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O que são? Quais tipos? Descubra clicando no vídeo acima ☝️☝️☝️

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Eles podem ser: de aglutinação por latex, precipitação (imunodifusão), fixação do complemento e imunofluorescência.

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Tem um valor diagnóstico apenas relativo, sendo indispensável diagnóstico em sua forma parasitária (exame direto e análise histopatológica) ou isolamento em cultura.

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Granuloma pulmonar por Coccidioides immitis.

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Provas imunológicas podem substituir outros métodos de diagnóstico? 

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Provas imunológicas podem substituir outros métodos de diagnóstico? 

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Com os avanços tecnológicos, e em alguns casos, essas provas podem se comparar as demais formas de diagnóstico. Um exemplo é a aspergilose pulmonar ou cerebral por Aspergillus fumigatus, diagnosticadas por provas sorológicas de precipitação.

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Aspergillus fumigatus.

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Exprimem reações de sensibilidade cutânea a fungos. Tricofítides, epidermofítides e microspórides indicam a forma do gênero do dermatófito sensibilizador.

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Lesão assética, isto é, não deve haver parasito;

Foco sético em outro ponto do organismo, próximo ou à distância.

Sensibilidade à intradermoreação pela tricofitina, filtrado de cultura de uma ou várias espécies tidas como capazes de desencadear tais reações.

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As técnicas imunológicas também têm aplicações em: inquéritos epidemiológicos, prognóstico, controle de eficiência terapêutica, descoberta de animais reservatórios de parasitos, classificação de espécies baseada na constituição antigênica de parede celular.

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Provas intradérmicas de sensibilidade cutânea dos antígenos fúngicos.

Provas sorológicas de aglutinação, precipitação, fixação do complemento e imunofluorescência.

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Testes intradérmicos.

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Os testes sorológicos indicam apenas que houve infecção pelo fungo; a atividade da doença deve ser inferida pela correlação com manifestações clínicas atuais.

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Tiveram um avanço a partir de 1946, com a introdução do método de precipitação em Ágar (gelose); se positiva, há o aparecimento de uma ou mais linhas opacas, que correspondem aos diversos acoplamentos de antígeno-anticorpo.

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Depois, introduziu-se a técnica da dupla difusão na gelose (técnica de Ouchterlony) ou imunodifusão, que serviu para estudar a estrutura antigênica de fungos patogênicos, como Candida, Cryptococcus e Aspergillus. Tem melhor aplicação no diagnóstico da aspergilose por Aspergillus fumigatus, histoplasmose, micose de Gilchrist, candidíase profunda, esporotricose, coccidioidomicose, micetomas actinomicóticos, mas não na criptococose. Os antígenos têm que ser de boa qualidade e solúveis.

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Antígenos Celulares ou Somáticos: feitos por trituração do micélio ou leveduras, de culturas jovens (10 dias para A. fumigatus).

Antígenos Metabólicos: obtidos por filtração de culturas velhas, com mais de 30 dias.

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A imunoeletroforese é menos sensível que a imunodifusão.

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A imunoeletroforese é menos sensível que a imunodifusão.

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Porém, permite melhor análise qualitativa das frações de precipitação

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Colocar, na lâmina, cultura de fungo A; juntar soro humano ou soro animal Anti-A. Em seguida, soro antiglobulina humana ou antiglobulina animal, tudo conjugado ao fluorocromo.

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São utilizados pus, esfregaço ou cortes histológicos (fixados e corados). As reações são observadas em microscópio fluorescente: é fixado em lâmina e tratado por anticorpos específicos. Na técnica direta também é utilizado:

Soro de animal imunizado;

Soro humano;

Conjugados ao fluorocromo.

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A sorologia pode ajudar a definir o critério de cura e a duração do tratamento.

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A sorologia pode ajudar a definir o critério de cura e a duração do tratamento.

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Os títulos de anticorpos podem diminuir gradativamente com o controle clínico da doença e o critério de cura sorológica baseia-se na negativação ou estabilização em diluição de 1:2, ou menos.

