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A partir das amostra 1, 2 (utilizada na urocultura) e 3 (utilizada na coprocultura), deu-se inicio às provas de enterobactérias.

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A tira de oxidase é uma ferramenta usada para detectar a enzima oxidase, que desempenha um papel essencial no metabolismo de oxigênio. O teste é valioso na identificação de grupos de bactérias e é especialmente útil para diferenciar entre as famílias Pseudomonadaceae (positivas para oxidase) e Enterobacteriaceae (negativas para oxidase).

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Primeiramente, a tira de oxidase foi retirada da embalagem, mantida à temperatura ambiente, conforme as instruções do fabricante. Em seguida, utilizando uma alça bacteriológica em um ambiente controlado próximo a chama, transferimos cerca de duas colônias da bactéria em análise para a área reagente da tira. Observamos a tira por aproximadamente 2 minutos, verificando se ocorreu uma mudança de cor.

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No caso apresentado na foto, o resultado foi negativo. De acordo com as instruções do fabricante, uma amostra positiva resultaria em uma coloração azul/violeta, indicando a presença da enzima oxidase. Essa mudança de cor ocorre devido à oxidação de um substrato na tira pela enzima.

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A semeadura de urina é uma prática bastante utilizada nas análises laboratoriais. Para uma urocultura eficiente, é necessário que a amostra esteja adequada para a análise, para isso, o paciente deve receber as devidas orientações para realizar a coleta de maneira correta.

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Instruções para coleta de urina masculina.

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Instruções para coleta de urina feminina.

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Todos os ensaios devem ser feitos com material previamente esterilizado e próximo a chama.

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A amostra de urina que foi utilizada nesta prática foi coletada no período da manhã por um dos estudantes. Para a semeadura, o método realizado foi o quantitativo, como descrito na imagem acima. Com o auxílio de uma alça de repicagem, uma parte da amostra é coletada e inoculada no ágar, inicialmente, uma linha é traçada ao centro da placa e em seguida as estrias são feitas contemplando todo o espaço. A amostra foi semeada em uma placa de ágar CLED e em outra contendo ágar MacConkey.

Por fim, as placas utilizadas foram incubadas na BOD em 35ºC.

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Utilizado para realizar a identificação bioquímica de bacilos Gram-negativos, oxidase-negativos e capazes de fermentar glicose. O processo envolve o cultivo das colônias a serem identificadas em cinco tubos contendo diferentes meios de cultura no conjunto. Após a incubação, procede-se à observação dos tubos e os dados resultantes são analisados por meio de uma tabela apropriada, permitindo, assim, a identificação da bactéria analisada.

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Meios com ágar CLED e McConkey (amostra 1) antes da incubação.

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Realização do teste: Kit enterobactérias

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Realização do teste: Kit enterobactérias

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Seguindo as recomendações do fabricante, utilizamos os tubos à temperatura ambiente. Com uma agulha bacteriológica flambada, coletamos uma colônia da amostra e a inoculamos no primeiro tubo. No primeiro tubo, introduzimos a agulha por picada central até o fundo e, ao retirá-la, realizamos estrias na superfície inclinada do meio de cultura. Fechamos o tubo com a tampa frouxa para proporcionar melhor aeração. Repetimos o processo inicial de flambagem e para os tubos 2 e 3, introduzindo a agulha por picada central até o fundo e em seguida fechamos bem os tubos. No tubo 4, após flambar a agulha, fizemos a coleta da colônia, e o semeamos, depois cobrimos com algumas gotas de vaselina para criar um ambiente anaeróbio antes de fechar o tubo. O tubo 5 foi inoculado de maneira semelhante ao primeiro, com exceção de que foi devidamente fechado. Por fim, os tubos contendo as bactérias foram incubados e os resultados são observados a seguir.

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Meios com ágar CLED e McConkey (amostra 2) antes da incubação.

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Sugere-se que a coleta deva ser realizada nos primeiros dias dos episódios de diarreia.

Além disso, estas devem ser coletadas em frasco limpo e seco.

Se necessário, as fezes podem ser armazenadas em recipiente adequado contendo conservantes.

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O meio de Rugai sem Sacarose, também conhecido como meio da Escola Paulista de Medicina (EPM) permite a execução simultânea de seis provas bioquímicas de identificação de enterobactérias: Desaminação do L-triptofano, Glicose, produção de Gás, produção de H2S e Hidrólise da uréia.

RESULTADOS

- Desaminação do L-Triptofano (TRI): prova positiva quando há desenvolvimento de coloração verde garrafa no ápice do tubo e a prova negativa se caracteriza pela manutenção da cor original do meio ou cor amarelada.

