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solution 1(S1)
S1 용액은 plasmid DNA를 분리하기 위하여, 원심분리에 의해 얻은 세균 pellet을 다시 풀어주는(Resuspension)것에 사용되는 용액임

RNase A : plasmid DNA 분리과정에서 세균의 DNA를 제거하기 위하여 S1용액에 혼합하여 사용

S2
1)NaOH : 용액을 높은 pH의 alkaline 상태를 만들어주어, plasmid DNA와 genomic DNA를 모두 변성시킴

2)SDS(sodium Dodecyl Sulfate) : 계면활성제 역활로, 세포막의 phodpholipid(인지질)를 녹이고 세포 단백질을 변성시켜, 제거할 수 있도록 해줌으로 순도 높은 plasmid DNA를 분리할 수 있게 해줌

S3
S2까지 넣어서 pH가 높아진 용해된 대장균 세포(Lysate)의 pH를 중성으로 낮춰주어, plasmid DNA와 genomic DNA가 모두 renaturation 됨 하지만 plasmid DNA는 작은 크기의 환상형 DNA (closed circular DNA)로 정확하게 renaturation되어 Lysate의 용액에 녹아져 있지만 genomic DNA는 renaturation 과정에서 변성되었던 두 가닥의 random association 때문에 SDS에 의해서 변성된 단백질과 함께 침전됨 SDS는 S3의 주성분인 Potassium aetate와 반응하여 비용해성의 Potassium dodecyle sulfate(KDS)를 형성 S3를 넣은 후 하얀색 침전물이 생기는 이유도 이것때문임

Resuspension
: 원심분리기를 사용하여 세포를 튜브의 바닥에 침전을 유도하고 수용액을 버리고나면 세포만 남게 되는데, 이 세포를 다시 다른 수용액 (medium, media라고 부름)에 넣고 흔들면 (또는 특정 기구를 사용하여 떼주면) 세포들이 다시 섞이게 되는 것을 ( 세포를 서로 붙어있지 않은 자유상태로 만들어주는것을) 말한다.

genomic DNA
:어떤 생물종의 세포 소기관을 제외한 핵에 존재하는 전체 DNA를 말한다.

renaturation: 분리된 DNA가 다시 원래의 상태로 돌아가는 현상으로 온도,시간, dna의 농도가 이에 영향을 주는 요인이다.

Potassium aetate: 아세트산 칼륨

KDS(Potassium dodecyle sulfate):

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https://blog.naver.com/nanohelix/70182013046(용액 정리)

https://m.blog.naver.com/PostView.naver?blogId=nanohelix&logNo=70180385720&proxyReferer=(왜 플라스미드를 추출하는가, 활용방안)

https://ryangju.tistory.com/34(밑에 내용 일부 ppt 참고 가능)

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나노헬릭스, Reliable Partner for DNA Technology : 네이버 블로그

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박시은

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플라스미드_동아리 계획서

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정의: 원심력을 이용하여 성분이나 비중이 다른 물질들을 분리·정제·농축하는 기계.

원심분리기는 원심력을 이용하여 균질액을 여러 부분으로 나눌 목적으로 가장 많이 이용되는 기계로서, 균질액을 시험관에 넣고 원심분리기를 고속으로 회전시키면 입자의 크기와 밀도에 따라 물질을 분리할 수 있다.

원심분리기의 성능은 중력에 대하여 몇 배의 원심력이 생기는가에 따라 결정되며, 이를 원심 효과라고 한다. 원심 효과는 원심분리기의 반지름과 회전 속도에 의하여 정해진다. 회전 속도는 보통 매분 1,000회전부터 수만 회전의 것까지 있으며, 회전 속도에 따라 다음과 같이 세 종류가 있다.

-저속 원심분리기(탁상용 원심분리기) : 6,000rpm(6,000g) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심분리에 이용된다.

-고속 원심분리기(우리가 사용할 원심분리기): 최고속도가 20,000~25,000rpm(60,000g)으로 냉각장치를 갖추고 있다. 주로 세포, 핵, 세포내 소기관 등의 분리에 이용된다.

