# data[].attributes.body
Noteer hier instellingen voor te gebruiken apparatuur

PCR: noteer het programma

Agarose gelelectroforese: noteer het voltage dat je wilt gebruiken, hoelang je schat dat het duurt en hoe ver de loading dye gerund moet zijn voor je stopt (is de gele, paarse of blauwe band onderaan de gel)

Tip: een 1,5% gel runt langzamer dan een 0,7% gel. Hoe hoger het voltage, hoe sneller de gel runt, maar ook hoe slechter de bandjes gescheiden worden.

PCR programma:
....................................................................

Agarose gel instellingen:
15min op 50V en 45min op 75V(of langer als nodig)

# data[].attributes.body
Vul hier het pipetteerschema voor een 1,5% agarosegel in

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

Agarose                            0,75   g (0,015 * 50= 0,75 g)
TAE                                    50   ml (aanvullen tot 50 ml)
eindvolume                       50   ml

ul DNA dye toevoegen 10 ul DNA en 2 ul dye

# data[].attributes.headline
11 Pipetteerschema monsters bereiden uit mastermix

# data[].attributes.subject
11 Pipetteerschema monsters bereiden uit mastermix

# data[].attributes.body
Noteer hier hoe je het DNA verdunt voor het experiment en hoe je individuele monsters bereidt uit de mastermix

De precieze concentratie van gekocht DNA weet je niet. Noteer dus echt de berekening in het labjournaal zodat je het op het lab kan overdoen met de concentratie die op het epje staat.

In de voorbeeldberekening is uitgegaan van een DNA concentratie van 34 ng/ul.

De concentratie humaan DNA is waarschijnlijk ongeveer 100-200 ng/ul. Het kan dus dat je het nog moet verdunnen voor je het kan gebruiken.

ul mastermix             ul DNA
...                                   ...

Berekening: ...

# data[].attributes.body
Noteer hier het pipetteerschema voorhet toevoegen van loading dye aan de DNA monsters voor je ze op gel zet

Loading dye heeft een concentratie van 6x. Je wilt een eindconcentratie van 1x en een eindvolume van 12 ul.

loading dye 2 ul
DNA 10ul
eindvolume 12 ul

# data[].attributes.attachment_caption
Pipetteerschema voor 1 reactie is ingevuld, vul zelf het pipetteerschema in voor hoeveel reacties je nodig hebt.

# data[].attributes.body
Noteer hier pipetteerschema's voor de mastermix

In het voorbeeldpipetteerschema is DNA grijs doorgestreept. Dit wordt wel genoteerd omdat je de hoeveelheid ul DNA nodig hebt om het aantal ul demiwater te berekenen, maar bij het bereiden van de mastermix voeg je het DNA nog niet toe.

Inhoud                     1 reactie (ul)         _6_ reacties (ul)
template DNA
demiwater
PCR buffer
BSA
dNTPs
primer F
primer R
taq polymerase

# data[].attributes.attachment_caption
In deze opzet staat waar welke info uit de padlet in het labjournaal gezet kan worden

# data[].attributes.attachment_caption
Voorbeeld van hoe je een planning kan noteren. Deze kan je op een los papier mee zodat je kan afvinken

# data[].attributes.body
Bedenk dat het PCR-programma veel cycli heeft, bereken hoe lang het duurt voordat het hele programma afgerond is. Reken daar nog 20% tijd bij omdat het apparaat tussen elke stap moet opwarmen of afkoelen

Bedenk dat runnen van gel elektroforese ook tijd kost, langer dan de vorige weken wanneer je een hoger % agarosegel gebruikt. Beschrijf welke kleur uit de loading dye hoe ver gerund moet zijn wanneer je de gel wilt stoppen

Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:

Materialen verzamelen

Gelplek inrichten

Epjes beschrijven

agarosegel oplossing maken

agarosegel gieten

agarosegel laten stollen

PCR runnen (... tijd)

Loading dye toevoegen aan DNA monsters

DNA monsters in de gel doen

Gel runnen (stroom erop zetten)

Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen

Opruimen

# data[].attributes.attachment_caption
Tabel voor monsters en verwacht resultaat

# data[].attributes.body
Bij elk experiment heb je analysemonsters en zijn er controles nodig om te weten of de data van het analysemonster betrouwbaar is. Beschrijf hier welke monsters je wilt maken.
Beschrijf per controle:

wat je controleert

Welk DNA wel of niet in het monster moet

Welke primers er wel of niet in het monster moeten

Hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt

wel / geen bandje

controle             dna                        primer            wat

analysem: onbekend dna:         35s F en R:           bevat DNA 35s promotor?
- contr 1: dna zonder promotor: 35s f en r   is matermix vervuild?
- contr 2:     geen dna:               35s F en R:      kunnen de primers niet altijd binden?
+ contr:        35s dna:                  geen primer        kan mastermix product geven:

# data[].attributes.body
Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan

# data[].attributes.body
Detectie van 35S promotor in plasmide

Eerder ben je begonnen met het aantonen van de 35S promotor op een plasmide door plasmides te isoleren uit bacteriën. Deze week ga je in het plasmide aan- of afwezigheid van de 35S promoter aan te tonen door middel van een polymerase chain reaction (PCR), dit mag (maar hoeft niet) in duplo. Je voorspelt je resultaat digitaal in BLAST om je verwachting te onderbouwen. Analyseer het resultaat op agarosegel.