- Fermentação da glicose (GLI): o surgimento de cor amarela na porção inferior de meio, caracteriza prova positiva, do contrário, o meio mantém-se inalterado; esta prova deve ser obrigatoriamente positiva para todas as enterobactérias, devendo-se atentar para o fato de que, nos casos de bactérias que produzem H2S ou hidrolisam a uréia, a cor amarela é mascarada.

- Produção de gás a partir da glicose (GAS): caso a bactéria em estudo produza gás a partir da glicose, irão se formar bolhas no interior do meio, podendo em alguns casos o meio pode chegar a se partir e sofrer deslocamento.

- Produção de gás sulfídrico (H2S): a produção de gás sulfídrico é evidenciada pelo surgimento de coloração negra com intensidade variável na porção inferior de meio.

- Hidrólise da uréia: considera-se a prova positiva quando há a formação de uma coloração azulada na porção inferior de meio.

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A semeadura foi feita pela técnica de esgotamento.

Utilizou-se ágar Salmonella-Shigella (SS), ágar MacConkey (MC) e EMB (eosina-azul de metileno).

# data[].attributes.body
Inicialmente, as características macroscópicas das colônias foram observadas.
Ambas as amostras possuíam forma circular, elevação convexa e margem inteira.

# data[].attributes.body
Utilizou-se as colônias crescidas no ágar sangue (AS) para as provas de identificação de cocos gram-positivos.

# data[].attributes.body
Desaminação do L-triptofano (TRI)

Resultado A1: negativo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: negativo

Fermentação da glicose

Resultado A1: positivo

Resultado A2: inconclusivo

Resultado A3: inconclusivo

Produção de gás a partir da glicose

Resultado A1: positivo

Resultado A2: negativo

Resultado A3: positivo

Produção de H2S

Resultado A1: negativo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: positivo

Hidrólise de ureia

Resultado A1: negativo

Resultado A2: positivo

Resultado A3:negativo

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Meios com ágar CLED e McConkey (amostra 1) após incubação.

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Meios com ágar CLED e McConkey (amostra 2) após a incubação

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AMOSTRA 1:

CLED, MacConkey e EMB demonstraram resultados positivos para a fermentação de lactose.

Bacilo Gram-negativo.

CONCLUSÃO: Enterobactéria.

# data[].attributes.body
Para avaliar a morfologia das bactérias, fez-se a coloração de gram.

Para a fixação em lâmina, primeiro coletou-se aproximadamente 3 gotas de solução salina e depositou sobre a lâmina. Logo após, colônias isoladas foram coletadas e colocadas na lâmina sob a solução salina.

A solução e as colônias foram misturadas. A lâmina foi passada próxima a chama para secar e consequentemente, fixar o esfregaço.

# data[].attributes.body
Com as lâminas secas, deu-se início ao processo de coloração em si.

# data[].attributes.body
1. Com o esfregaço seco, cubra-o com cristal violeta e deixe agir por aproximadamente 15 segundos;

2. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente;

3. Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por cerca de 1 minuto;

4.  Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;

5.  Adicione álcool etílico sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;

6.  Lave em um filete de água corrente;

7.  Cubra a lâmina com fucsina e deixe agir por cerca de 30 segundos;

8.  Lave em um filete de água corrente;

9.  Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente com o auxílio de um papel de filtro limpo;

10.  Visualize no microscópio. Logo após leia em objetiva de imersão (100 X).

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As bactérias Gram-positivas retém o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptidoglicano em suas paredes celulares, por esse motivo apresentam-se na cor roxa.

Já as bactérias Gram-negativas possuem uma parede de peptidoglicano mais fina que não retém o cristal violeta, sendo assim, o corante fucsina consegue fixar-se fazendo com que as bactérias apresentem coloração rosa.

# data[].attributes.body
O meio LMI permite a execução simultânea de três provas bioquímicas de identificação de enterobactérias: descarboxilação da lisina, motilidade e indol.

Motilidade: A bactéria é móvel através do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram-negativos, poucas formas de cocos são móveis. A bactéria pode conter um ou muitos flagelos e sua localização varia com a espécie da bactéria e as condições de cultura.

Indol: Determinam a habilidade do micro-organismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano é um aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias resultando na produção de indol, após a adição do reagente de Kovacs.

Lisina: As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Essa reação, conhecida como descarboxilação, origina dióxido de carbono como produto secundário.

RESULTADOS:

- Prova da motilidade: a motilidade positiva é evidenciada pelo crescimento difuso à partir da linha de picada (o meio torna-se turvo).

