# data[].attributes.attachment_caption
Weergave van pBINplus, jouw experiment en wat je met de resultaten zou kunnen doen

# data[].attributes.body
Dubbeldigestie / dubbelrestrictie

In biotechnologie en life science research word soms gebruik gemaakt van plasmides. Dit zijn circulaire stukken DNA waar door middel van knippen en plakken makkelijk genen in te zetten zijn. Het handige aan plasmides is dat ze gemakkelijk in een bacterie te brengen zijn, waarna de bacterie het DNA kan lezen en afschrijven.

Wanneer je een gen in een plasmide wil zetten is het prettig wanneer je niet teveel van het plasmide verliest, in het plasmide zitten nuttige genen zoals antibiotica resistentie. Veel plasmides hebben een multiple cloning site (MCS), een plek waar veel restrictie enzymen kunnen knippen. Door een restrictie uit te voeren met 2 verschillende restrictie enzymen die allebei alleen maar in de MCS knippen kan je het plasmide ‘open’ knippen om een gen in te zetten, zonder dat je belangrijke sequenties van het plasmide kapot maakt en zonder dat het plasmide weer uit zichzelf dichtgeplakt kan worden.

Je supervisor wil een gen inbrengen in het pBINplus plasmide en jij gaat hiervoor het plasmide open knippen met restrictie enzymen. Hiervoor heb je de restrictie enzymen PstI , BamHI, HinDIII, NdEI en fisher restrictie buffers BamHI buffer, O buffer, R buffer en tango buffer ter beschikking.

Eisen aan resultaten:
* Plasmide wordt geknipt in 2 fragmenten: een heel groot fragment en een klein reststukje (<100 bp)
* Groot fragment wordt aan beide kanten geknipt met een ander restrictie enzym
* maar een klein fragment van het plasmide gaat verloren

Knip het plasmide open en bedenk controles om te analyseren of het experiment betrouwbaar verlopen is.

Om te controleren of de enzymen werken kan lambda DNA gebruikt worden

Analyseer of de knip gelukt is met agarose gelelectroforese

Met NEBcutter kan je bepalen welke combinatie restrictie enzymen het gewenste resultaat geeft
Images created with biorender.com

# data[].attributes.attachment_caption
Voorbeeldberekening voor verdunnen DNA voor in de individuele monsters

# data[].attributes.body
Bereid individuele monsters uit de reactiemix, maak daar een pipetteerschema voor

De berekening hierboven is een voorbeeld, bereken het zelf met de concentratie DNA die je gaat gebruiken (dit zie je op het lab). Noteer nu in je labjournaal een voorbeeldberekening zodat je die op het lab na kan doen.
Images created with biorender.com

# data[].attributes.attachment_caption
Printscreen van de dubbeldigestie handige tool van de fabrikant (Fisher) met andere enzymen als die jij gaat gebruiken

# data[].attributes.body
Zo ziet een resultaat er uit van de restrictie buffer tool van fisher. Er worden dit keer 3 adviezen gegeven, de 1e is altijd de best werkende.

Voor deze enzymen is het 1e advies: gebruik R buffer, gewone hoeveelheid Eco32I en een dubbele hoeveelheid HinCII, incubeer bji 37 OC
Images: printscreens from fishersci.com

# data[].attributes.body
Dit experiment heeft alleen een 'toekomst' als je het gaat herhalen.
Het heeft wel een 'verleden': het experiment waarin je het plasmide hebt geisoleerd. Noteer dat bij 'verleden' en noteer bij het plasmide isolatie experiment gegevens van dit experiment als 'toekomst'

# data[].attributes.body
Het enige verschil met een enkelrestrictie is dat je nu meerdere restrictie enzymen gebruikt. Hierdoor moet je goed nadenken over een geschikte restrictiebuffer. Gelukkig zijn daar handige tools voor..

# data[].attributes.body
Deze periode ga je voor de voorbereiding veel doen. wanneer je niet samenwerkt kan het teveel zijn om alleen te doen in een reële tijd.

Gebruik deze padlets om samen voor te bereiden. Als je met een groepje in een padlet werkt kan iedereen er tegelijkertijd aanvullingen in zetten.

# data[].attributes.attachment_caption
Fisher buffers kiezen websit. A: voor elk enzym is zo'n kaart met informatie beschikbaar. B: de makkelijke tool die een advies geeft bij dubbelrestrictie.