De genetische sequentie die aantoont 35S aanwezig is, is de 35S promoter, die is afkomstig van cauliflower mosaic virus (CMV). BLAST zal dus veel CMV 'hits' geven. De NVWA (Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit) gebruikt 35S PCR ook om aanwezigheid van genetisch gemodificeerde gewassen met 35S promoter in voedingsmiddelen aan te tonen, zoals bijvoorbeeld genetisch gemodificeerde mais in doritos. Vergeet niet het experiment in silico uit te voeren zodat je de resultaten goed kan interpreteren.

Op het lab is aanwezig: het pBINplusCas935S plasmide DNA dat je zelf hebt geïsoleerd uit bacteriën, 35s controle plasmide, controle DNA dat geen 35S bevat, 35S primers en alle materialen voor PCR.

Tips voor uitvoering:

De gebruikte GGO-promoter is afkomstig van cauliflower mosaic virus (CMV)

GGO-mais primers herkennen CMV-DNA, dit is het GGO-stukje in de gebruikte plasmide

Analyse van het PCR-resultaat: je gaat kleine fragmenten analyseren. Hiervoor is het beter om een hoger percentage agarose te gebruiken. Maak een 1.5% agarosegel en run 15 minuten op 50 V en de rest van de tijd op 75 V.

Bij PCR gebruik je een mastermix. Dit lijkt erg op de reactiemix voor restrictie. Het is een oplossing waarin al je materialen aanwezig zijn behalve het te gebruiken DNA.

De optimale Tm voor de 35S primers is 56.5 oC. Dit is lager dan je zou verwachten als je het zelf berekent, maar het werkt het beste, dus stel deze temperatuur in voor de hybridisatie-stap.

# data[].attributes.body
Je gaat deze week verder met DNA dat je in week 2 geïsoleerd hebt.

Werk samen voor de voorbereiding, anders is het misschien te veel.

# data[].attributes.body
Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier.

1:
2:
3:
4:
5:
6:
7:
8:
9:
10:
11:
12:
13:
14:
15:

# data[].attributes.body
Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren

Noteer goed:

Welk DNA heb je geïsoleerd / ga je gebruiken?

Wat voor DNA is beschikbaar voor controles?

Welke primers ga je gebruiken?

Materiaal, concentratie, bewaarinstructie, fabrikant
template dna
-analysemonster dna
-controle dna (+): 35s DNA (17ng/ul)
-controle dna (-): DNA dat geen 35s promotor bevat
primers
-primer F
-primer R
-precieze primers
taq buffer
taq polymerase
dNTPs
PCR-epjes
PCR-apparaat
ijshoed met ijs

TAE (10x)
sybrsafe
filtreerpapier
agarose
loading dye (6x)
DNA ladder
DNA monsters
lichtbak
demiwater

# data[].attributes.body
Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften.

Deze week ga je een PCR uitvoeren, het product daarvan op agarosegel analyseren en het resultaat digitaal voorspellen:

K (primer BLAST; verwachting opstellen voor een PCR experiment)

L (PCR (Polymerase Chain Reaction))

A2 (agarosegelelektroforese)

# data[].attributes.attachment_caption
Je kan de vewrachting noteren in een tabel met daaronder een printscreen van BLAST, dit is minder schrijfwerk dan hele lappen tekst.

# data[].attributes.body
Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment
Het kan handig zijn verwachtingen van controles pas te noteren wanneer je de controles bedacht hebt..

Onderbouw je verwachting met prinscreen-plaatjes van de BLAST resultaten (in silico-versie van het experiment). Omdat de 35S promoter uit het cauliflower mosaic virus afkomstig is kan het handig zijn dit als organisme in te stellen blij BLAST.

...
...
...

# data[].attributes.body
Wat is het doel van het experiment?

Het doel van dit experiment is het aantonen van de 35S promotor op een plasmide uit een bacterie dmv PCR.

...

# data[].attributes.body
Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?

Wat doet PCR?

Welke fases zijn er en wat gebeurt er dan in het monster?

Waarom kan je met PCR aantonen of het plasmide wel of niet 35S bevat?

...