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Imagem b: Representa uma Prova de Aglutinação por Latex para criptococose demonstrando aglutinação nos orifícios superiores correspondentes aos soros positivos e, nos orifícios inferiores, aspecto leitoso nos soros negativos

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India ink stain to reveal the polysaccharide capsule on yeast cells of the AIDS-associated pathogen Cryptococcus neoformans.

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Prova de aglutinação por latex é altamente sensível e específica. 

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Prova de aglutinação por latex é altamente sensível e específica. 

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Feita a partir de antígenos capsulares do Cryptococcus sp. o teste extremamente rápido e fácil de ser realizado, cujo resultado inicial é por meio de uma reação de aglutinação passiva.

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Consiste em homogeneizar a amostra clínica do paciente com uma partícula inerte (látex) sensibilizada com anticorpo anti-antígeno capsular de Cryptococcus sp.

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Realizada visualmente, as negativas são as amostras de aspecto leitoso (B) e positivas as amostras que formarem grumos, na imagem acima acompanhada por compensação do fundo (A), correspondentes à aglutinação de vários antígenos ligados entre si através dos sítios de ligação Fab dos anticorpos.

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Podem ocorrer em casos de criptococose causada por Cryptococcus sp. deficiente de cápsula ou em casos de excesso de antígeno na amostra, o que não permite que as pontes se formem e que a aglutinação ocorra, fenômeno chamado de “efeito pró-zona”. Caso haja suspeição da ocorrência desse fenômeno, os soros devem ser diluídos e o teste repetido.

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Teste sorológico de Fixação do Complemento (FC)

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Teste sorológico de Fixação do Complemento (FC)

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Consiste na detecção de anticorpos presente nas amostras biológicas do indivíduo.

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Esse teste baseia-se na interação entre o antígeno do Histoplasma capsulatum e o anticorpo do soro do paciente com Histoplasmose acompanhada da fixação do sistema complemento. Esse teste possui uma especificidade entre 70% a 80%, em contrapartida a sensibilidade dependente da fase de desenvolvimento do agente fúngico, sendo que na micelial varia em torno de 78,2%, enquanto a leveduriforme gira em torno de 94,3%

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Deve ser feito entre duas a seis semanas após a infecção;
Para a fixação do complemento, o antígeno é extraído da fase leveduriforme do H. capsulatum, porque se mostra mais sensitivo. De um modo geral, pode-se dizer que a fase leveduriforme fornece antígenos mais sensitivos, porém menos específicos.

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Os antígenos utilizados para fixação de complemento são: filtrados, suspensões de esporos, extratos polissacarídicos e como ocorrem provas cruzadas com antígenos de agentes de outras micoses, é recomendável fazer provas paralelas com esses antígenos, como a de precipitação.

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São testes muito utilizados, tanto em pesquisa científica como na medicina clínica, são excelentes por apresentarem resultados reprodutivos e com alta sensibilidade.

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Seu princípio básico é a detecção de anticorpos reagentes ou a detecção do antígenos circulantes no soro do paciente. Os resultados podem ser quantitativos ou apenas qualitativos.

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O ELISA indireto é uma técnica qualitativa e consiste na detecção da interação de um anticorpo primário não marcado com o antígeno imobilizado na microplaca. A ligação do anticorpo primário ao antígeno é detectada por meio de um anticorpo secundário marcado com uma enzima. Esse método é mais utilizado na detecção de anticorpos em amostra de soro para diagnóstico de doenças infecciosas.

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Elisa no diagnóstico de Paracoccidioidomicose

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Elisa no diagnóstico de Paracoccidioidomicose

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O ELISA para detecção de anticorpos anti-PCM é o mais utilizado entre os laboratórios do Brasil e desde então tem sido usado como base para muitas outras publicações sobre detecção de anticorpos nesses pacientes.