# data[].attributes.body
In de afbeelding staat de informatie die de fabrikant beschikbaar heeft over de te gebruiken buffers. Kijk in welke buffer allebei de enzymen het beste werken. Fisher heeft ook een makkelijke tool beschikbaar waarin de dubbeldigestie voor jou wordt uitgezocht, hij geeft dan meteen een aanbeveling over de buffer en enzymconcentratie (soms beveelt hij een dubbele hoeveelheid enzym aan). Ververs de pagina een paar keer als het niet meteen werkt (het ziet er dan niet zo uit als B in de figuur). In het tekstblok hiernaast staat een voorbeeld van hoe die tool er uit ziet.

(een * betekent dat als er veel teveel enzym word gebruikt of als er te lang gedigesteerd word de kans op STERactiviteit groter is)

Bij Tango buffers: 1x betekent 1x concentratie, 2x betekent  een dubbele concentratie gebruiken

Noteer hier welke buffers beschikbaar zijn (zie opdrachttekst)

...

...

Noteer hier welke buffers je gaat gebruiken

...

...

Images: printscreen from fishersci.com

# data[].attributes.body
Noteer hier dingen als:

Hoe je te gebruiken apparaten instelt

Incubatiestappen: hoe lang, bij welke temperatuur

Centrifugestappen: welke RPM, hoe lang, werk je verder met het supernatant of het pellet?

Agarose gelelectroforese: Voltage, geschatte tijd en waar welke kleur van de loading dye moet zijn wanneer je stopt

etc.

# data[].attributes.headline
12 Pipetteerschema toevoegen loading dye aan monster

# data[].attributes.subject
12 Pipetteerschema toevoegen loading dye aan monster

# data[].attributes.body
Wanneer DNA klaar is om op de agarosegel gezet te worden moet er nog loading dye bij. Dat gaat altijd in een verhouding van 1 loading dye : 6 DNA

Pipetteerschema loading dye toevoegen aan DNA
DNA                  ___ ul
Loading dye   ___ ul
eindvolume    ___ ul
Images created with biorender.com

# data[].attributes.body
Bij restrictie analyse maak je altijd een reactiemix. Uit de reactiemix maak je dan individuele monsters door aan een hoeveelheid reactiemix DNA toe te voegen. Elk monster dat je maakt noemen we een 'reactie'. Maak altijd reactiemix voor 1 reactie meer dan je monsters hebt.

Voor hoeveel reacties maak je reactiemix?

....

DNA: er wordt per reactie 1 ug DNA geknipt, bereken zelf hoeveel ul DNA er nodig is.

Concentratie lambda DNA: rond de 300 ng/ul. Als je je berekening noteert kan je dit op de labdag snel herberekenen met de ware concentratie.

Concentratie plasmide DNA: Dit is door jezelf of een labpartner geïsoleerd, kijk in het labjournaal

Berekening ul DNA:

[DNA]: ...

1 ug nodig

berekening: ...

Analysemonster:
Reactiemix dubbeldigestie ..................  en .................enzym
1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________
Restrictie enzym ............... (5U) ___  ul                 _____________
Restrictie enzym ............... (5U) ___  ul                 _____________
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

Controles:
Reactiemix enkeldigestie .................. enzym
1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________
Restrictie enzym HinDIII (5U) ___  ul                 _____________
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

Reactiemix enkeldigestie .................. enzym
1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________
Restrictie enzym HinDIII (5U) ___  ul                 _____________
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

# data[].attributes.attachment_caption
Agarosegel bereiden +  voorbeeldberekening

# data[].attributes.body
Vul hier het pipetteerschema voor agarosegel in

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

Kijk in de voorschriften, daar staat dat 0,7% agarose (tenzij er anders aangegeven is) vaak een goede concentratie agarose is

Er staat ook dat er 50 ml agarosegel nodig is

Vul in:
Agarosegel, 0,7% gel
agarose _____________________g
TAE _________________________ ml
eindvolume _________50_____ ml

Noteer nog hoeveel ul sybrsafe erbij moet, zonder sybrsafe blijft het DNA in de gel onzichtbaar. Waarschijnlijk is het sybrsafe op het lab 10x verdund i.v.m. veiligheid

Toevoegen aan gel voordat hij gegoten wordt:
puur sybrsafe:                    .... ul, of
10x verdund sybrsafe:     .... ul
Images created with biorender.com

# data[].attributes.body
Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan.
Doe de paginas met informatie over alle stoffen voor dit experiment vooraan in de map.

Correct gebruik van de veiligheidsmap wordt beoordeeld bij professionele werkhouding en tijdens de praktijktoets.

