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Video de Youtube en el cual podras entender un poco mejor del tema:

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Video de Youtube en el cual podras entender un poco mejor del tema:

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https://youtu.be/mslMRgxbdOA
https://youtu.be/4YvbfiBcYQU

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Por lo general, el proceso de PCR funciona mejor cuando los cebadores están a distancias cortas entre si (de 100 a 500 pb), pero las reacciones bien optimizadas tienen éxito a distancias de decenas de kilobases.

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Tanto con cebado aleatorio, como con cebadores de la PCR para dirigir la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN [transcriptasa inversa] permite que las plantillas de ARN se conviertan en ADNc y luego se someta a PCR regular, en una variación conocida como PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se utiliza el término PCR para referirse tanto a PCR como a RT-PCR.

La detección de productos de PCR se puede realizar de varias formas. Las "técnicas de punto final" posteriores a la reacción incluyen electroforesis en gel y tinción con colorante especifico de ADN.

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(FRET) Transferencia de Energia Resonante de Flouresencia

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(FRET) Transferencia de Energia Resonante de Flouresencia

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Este método puede diseñarse de manera que la aparición de FRET pueda utilizarse para controlar la producción de amplicones específicos de secuencia. Las aplicaciones del proceso de PCR son increíblemente diversas. La simple aparición o no aparición de un amplicón en un reacción controlada, puede tomarse como evidencia de la presencia o ausencia, respectivamente, de la plantilla diana del ensayo.

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(FRET) Transferencia de Energia Resonante de Flouresencia

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(FRET) Transferencia de Energia Resonante de Flouresencia

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Este método puede diseñarse de manera que la aparición de FRET pueda utilizarse para controlar la producción de amplicones específicos de secuencia. Las aplicaciones del proceso de PCR son increíblemente diversas. La simple aparición o no aparición de un amplicón en un reacción controlada, puede tomarse como evidencia de la presencia o ausencia, respectivamente, de la plantilla diana del ensayo.

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(FRET) Transferencia de Energia Resonante de Flouresencia

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(FRET) Transferencia de Energia Resonante de Flouresencia

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Este método puede diseñarse de manera que la aparición de FRET pueda utilizarse para controlar la producción de amplicones específicos de secuencia. Las aplicaciones del proceso de PCR son increíblemente diversas. La simple aparición o no aparición de un amplicón en un reacción controlada, puede tomarse como evidencia de la presencia o ausencia, respectivamente, de la plantilla diana del ensayo.

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Junto con la sensibilidad de una sola molécula, esto ha proporcionó al forense criminal herramientas lo suficientemente poderosas para identificar

individuos a partir de ADN residual en evidencia de la escena del crimen tan pequeña como colillas de cigarrillos, manchas de huellas dactilares  o un solo cabello. Los biólogos evolutivos han hecho uso de la PCR para amplificar el ADN de muestras bien conservadas, como insectos encerrados en ámbar de millones de años, con secuenciación posterior y análisis filogenético, arrojando resultados fascinantes sobre la continuidad y evolución de la vida en Tierra.

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La PCR multiplex combina multiples reacciones de PCR independientes en una sola reaccion, permitiendonos que un experimento consulte una muestra diminuta para la presencia, ausencia o posiblemente la cantidad de multiples secuencias no relacionadas.

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La PCR simplex es la que se a descrito hasta ahora, ya que esta restringido a la amplificacion de una sola diana por reaccion.

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Es particularmente útil en

aplicaciones forenses y situaciones de diagnóstico médico, pero implica niveles de complejidad que aumentan rápidamente para garantizar que múltiples conjuntos de cebadores no tengan interacciones no deseadas que conduzcan a

productos falsos no deseados. En el mejor de los casos, la multiplexación tiende a resultar en pérdida de cierta sensibilidad para cada PCR individual debido a la competencia efectiva entre ellas por la polimerasa y los nucleótidos limitados.

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Esta técnica ha sido empleada exitosamente para el descubrimiento de nuevas especies de virus, cuando se emplean cebadores que coinciden con una especie de virus similar. Del mismo modo, durante un clonación dirigida por PCR de un gen o región de interés, se planifico desajustes en la secuencia del cebador y los T s ligeramente reducidos pueden ser utilizado para introducir mutaciones deseadas en un proceso llamado "mutagénesis dirigida al sitio".

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El instrumento en tiempo real monitorea la fluorescencia en cada tubo de reacción durante estos pasos térmicos de cada ciclo y calcula el cambio de fluorescencia por ciclo para generar una curva de amplificación sigmoidea.
Un problema potencial con este enfoque es que los tintes indicadores no son específicos de secuencia, por lo que cualquier producto espurio producido por la reacción puede dar lugar a señales positivas falsas

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El método más simple para la detección de PCR en tiempo real es basado en el uso de tintes que se unen selectivamente y se vuelven fluorescente en presencia de ADN de doble hebra, como SYBR green.

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Si se permite que la extensión de la polimerasa proceda durante un corto período de tiempo (1 minuto por cada 1000 pares de bases), cada uno de los cebadores se extenderá más allá de la ubicación del otro, creando así un sitio de apareammiento complementario para el cebador opuesto.

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El truco de la PCR surge de incorporar simultáneamente un segundo cebador cercano de polaridad opuesta (es decir, complementario a

la hebra opuesta a la que se híbrida el primer cebador) y luego someter la mezcla de plantilla, a dos cebadores en altas concentraciones, la ADN polimerasa termoestable y dNTP que contiene tampón de polimerasa, a ciclos repetidos de desnaturalización termica, hibridación y extensión del cebador.

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Cuando se enfría rápidamente el ADN y se hay un exceso de cebadores, el cebador se híbrida con cualquier región de secuencia complementaria del plantilla.
Esto nos proporciona un sustrato donde la polimerasa actuara y  extenderá el cebador, creando una copia complementaria de una hebra molde o plantilla aguas abajo del cebador

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RT-PCR utiliza la transcriptasa inversa para convertir ARN en ADN para usar en una reacción en cadena de la polimerasa.

La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o en tiempo real detecta los productos de la amplificación por PCR durante su síntesis, y es más sensible y cuantitativa que PCR convencional.

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Desnaturalizacion y separacion de la hebra de interes

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Desnaturalizacion y separacion de la hebra de interes

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Se calienta la secuencia de interés o el objetivo bicatenario (conocida como la "molécula plantilla" o simplemente

"Plantilla") alrededor de 100 ° C en un tampón apropiado, causando la desnaturalización térmica a medida que las hebras de la plantilla se derriten.

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Es una tecnica modificada ya que es una combinacion de PCR y espectrofotometro

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1000 pares de bases por 1 minuto

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Entra el ADN polimerasa y comienza a construir la nueva copia de DNA

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Señala la secuencia que se requiere, para esto se ocupan 2 cebadores:
ADN polimerasa termoestable y dNTP el cual proporciona un grupo hidroxilo

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Se rompen los puentes de hidrogeno y se obtienen 2 hebras. La temperatura necesaria es de 94-98°C

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PCR (Reaccion en cadena de la polimerasa)

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PCR (Reaccion en cadena de la polimerasa)

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tecnica de amplificacion de DNA. En 1983, Kary Mul

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utiliza transcriptasa inversa para convertir ARN en ADN para usar una reacción en cadena de la polimerasa