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La chirimoya (Annona cherimola M.) es nativa del Ecuador.
Es por ello que se requiere la extracción de ADN confiable, la cual manifieste rangos de concentración y pureza.
Se tomaron muestras de brotes foliares jóvenes de chirimoya (CH-51) como material vegetal.
Las tres muestras que se realizaron fueron sometidas a varias reacciones químicas y físicas.
En la cuantificación por medio del software de NanoDrop se obtuvo como resultado que la muestra CH-51 m2 obtuvo una mayor concentración de ácidos nucleicos que las muestras CH-51 M1 y CH-51 M3
En cuanto a pureza la muestras CH-51 m1 y CH-51 m2 tanto A260/280 y A260/230 constan los valores dentro del rango 1,8 a 2,2, a diferencia que A260/230 de la tercera muestra es baja al valor requerido.

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En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan información sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (Schlötterer 2004).
Para esta práctica se cuantifico el ADN de la chirimoya (Annona cherimola M.) Utilizando tres muestras de hojas. La extracción representa una de las técnicas moleculares para obtener libre de impurezas, características fundamentales para el éxito en la obtención de datos genéticos confiables. En este apartado se incluyen los resultados que se obtienen al cuantificar cada muestra de chirimoya, siguiendo el procesamiento adecuado de muestras que permiten obtener ADN con dichas características. (Velázquez, Martínez, & Romero. 2014).
Por lo que el objetivo de la práctica es extraer cuantificar el ácido desoxirribonucleico por medio de espectrofotometría en el laboratorio del CADET.

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General
Realizar la extracción y cuantificación de ADN en muestras jóvenes del cultivo de Chirimoya (Annona cherimola) de la provincia de Pichincha con el uso de espectrofotometría en el laboratorio.

Específicos
-Identificar las etapas a la que es sometida la muestra de chirimoya para la extracción de ADN.
-Realizar la cuantificación de las muestras de ADN de chirimoya mediante espectrofotometría.
-Obtener una preparación de ADN de buena calidad y cantidad de las muestras de chirimoya.

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La práctica de extracción y cuantificación de ADN fue realizada en el laboratorio de Genética ubicada en el Campo Docente Experimental “La Tola-Tumbaco” (CADET) con coordenadas 00°13’49’’S y 78°21’18’’O.
Extracción de ADN

Primero se tomaron los brotes foliares de chirimoya hasta que las muestras pesen > 220 mg, este proceso se lo realizo tres veces obteniendo así tres muestras. Cada una de las muestras se colocó en un mortero previamente congelado porque las bajas temperaturas ayuda a romper las paredes, y se agregó 800 de CTAB, para macerar las muestras.  al obtener una mezcla liquida se procedió a traspasar en los tubos eppendorf de 1,5ml, a cada uno de los tubos se los señalo con la clave  CH-51, y el número de muestra, y en las tres muestras liquidas se colocó 8 microlitros de B-mercaptoetanol, y se colocan los tubos en un vaso de precipitación en baño María de 56-65 °C por 30 minutos, el baño maría de las muestras con el B-mercaptoetanol sirve para poder inhibir ADNasas, cuyas enzimas degradan al ADN.

Al haber transcurrido los 30 minutos se coloca 400ml de cloroformo más alcohol isoamílico, y se agita manualmente hasta que las muestras puedan adquirir un color verde claro lechoso, se procede a colocar las muestras en la centrifugadora por 10 minutos a 15000 rev/min.

Al trascurrir el tiempo en la centrifugadora, se toma el liquito transparentoso a otros 3 tubos eppendorf sin que los precipitados que se encuentran en el fondo se traspasen a las nuevas muestras, se adiciona a las nuevas muestras centrifugadas 300 microlitros de isopropanol, y se colocan los tubos en la centrifugadora por 15 minutos a 12000 rev/min.

Al transcurrir los 15 minutos se observa como un precipitado de coloración café clara, la cual corresponde a los extractos de ADN en el fondo de cada uno de los tubos, se vacía el isopropanol sin botar los precipitados de ADN.