# data[].attributes.attachment_caption
Voorbeeld van hoe je een planning kan noteren

# data[].attributes.body
Het kan handig zijn om een planning te bedenken om overzicht te houden over de labdag. Uiteindelijk op de praktijktoets word gekeken of je weet wat je moet doen, of dat in je hoofd zit of op papier mag je zelf bepalen.

Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:

Materialen verzamelen

Gelplek inrichten

Epjes beschrijven

agarosegel oplossing maken

agarosegel gieten

agarosegel laten stollen

DNA monsters maken

Loading dye toevoegen aan DNA monsters

DNA monsters in de gel doen

Gel runnen (stroom erop zetten)

Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen

Opruimen

# data[].attributes.body
Maak voor je aan de voorbereiding begint de vragen bij 'kennis achter de technieken' op moodle. Die vragen helpen je nadenken over de voorbereiding van dit experiment.

# data[].attributes.body
Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier.

1:
2:
3:
4:
5:
6:
7:
8:
9:
10:
11:
12:
13:
14:
15:
Images created with biorender.com

# data[].attributes.body
Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren.
In de opdracht staat welke soorten DNA en welke restrictie enzymen en restrictiebuffers je beschikbaar hebt.

Materiaal, concentratie, fabrikant
...     ...     ...
...     ...     ...
...     ...     ...

# data[].attributes.body
Wat is het doel van het experiment?

Voor het doel staan vaak hints in de opdracht tekst

# data[].attributes.body
Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften.

...

...

# data[].attributes.body
Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?
Het principe hoeft niet in het labjournaal, maar er wordt wel naar gevraagd tijdens de praktijktoets.
Kijk in de voorschriften, 'kennis over technieken' op moodle en google
...

# data[].attributes.body
Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment

Onderbouw je verachting met een plaatje van de NEBcutter resultaten (voor elk monster) en plak deze in je labjournaal

Wat verwacht je dat er uit komt?

...

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet?

Ondebouw dit met NEBcutter

Hoeveel bandjes ga je op gel zien?

Hoeveel bp is elk bandje?

Als je controles bedacht hebt ga je daar ook verwachtingen bij bedenken
Hoe verwacht je dat controle .... er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoeveel bandjes ga je op gel zien?

Hoeveel bp is elk bandje?

...

Hoe verwacht je dat de negatieve controle er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoeveel bandjes ga je op gel zien?

Hoeveel bp is elk bandje?

...

Hoe verwacht je dat positieve controle 1 er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoeveel bandjes ga je op gel zien?

Hoeveel bp is elk bandje?

...

Hoe verwacht je dat positieve controle 2 er uit ziet? Onderbouw dit met NEBcutter

Hoeveel bandjes ga je op gel zien?

Hoeveel bp is elk bandje?

...

# data[].attributes.body
Het analysemonster van elk experiment is het monster waarmee je het doel kan bereiken. Bij elk experiment zijn ook controles nodig om te weten of de data van het analysemonster betrouwbaar is. Beschrijf hier welke monsters je wilt maken.
Beschrijf per monster:

wat het doet of controleert,

wat er wel of niet in het monster moet

hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt

Bij Restrictie analyse zijn duplo's niet heel nuttig. Het analysemonster hoef je dus niet 2* te maken.

Als je andere nuttige controles kan bedenken dan wat hieronder staat mag je die in je experiment gebruiken. Beschrijf wat je controleert en hoe je de controle maakt / behandelt

Analysemonster

Welk DNA gaat er in?

Welke enzymen doe je er bij?

Welke buffer gebruik je?

Negatieve controle
Met dit monster zie je hoe het experiment er uit ziet wanneer het 'mislukt'. Bij restrictie betekent dat vaak dat de enzymen niet geknipt hebben. Bedenk een monster waarbij je kan zien hoe het resultaat er uit ziet wanneer de enzymen niet geknipt hebben

Wat controleer je precies?

Welk DNA gaat er in?

Welke enzymen doe je er bij?

Welke buffer gebruik je?

Positieve controles
Met deze monsters wil je controleren of je gebruikte restrictieenzymen werken. Om zeker te zijn dat het DNA van goede kwaliteit is gebruik je een aangeleverd DNA monster.  Maak per enzym 1 controle.
Denk goed na over de buffer. Wil je weten of het enzym onder ideale omstandigheden kan knippen of wil je weten of het enzym kan knippen in de omstandigheden die je bij dubbeldigestie gebruikt?

Positieve controle 1

Wat controleer je precies?

Welk DNA gaat er in?

Welke enzymen doe je er bij?

Welke buffer gebruik je?

Positieve controle 2

Wat controleer je precies?

Welk DNA gaat er in?

Welke enzymen doe je er bij?

Welke buffer gebruik je?