- Prova da descarboxilação da lisina: desenvolvimento de coloração púrpura na base do meio caracteriza a reação positiva e a coloração amarelada caracteriza prova negativa (nas horas iniciais desenvolve-se uma coloração amarelada devido à presença de glicose no meio). A reação como ocorre em aerobiose, deve ser observada na base do tubo.

- Prova do indol: Pingar 3-4 gotas do reativo de Kovac’s na superfície do meio, o surgimento de coloração vermelha indica prova positiva.

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Antes de iniciar a coleta, sugere-se que o profissional explique ao paciente que ele sentirá um leve desconforto, caso não seja suportável, o paciente deverá informar ao profissional através do toque. Todavia, este procedimento é realizado de forma rápida.

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O procedimento de coleta de amostras da orofaringe começa com o paciente em posição confortável, com a cabeça levemente inclinada para trás, apoiada na parede. O paciente é instruído a abrir a boca amplamente, enquanto o profissional utiliza um abaixador de língua. Em seguida, o paciente é solicitado a pronunciar a letra "A" continuamente. O material é procurado nas áreas com hiperemia próximas aos pontos de supuração, e a amostra é coletada com um swab, pressionando e rolando-o precisamente na área inflamada, evitando tocar na língua ou na mucosa bucal para evitar contaminação.

# data[].attributes.body
Para a coleta de amostras da nasofaringe, assim como na coleta de amostras da orofaringe, o paciente deve ser informado sobre o possível desconforto que o procedimento irá causar.

# data[].attributes.body
A partir disso, deu-se início às provas para identificação de cocos Gram-positivos.

Começando pela prova da catalase, onde em uma lâmina adicionou-se 1 gota de peróxido de hidrogênio 3% junto com parte de uma das colônias isoladas da amostra 1 e 2.

p.s: para esse ensaio deve-se evitar o uso de colônias crescidas em ágar sangue, uma vez que este ágar pode acarretar um resultado falso-positivo.

# data[].attributes.body
Inicialmente, é solicitado ao paciente que limpe o excesso de secreção nasal com um lenço. Logo após, o paciente deve ser posicionado confortavelmente com a cabeça ligeiramente inclinada para trás, preferencialmente apoiada na parede. Em seguida, o swab é inserido no nariz paralelamente ao palato até atingir a nasofaringe, onde serão realizados movimentos giratórios com o swab.

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O método de semeadura por esgotamento, utilizado para análise qualitativa, envolve a aplicação de uma pequena quantidade do material (usando uma alça ou swab) no topo do meio de cultura. A amostra é então estriada em zigue-zague até antes do centro da placa, depois são feitas mais duas estrias com a mesma alça, com esterilização entre cada estria. Isso cria um gradiente decrescente de concentração do inóculo, permitindo o isolamento de diversas colônias, que normalmente são visíveis na última estria.

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• Característica: Pode apresentar meio com coloração verde-metalizada.

# data[].attributes.body
Nesta prática, foram utilizadas duas placas contendo Ágar MacConkey (MC) e duas com Ágar Sangue (AS).
Com o auxílio da alça de repicagem e próximo a chama da lamparina de vidro, foram inoculadas duas amostras (simulando ferida de pele) desconhecidas, a inoculação foi feita em ambos os ágares.
As placas foram incubadas em estufa a 35°C por 7 dias.

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Placas após semeadura antes da incubação

# data[].attributes.subject
Placas após semeadura antes da incubação

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Resultado da semeadura após 7 dias de incubação

# data[].attributes.subject
Resultado da semeadura após 7 dias de incubação

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Houve crescimento apenas nas placas de ágar sangue. Isso sugere que os microrganismos sejam Gram positivos, pois não conseguiram crescer no ágar MacConkey.

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AMOSTRA 2:

CLED, MacConkey e EMB demonstraram resultados negativos para a fermentação de lactose.

Bacilo Gram negativo.

Oxidase negativo.

# data[].attributes.body
Descarboxilação da lisina

Resultado A1: positivo

Resultado A2: negativo

Resultado A3: positivo

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• Característica: Colônias grandes (mucóides ou secas), achatadas, com bordas irregulares.

# data[].attributes.body
O resultado é imediato, portanto, constatou-se que as duas amostras foram positivas para catalase.

Tais resultados descartam a possibilidade de que esses cocos gram-positivos sejam Streptococcus spp., pois eles são catalase negativo.

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A amostra de fezes (amostra 3) mostrou-se positiva para Salmonella spp, pois houve crescimento de colônias (colônias escurecidas).

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Para identificação de Staphylococcus spp, deu-se seguimento com a prova da coagulase.

