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Introducción. Reacción en cadena de la polimerasa

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Introducción. Reacción en cadena de la polimerasa

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Hoy en día, existe una manera más rápida y fácil de obtener grandes cantidades de una secuencia de ADN de interés -la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR permite usar el poder de replicación del ADN para amplificar enormemente el ADN en un corto período de tiempo. Como saben, las células replican su ADN antes de dividirse, y al hacerlo, duplican la cantidad de ADN de la célula.

La PCR imita esencialmente la replicación del ADN celular en el tubo de ensayo, copiando repetidamente el ADN diana una y otra vez, para producir grandes cantidades del ADN deseado.

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Una vez que los fragmentos se han separado, podemos examinar el gel y saber el tamaño de las bandas que se encuentran en él. Cuando un gel se tiñe con un pigmento que se une al ADN y se coloca bajo luz UV, los fragmentos de ADN brillarán, lo cual nos permite ver el ADN presente en distintos lugares a lo largo del gel.

Una "línea" de ADN bien definida en un gel se llama banda. Cada banda contiene un gran número de fragmentos de ADN del mismo tamaño que han viajado juntos a la misma posición. Un fragmento único de ADN (o incluso un pequeño grupo de fragmentos de ADN) no sería visible por sí mismo en un gel.

Al comparar una banda en una muestra con el marcador de peso molecular, podemos determinar su tamaño aproximado. Por ejemplo, la banda brillante del gel anterior tiene un tamaño aproximado de \[700\] pares de bases (pb).

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Preguntas de desarrollo. Responda las siguientes preguntas teniendo en cuenta el video de la parte superior.

1. ¿Cuáles son los reactivos requeridos para hacer la mezcla de la PCR?

2. ¿Cómo se calcula el Volumen del de la concentración del DNA.

3. ¿Explique como se calcula el volumen de los primers?

4. Describa como se calcula los volumenes de los dNTP's

5. Explique como se calcula el volumen de la Taq polimersa.

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🧬 🥼 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ¿Cómo se hacen los CALCULOS para el MASTER MIX 🧬 🥼

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- INICIO: Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

- DESNATURALIZACIÓN: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de guanina y citosina que contenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

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PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa (divulgación científica IQOG-CSIC)