Se deja reposar por 5 minutos las muestras con 200 microlitros de etanol, y se coloca nuevamente en la centrifugadora por 4 minutos a 10000 rev/min.  Colocar 100 microlitros de solución de Buffer TE.
Cuantificación de ADN

Se prepara el NanoDrop, el cual está conectado al programa de software para cuantificar las muestras de ADN de chirimoya, se abre la aplicación en la computadora y se le selecciona las variables del ensayo, en esta práctica se analizó los niveles de ácidos nucleicos, pureza de las proteínas estas debían constar en un rango de 1,8 a 2,2.

Se limpia el pedestal del NanoDrop, y con una micropipeta se toma la muestra con la solución Buffer TE y del ADN de chirimoya y se coloca 1 microlitro en el sensor, y se procede a cuantificar y se repite este procedimiento para las otras muestras

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En la muestra CH-51M1 se observa una cantidad de 770.3 ng/µl Acido Nucléicos, una absorbancia (260/280) de 1.93, para la segunda valoración una absorbancia (260-230) fue de 1.82. En el caso de la muestra CH-51M2 la cantidad de ácidos nucleicos fue de 2198.9 ng/µl, una absorbancia (260/280) de 1.99, para la segunda valoración una absorbancia (260-230) fue de 1.91. Por otro lado, la muestra CH-51M3 tuvo una cantidad de 86.2 ng/µl Acido Nucléicos, una absorbancia (260/280) de 1.95, para la segunda valoración una absorbancia (260-230) fue de 1.40.

Estudios realizados por Velázquez, L. P. A. & Romero, A. C. (2014) mencionan que para estimar la pureza del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Una proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de proteínas.

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En la Imagen se pude apreciar un crecimiento muy marcado a los 260 nm y un decrecimiento a los 285 casi 290 nm, lo que hace denotar que la pureza de la muestra CH-51M2 de chirimoya es mayor que las muestras CH-51M1 Y CH-51M3.

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- La extracción de ADN se utiliza para la cuantificación de proteínas componentes de la doble cadena, por ende, para su recolecta se debe tener en cuenta la calidad de cada muestra. Estas muestras deben estar libres de impurezas, con ello se garantiza datos con menos errores.

- Para conocer los datos de cada distinta variedad o muestra es necesario conocer la información genética de la especie a muestrear.
- Con estos resultados se conoce y se puede registrar características beneficiosas para producción, como lo es la calidad nutritiva, cantidades de azúcar o especies que en su codificación genética contienen cualidades de resistencia a enfermedades fitosanitarias.

- M2 obtuvo una mayor concentración de ácidos nucleicos que las muestras M1 y M3, en cuanto a pureza la muestras M1 y M2 están en rangos de A260/280 y A260/230 constan los valores dentro del rango 1,8 a 2,2, a diferencia que A260/230 de la tercera muestra es baja al valor requerido.

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Para tener una pureza aceptable se debe macerar bien las hojas hasta que llegue a un punto líquido

Emplear el método CETAB, dado que permite romper la membrana celular y obtener el ADN.

Para la extracción de ADN en chirimoya se recomienda mantener la muestra a baño maría por 30 minutos y con una temperatura de 56-65 °C.

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1.    ¿Cuál es la función de precipitar en magnesio en la extracción del ADN? ¿Qué agente químico se usa para conseguir esto?

Este ión es un cofactor fundamental para el funcionamiento de la polimerasa, y su concentración óptima varía dependiendo de los primers que se utilicen en la reacción, de la concentración de desoxinucleótidos y de la concentración del ADN  .

El magnesio forma parte del EDTA que es un quelante (Mg++) y este ayuda a estabilizar las nucleoproteínas por ende hace que el DNA se precipite en presencia de alcohol y a baja temperatura (Palacios Santamaria. D, 2008).

El agente químico que es utilizado es el Mercaptoetanol el cual actua como agente reductor de enlaces disulfuro. Facilita así la desnaturalización completa y el desplegado de las moléculas de proteínas (Velásquez et al., 2014).

