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La misión de la PCR es copiar millones de veces una secuencia específica de ADN blanco mediante una poderosa catálisis llevada a cabo por una enzima conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades pequeñas de ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con diferentes fines (Tamay de Dios et al., 2013).

Hay tres etapas principales de las que se compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR o también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa (Tamay de Dios et al., 2013).

La PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice de ADN mediante el calentamiento de la muestra a una temperatura entre 94 y 96 °C para romper los puentes de hidrógeno que las unían, de esta manera cada cadena queda como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN, se alinean los iniciadores a sitios específicos complementarios de las cadenas sencillas de la región que se va a amplificar, para que esto suceda se baja la temperatura entre 40 y 60 °C lo que permite la unión (alineamiento) de los iniciadores. Finalmente, se sintetiza una nueva cadena en sentido 5’ a 3’ para lo cual se incrementa la temperatura, por lo general a 72 °C, porque es la temperatura óptima a la cual la ADN polimerasa se une a los iniciadores y comienza la replicación (Serrato Diaz et al., 2014).

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La PCR se aplica en diferentes áreas de las ciencias biológicas y de la salud, formando parte del quehacer científico de muchos laboratorios de investigación que la utilizan principalmente para expresión génica, genotificación, detección de patógenos y análisis de mutaciones (Tamay de Dios et al., 2013).

La PCR es la técnica más importante en la biología molecular porque con ella se ha logrado la simplificación e innovación de muchas técnicas moleculares que permiten abordar nuevas líneas de investigación en diferentes ramas de la ciencia como biotecnología, ecología, evolución, biología de la conservación, arqueología, patología, medicina forense, entre otras (Sierra Diaz et al., 2014).

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Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o buffer y H2 O (Tamay de Dios et al., 2013).

El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza química ofrece ventajas para su manipulación. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,4 que proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus, la cual vive en condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar ese tipo de temperaturas (Tamay de Dios et al., 2013).

Los primers son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanca que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia (Tamay de Dios et al., 2013).

Los dNTP’s son los ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es importante que su concentración sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa. Normalmente, se utilizan a una concentración que oscila entre 0.2 a 1.0 mM (Tamay de Dios et al., 2013).

El buffer es la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está compuesta de Tris-HCL (pH = 8) cuya concentración final de trabajo debe ser 1X. También se usan otros buffers de composición distinta que son fácilmente comprados en el mercado (Tamay de Dios et al.,2013).

El magnesio es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa; regularmente su concentración oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones ya viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene que agregar (Tamay de Dios et al., 2013).

El agua es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de nucleasas, enzimas que degradan a los ácidos nucleicos (Tamay de Dios et al., 2013).

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Indica la capacidad de la prueba PCR para dar como casos positivos los casos realmente infectados. De esta forma, se reduce al mínimo la cantidad de falsos negativos, que son especialmente peligrosos, ya que pueden seguir contagiando a otras personas.

("Cigna", 2022)

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) | Biotecnología | Biología | Khan Academy en Español

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Se refiere a los errores que comete la DNA polimerasa durante la amplificación. máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclosUna buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos

Kraiselburd, I. (2016).

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Especificidad se refiere a la probabilidad de que los resultados de una prueba sean negativos si realmente no tiene la enfermedad. A medida que aumente la especificidad de una prueba, disminuirá la cantidad de personas que no tienen la enfermedad, pero cuyas pruebas tienen resultado positivo (positivos falsos).

("Cigna", 2022)

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Se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado.

Kraiselburd, I. (2016).

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Temperaturas, tiempos y ciclos estándares 

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Temperaturas, tiempos y ciclos estándares 

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Proceso de replicación del ADN a nivel celular 

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Proceso de replicación del ADN a nivel celular 

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Analisis de los amplicones con Electroforesis

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Analisis de los amplicones con Electroforesis

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Serrato Diaz, A., Flores, L., Aportela, J., & Sierra, E. (2014). PCR: reacción en cadena de la polimerasa. Herramientas moleculares aplicadas en ecología, 53–73. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

Tamay De Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en Discapacidad, 2(2), 70–78. https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

Sensibilidad y especificidad | Cigna. (2022). Retrieved 22 February 2022, from https://www.cigna.com/es-us/individuals-families/health-wellness/hw/sensibilidad-y-especificidad-sts14487

Kraiselburd, I. (2016). Clase PCR final. Clase PCR II Reacción en cadena de la polimerasa. https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/140020/mod_folder/content/0/PCR%20II%202016%20Kraiselburd.pdf?forcedownload=1

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La principal ventaja de la PCR es que permite generar millones de copias de la región de interés a partir de una o muy pocas copias del ADN molde. Es una técnica muy robusta debido, en gran medida, a la gran capacidad de los oligonucleotidos (en este caso de los iniciadores) de unirse firme y específicamente a sus secuencias complementarias de ADN discriminando fácilmente entre centenares de millares de sitios (Sierra Diaz et al., 2014).

La principal desventaja es la necesidad de estandarizar la técnica para el organismo o la técnica de interés, lo cual puede ser tardado y costoso (Sierra Diaz et al., 2014).

La Organización Mundial de la Salud, no incorpora técnicas moleculares dentro de sus métodos estandarizados debido a que en muchos países de tercer mundo es imposible comprar equipos y reactivos para hacer los diagnósticos con técnicas moleculares, entre ellos la PCR (Sierra Diaz et al.,2014).