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Economia e tempo de execução reduzido são as principais vantagens em sua utilização na rotina dos laboratórios. Porém, por ser altamente sensível, o número de reações cruzadas com outras doenças como a Histoplasmose pode ser uma limitação. Assim, muitos estudos têm sido desenvolvidos para tentar diminuir ou eliminar esse problema. A saída parece estar no antígeno utilizado no teste, que pode ser antígeno bruto, parcialmente purificado ou gp43 purificada.

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Detecção da galactomanana por ELISA sanduíche  

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Detecção da galactomanana por ELISA sanduíche  

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O diagnóstico definitivo da aspergilose invasiva é limitado por várias razões. Culturas de secreções respiratórias possuem sensibilidade diagnóstica muito baixa: Aspergillus sp. é recuperado em cultivo do escarro e do LBA em apenas 8-34% e 45-62% dos pacientes com aspergilose invasiva, respectivamente.

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É um teste específico que têm sido desenvolvidos para auxiliar os métodos convencionais frequentemente utilizados na rotina micológica. A ANVISA liberou no Brasil, a técnica de ELISA sanduíche desenvolvida para a detecção da galactomanana, um polissacarídeo hidrossolúvel componente da parede celular de fungos do gênero Aspergillus, liberado na circulação sanguínea durante o crescimento das hifas nos tecidos do hospedeiro.

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Teste sorológico de precipitação (imunodifusão)

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Teste sorológico de precipitação (imunodifusão)

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Se baseia na formação de imunocomplexos que, devido ao seu alto peso molecular, precipitam, formando uma linha de precipitação visível macroscopicamente. É relativamente rápido e de fácil execução. O resultado é qualitativo.

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Pode ser realizado em lâminas ou em placas de Petri contendo gel de ágar na concentração de 1%, fundido em tampão fosfato ou tris. Furos são produzidos neste gel, para a disposição do antígeno no centro e dos soros a serem testados ao redor. Todos se difundem pelo ágar e, ao se encontrarem, reagem e precipitam formando uma linha com aspecto leitoso que pode ser visualizada através de iluminação indireta e sob fundo escuro. Uma amostra de soro controle positivo deve ser utilizado juntamente na reação para facilitar a leitura e a interpretação final do teste.

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A imunodifusão para o diagnóstico de histoplasmose resulta em duas linhas de precipitação conhecidas como bandas H e M. A banda H é diagnóstica de doença e é detectada em 10-25% das amostras positivas, ao contrário da banda M, que não distingue infecção prévia de infecção ativa e é encontrada em mais de 75-85% das amostras positivas.

Esse teste é rotineiramente utilizado para a pesquisa de anticorpos nas micoses pulmonares causadas por H. capsulatum, P. brasiliensis e Aspergillus sp. (forma alérgica e bola fúngica).

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Uma amostra positiva é aquela que forma uma linha de precipitação a qual possui sua extremidade unida com a linha do soro padrão, conhecida como “linha de identidade”, que significa que ambos os soros possuem anticorpos para o reconhecimento do mesmo antígeno.

Além de soro, outras amostras clínicas, como líquor e urina, também podem ser utilizadas.
Resultados falso-negativos frequentemente são observados em casos de pacientes imunossuprimidos.

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AMBRÓSIO, Alexandre Vasconcellos Alvim et al. Paracoccidioidomicose (doença de Lutz-Splendore-Almeida): propedêutica complementar, diagnóstico diferencial, controle de cura. 2014.

OLIVEIRA, D. G. et al. Aspectos clínicos e laboratoriais da histoplasmose: uma revisão bibliográfica. Research, Society and Development, v. 9, n. 1, p. 1–9, 2020..

OLIVEIRA, J. C. de. Tópicos em micologia médica 4a edição. Rio de Janeiro: Controllab, 2014.

XAVIER, Melissa Orzechowski; OLIVEIRA, Flávio de Mattos; SEVERO, Luiz Carlos. Capítulo 1: diagnóstico laboratorial das micoses pulmonares. Jornal Brasileiro de Pneumologia, v. 35, p. 907-919, 2009.