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A prova da coagulase também foi realizada para as duas amostras. Para esse método, coleta-se colônias isoladas e as adicionam em um tubo contendo coaguplasma. O tubo não deve ser agitado, e é levado para incubação a 35±2°C. Observa-se a formação de coagulo.

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O meio MIO permite a execução simultânea de três provas bioquímicas de identificação de enterobactérias: descarboxilação da ornitina, motilidade e indol.

Motilidade: A bactéria é móvel através do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram-negativos, poucas formas de cocos são móveis. A bactéria pode conter um ou muitos flagelos e sua localização varia com a espécie da bactéria e as condições de cultura.

Indol: Determinam a habilidade do micro-organismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano é um aminoácido que pode ser oxidado por certas bactérias resultando na produção de indol, após a adição do reagente de Kovacs.

Orinitina: As descarboxilases são um grupo de enzimas com substrato específico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminoácidos para formarem aminas alcalinas. Essa reação, conhecida como descarboxilação, origina dióxido de carbono como produto secundário. A citrulina é convertida em ornitina, que sofre descarboxilação para formar putrescina, verificando a capacidade do micro-organismo utilizar a enzima, auxiliando na identificação

RESULTADOS

- Prova da motilidade: a motilidade positiva é evidenciada pelo crescimento difuso a partir da linha de picada (o meio torna-se turvo).

- Prova da descarboxilação da ornitina: a leitura deve ser realizada da base do tubo. O desenvolvimento de coloração púrpura na base do meio caracteriza a reação positiva e a coloração amarelada caracteriza prova negativa. Nas horas iniciais desenvolve-se uma coloração amarelada devido à presença de glicose no meio. Recomenda-se desconsiderar a cor do terço superior do tubo que está em contato com o ar.

- Prova do indol: Pingar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs na superfície do meio, o surgimento de coloração vermelha ou rósea indica prova positiva.

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• Característica: colônias mucóides.

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Após incubação, observou-se que pelo fato do plasma utilizado estar vencido, o teste da coagulase não funcionou.

Caso funcionasse, constataríamos que a amostra 1 seria positiva e a amostra 2 negativa para coagulase.

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O ensaio de fermentação do manitol também foi realizado.

As amostras 1 e 2 foram semeadas em ágar sal-manitol, que consegue inibir o crescimento de diversos microrganismos e permite o isolamento seletivo dos Staphylococcus.

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Placas antes da incubação.

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A partir dos resultados explícitos na imagem acima, nota-se que na amostra 1 ocorreu a mudança de cor do meio de rosa para amarelo, indicando um resultado positivo. Já na amostra 2, a cor do meio permaneceu inalterada, o que confirma um resultado negativo.

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Isso ajuda a concluir que a amostra 1 é Staphylococcus aureus.

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Sem o diagnóstico da amostra 2, prosseguiu-se com o ensaio de sensibilidade à Novobiocina, uma vez que os Staphylococcus coagulase negativa se dividem entre resistentes e sensíveis à Novobiocina.

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Inicialmente, preparou-se uma solução de microrganismos em caldo de cultura, de modo a obter uma suspensão com turbidez equivalente ao padrão 0,5 de MacFarland.

Com o auxílio de um swab estéril a suspensão bacteriana foi semeada sobre a placa de ágar sangue. Em seguida, um disco de Novobiocina foi posicionado sobre a área semeada.

A placa foi incubada em uma estufa a uma temperatura de 35-37°C por um período de 18 a 24 horas.

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Resultado do teste de sensibilidade à Novobiocina

# data[].attributes.subject
Resultado do teste de sensibilidade à Novobiocina

# data[].attributes.body
Halo de inibição de 60mm, demonstrando sensibilidade à Novobiocina.

Esse resultado indica que esta bactéria pode ser S. epidermidis, S. haemolyticus ou outro Staphylococcus coagulase negativa.

# data[].attributes.body
Descarboxilação da ornitina

Resultado A1: positivo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: positivo

Motilidade

Resultado A1: positivo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: positivo

Indol

Resultado A1: positivo

Resultado A2: negativo

Resultado A3: negativo

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• Característica: Cresce em ondas.

# data[].attributes.body
AMOSTRA 1:

Morfologia: Colônias pequenas, de forma circular, convexas e margem inteira. Cocos gram-positivos.

Sem crescimento em ágar MacConkey.

Crescimento em ágar sangue.

Catalase positivo.

Coagulase positivo.

Com fermentação de manitol.

CONCLUSÃO: Staphylococcus aureus.

