enlaces α(1-6) ni la maltosa. Los productos finales de la degradación del glucógeno por la α-amilasa son glucosa, maltosa e isomaltosa. Esta hidrólisis se sigue igual que la ácida, es decir, mediante la reducción de 3’-5’- dinitrosalicílico a 3-amino-5-dinitrosalicílico (producto coloreado que absorbe a 540 nm).

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Video complementario de la síntesis del glucógeno

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Video complementario de la síntesis del glucógeno

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Glucogénesis | Síntesis y estructura del glucógeno - Bing video

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Mediante los conocimientos previos se determinó cuantitativamente los niveles de glucógeno en el hígado del pollo, concluyendo que, los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como material de reservorio. El glucógeno es liberado por el hígado como una base fuerte, hasta la desintegración total del tejido, cuando se añade el TCR al homogeneizado anterior, precipita diversas sustancias de elevado peso molecular, como proteínas y ácidos nucleicos, en tanto el glucógeno permanece disuelto.

El glucógeno puede separarse de los monosacáridos y de los compuestos que se precipitan con el alcohol, por que los polisacáridos son mucho menos solubles en alcohol acuoso que los monosacáridos; y mediante cada uno de estos pasos se permitió el análisis para la determinación del grado de pureza de la preparación obtenida.

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La metodología que se llevó a cabo, la cual permitió el aislamiento del glucógeno basada en las propiedades químicas que este tiene al no compartir las mismas propiedades con otras sustancias, nos permite ver la importancia funcional que este tiene de manera sistemática en el cuerpo como almacén de energía y así como la eliminación de sustancias nocivas para el individuo.

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Mediante todos los procesos de separación para la purificación del glucógeno obtenido del hígado, podemos observar que es posible tener un porcentaje aceptable determinado de una pequeña cantidad de muestra del tejido. Una de las observaciones importantes que cabe denotar de manera esencial, es que gracias a las soluciones ácidas que permiten la síntesis de compuestos y en conjunto con la centrifugación, es que podemos obtener cada uno de los sedimentos necesarios paso por paso para  poder obtener como producto final el glucógeno puro.

Mediante los resultados obtenidos se indicará el rendimiento y porcentaje del glucógeno por cada gramo de tejido:

Cálculo porcentual del glucógeno puro en 25 mg del precipitado obtenido a partir de 4g de hígado utilizado como muestra:

mg precipitado x % glucógeno

glucógeno puro (mg) =________________________________= 9,257 mg

100 mg

mg de glucógeno puro

Rendimiento = _______________________  = 2,04 mg  glucógeno puro/g

g de hígado muestra

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2. Haga un diagrama con los pasos principales en la síntesis del glucógeno y cuál es su principal función.

función:Es el proceso más veloz y completo en las células musculares y su función principal es sintetizar el glucógeno para obtener glucógeno puro.

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Estructura del glucógeno.

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1. Dibuje la estructura del glucógeno. ¿Qué monosacárido y qué tipos de enlaces lo conforman? ¿Qué es un extremo reductor?

Monosacáridos:triosas (3C), tetrosas (4C), pentosas (5C), hexosas (6C), heptosas (7C) y octosas (8C).

Tipo de enlaces:Tiene enlaces glicosídicos α-(1→4) y α-(1→6)

extremo reductor:Es el extremo de la cadena polisacarídica que contiene el C anomérico libre esto quiere decir que no forma parte de un enlace glucosídico,se conoce como extremo reductor en este caso  en el glucógeno Solo hay un extremo reductor, que se encuentra en el carbono 1 que únicamente no forma enlace con otra glucosa en la primera molécula de glucosa a partir de la cual comienza la síntesis de este glucógeno.

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Equipamiento
Colorímetro.
Baño con agua hirviendo.
Agitador de tubos.
Material
Tubos de ensayo de vidrio (1,5 x 16,0 cm) y gradilla. Pipetas automáticas (0,1 y 1,0 mL).
Pipetas de vidrio (10 mL).
Propipeta.
Cronómetro.
Rotulador de vidrio.
Reactivos
Solución de ácido clorhídrico.
Solución de hidróxido sódico.
Reactivo 3´-5´-dinitrosalicílico (3’-5’-DNS).
Solución de glucógeno comercial.
Solución de α-amilasa de saliva humana.
Agua destilada.
Solución amortiguadora de fosfato sódico

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Hidrólisis ácida y enzimática del glucógeno

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Hidrólisis ácida y enzimática del glucógeno

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Videotutoriales Informática Educativa. (2019, 18 octubre). Hidrólisis ácida y enzimática del glucógeno [Vídeo]. YouTube. https://www.youtube.com/watch?v=x9NQF6sKrsw
M. (2021). Bioquimica. Las Bases Moleculares D (5.a ed., Vol. 5). MCGRAW HILL EDDUCATION.
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/23%20HIDROLISIS%20GLUCOGENO.pdf
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/22%20AISLAMIENTO%20GLUCOGENO.pdf

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Video complementario

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Hidrólisis ácida y enzimática del glucógeno