2.    Explique bajo que parámetros una muestra de ADN puede considerarse una muestra pura y que procedimientos son usados para cuantificar dicha pureza.

Se considera que el ADN es puro cuando el ratio A260/230 se sitúa en torno 1.8-2.2. Un ratio menor de 1.8 se relaciona con presencia de contaminantes en la muestra. Cuanto menor sea este ratio la presencia de contaminantes en la muestra será mayor (Mira, N. O., et al., 2008).

Un ratio <1.5 estaría indicando una impureza relevante en la muestra que podría comprometer su funcionalidad. No obstante, esta relación resulta mucho más variable que la relación A260/280 dependiendo de factores como la concentración de ADN o de la composición del tampón de resuspensión de la muestra (Bancoadn, 2020).

Para cuantificar la pureza se ocupa la espectrofotometría que determinar la concentración y la pureza de una muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada. De este modo la concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor de absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260nm. Mientras que la relación de absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza de las muestras (Bancoadn, 2020).

3.    ¿Para qué se usa la Espectrofotometría? ¿Cuál es la principal característica del ADN al utilizar está técnica?

La espectrofotometría es una técnica analítica cuyo fin es determinar la concentración de un compuesto en solución. Asimismo, esta técnica se basa en la absorción de las radiaciones electromagnéticas por parte de las moléculas. Por otra parte, “la cantidad de luz que se absorbe depende de la forma lineal de la concentración (Díaz et al., 2008, p.1).

La principal característica obtenida por la técnica de espectrofotometría como se menciona en la pregunta 2 es que se puede determinar la concentración y pureza de una muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada (Bancoadn, 2020).

4.    ¿El ADN extraído contiene también el ADN mitocondrial? ¿Por qué? Explique

Debido a su menor tamaño, el estudio del ADNmt es más fácil que el del ADN nuclear; además, se puede extraer en grandes cantidades, porque cada célula tiene varias mitocondrias. El ADNmt evoluciona más rápido y no se recombina, pasando intacto entre generaciones salvo por las mutaciones, facilitando la identificación de las relaciones entre organismos muy parecidos (Restrepo Cardona, L. C.,2010).

5.    ¿La extracción del ADN es un tipo de extracción continua o discontinua? ¿Por qué?

La extracción del ADN es de tipo continua ya que Lobos Quispe, R. L. (2019), menciona “La extracción continua, también llamada extracción sólido-líquido, consiste en la separación de uno o más componentes de una mezcla sólida por medio de un solvente líquido”.

La extracción sólido-líquido suele ser mucho más eficiente cuando se hace de manera continua con el disolvente de extracción caliente y la maceración con disolvente orgánico (Ullauri, P. G., 2010).

6.    ¿Qué función tiene el β-mercaptoetanol en la extracción de ADN?

El β-mercaptoetanol es un agente reductor de puentes disulfuro de las proteínas. Por equilibrio químico, al ponerlo en contacto con las proteínas, el grupo mercapto reduce a las cisteínas que estén formando puentes disulfuro. Generalmente, es usado como un agente antioxidante y estabiliza las enzimas (Pérez de Castro, A. M., 2011).

7.    ¿Grafique a nivel celular como el CTAB provoca la rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico?

Pérez de Castro, A. M. (2011) menciona que el bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) ayuda a romper la bicapa de fosfolípidos de las membranas plasmáticas y la envoltura nuclear (Imagen 1). Los lípidos de la membrana se descomponen debido al detergente que deshace las uniones que mantienen la membrana junta. Cuando el CTAB se pone en contacto con los lípidos éstos se separan de la membrana rompiéndola. La estructura de los lípidos es similar a la del detergente y eso hace que se combinen, formando una burbuja de detergente y lípidos.

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Baño María de las muestras (CH-51M1, CH-51M2, CH-51M3)

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Baño María de las muestras (CH-51M1, CH-51M2, CH-51M3)