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O método de confirmação com o caldo Ramnose está relacionado à capacidade da ordem Enterobacteriales e da Listeria monocytogenes de fermentar Ramnose. A fermentação do caldo ramnose é revelada por uma mudança de cor do roxo para o amarelo (acidificação), devido à presença de um indicador de cor, caldo púrpura de bromocresol. Esses microrganismos são diferenciadas principalmente através da fermentação de carboidratos tais como ramnose, xilose, manitol

RESULTADOS

- Positivo: Desenvolvimento de uma coloração amarela com turvação do meio.

- Negativo: O meio mantém sua coloração original e com ou sem crescimento (turvação).

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AMOSTRA 2:

Morfologia: Colônias pequenas, de forma circular, convexas e margem inteira. Cocos gram-positivos.

Sem crescimento em ágar MacConkey.

Crescimento em ágar sangue.

Catalase positivo.

Coagulase negativo.

Sem fermentação de manitol.

Sensível à Novobiocina.

CONCLUSÃO: S. epidermidis, S. haemolyticus ou outro Staphylococcus coagulase negativa.

# data[].attributes.body
Fermentação da rhamnose

Resultado A1: positivo

Resultado A2: negativo

Resultado A3: positivo

# data[].attributes.body
Algumas bactérias utilizam o citrato como única fonte de carbono. O Citrato de Simmons Ágar permite avaliar a utilização do citrato pela bactéria em análise através de seu crescimento ou através da alcalinização do meio (mudança da coloração esverdeada original para azulada).

. RESULTADOS

O crescimento na superfície do meio e/ou a mudança de cor do meio de verde para azul, caracterizam a positividade da prova. Observação: O excesso de inóculo pode ocasionar um ligeiro crescimento na superfície do meio quando se trata de bactéria citrato negativa, caracterizando assim falsa positividade.

# data[].attributes.body
Consumo de citrato

Resultado A1: negativo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: positivo

# data[].attributes.body
Iniciamos o procedimento flambando a agulha bacteriológica. Em seguida, coletamos uma colônia da amostra e inserimos a agulha através de uma picada central até atingir o fundo do tubo. Ao retirá-la, procedemos com estrias na superfície inclinada. Por fim, incubar com entre 35-37 °C, com a tampa frouxa.

Após a incubação, colocamos aproximadamente 4 a 5 gotas de cloreto férrico a 10% no tubo, assegurando que este entre em contato com a maior extensão possível da superfície. Concluímos o procedimento ao observar as possíveis alterações na coloração.

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É um meio utilizado para diferenciação de bacilos entéricos quanto à capacidade de produzir ácido fenilpirúvico a partir da desaminação da fenilalanina por ação enzimática. O meio é incolor e se os bacilos entéricos forem FA positivos, o meio apresentará uma coloração esverdeada na superfície após a adição do cloreto férrico

# data[].attributes.body
Desaminação de fenilalanina

Resultado A1: negativo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: negativo

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Para realizar o teste de Vermelho de Metila e de Voges-Proskauer (VM/VP), é essencial começar flambando a alça bacteriológica. A seguir, coletamos uma colônia da amostra a ser testada e dissolvemos a mesma no tubo VM/VP. Posteriormente, fechamos o tubo e procedemos à incubação a uma temperatura entre 35-37 °C. Após esse período, observamos a mudança de coloração.

# data[].attributes.body
Caldo Vermelho de Metila (VM): teste para identificar espécies bacterianas fortes fermentadoras, a partir da glicose. O meio tem a cor inicial amarelo, se a bactéria for uma forte produtora de ácidos ficará vermelho, em função da presença do indicador de pH vermelho de metila. O ponto de viragem deste meio é o pH 4,4.

Prova de Voges-Proskauer: A finalidade do Teste de Voges-Proskauer com Alfa-Naftol é determinar a capacidade das bactérias na produção de não-ácidos a partir de materiais orgânicos que resultam na fermentação da glicose. O Alfa-Naftol é a solução utilizada para a realização do Teste de Voges-Proskauer (VP), um procedimento em bacteriologia que consiste na fermentação de bactérias pela via butilenoglicólica. O Alfa-Naftol tem a finalidade de fermentar  glicose para que ocorra a produção de acetoína, um líquido incolor com cheiro amanteigado. Durante a realização do teste, a adição do Alfa-Naftol provoca a catálise indicando um anel na cor vermelho, enquanto que a cor amarelo indica o resultado negativo.

# data[].attributes.body
Vermelho de metila

Resultado A1: positivo

Resultado A2: positivo

Resultado A3: positivo

Voges-Proskauer

Resultado A1: negativo

Resultado A2: negativo

Resultado A3: negativo