-초원심분리기: 최대속도가 40,000~80,000rpm(600,000g)으로 냉각기와 진공장치를 갖추고 있으며, 세포내 소기관, 세포막 구성성분, 거대분자 등을 분리할 수 있다.

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DNA 전기영동

DNA는 음(-)전하를 띠므로 전기장에 위치시키면 (+)극으로 이동한다. 또한, 아가로스를 물에 넣고 가열 후 식히면 중합되어 겔 형태가 된다. 아가로스 겔에 DNA를 떨어뜨린 다음 전해질이 들어있는 장치에 넣고 전기장을 걸어 주면 DNA는 겔 사이를 이동하며 (+)극으로 이동한다.

즉, 전하 또는 크기가 다른 분자들이 서로 다른 속도로 이동하는 것을 이용하여 DNA를 분리하는 방법을 DNA 전기영동이라고 한다.

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DNA, RNA, 단백질 등의 거대분자를 크기 및 전하량에 따라 분리하는 방법이다. 이 방법을 사용하여 제한효소에 의하여 절단된 DNA 조각들을 분리하고 분석할 수 있다. 핵산(nucleic acid)은 인산기에 의해 음전하를 띠기 때문에, 전류가 흘러 전기장이 형성되면 양극을 향해 겔 내를 이동한다. 다당류인 아가로스(agarose)의 중합체로 이루어진 겔을 통과할 때, 각 분자는 전하량과 크기 및 모양에 따라 다른 속도로 이동하게 되는데, DNA의 길이가 길어질수록 저항을 많이 받게 된다. 이 원리를 고려하여 실험을 진행한다.

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플라스미드(Plasmid)란 원핵생물의 염색체 DNA 이외에 자가복제능력을 가지는 DNA 환상(circular)분자이다 . 세균의 세포 내에 있는 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소로 끊은 뒤 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자 재조합 기술을 사용한다. 플라스미드에는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자(R인자), 세균의 자웅을 결정하는 성결정인자(F인자) 등이 발견되고 있다. 세균의 생존에 플라스미드의 존재가 필수적인 것이 아니며, 또 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달된다. 플라스미드는 숙주인 세포에 유전적 다양성을 증가시킬 수 있다. R인자라 불리는 플라스미드는 숙주세포가 항생물질과 독성물질에 저항성을 갖도록 한다. 병원성 세균의 R인자는 접합성 전달에 의해 빠르게 전파되므로 다양한 항생물질과 화학요법제에 의하여 한 때 방제할 수 있었던 많은 병원성 세균들이 이들에 대해 높은 저항성을 나타내는 경우가 빈번히 발견된다. 많은 세균균주는 플라스미드에 의해 암호화된 박테리오신(bacteriocin)이라는 단백질성 독소를 방출하는데, 이것은 그 세균과 매우 밀접하게 관련된 세균의 균주에 대해서만 활성을 갖는다. E.coli(대장균) 균주에 의해서 분비되는 이런 형태의 독소를 클리신이라 부른다. 플라스미드에 의해 암호화되어 있다고 알려진 기능은 다음과 같다.

모든 플라스미드에 의한 기능: 자기복제

일부 플라스미드에 의한 기능: 1. 자기전달, 2. 항균물질에 대한 저항성 – (a. 항생물질, b. 합성화학요법계, c. 중금속) / 3~10: 색소 생산, 독소 생산, 대사기능(: 젖당, 옥탄분해), 파아지 감수성 및 저항성, 항생물질 생산, 박테리오신 생산, 식물 종양의 유도, H2S 생산.

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제한효소는 이중가닥 DNA 분자의 특정한 염기서열을 인식하여 그 부분이나 그 주변을 절단하는 것을 촉매하는 효소이다. 세균이 바이러스의 침입으로부터 자신을 방어할 때 이용되며, 유전자 지도작성이나 형질전환 동식물 개발 등 다양한 생명공학기술에 이용된다. 제한효소가 인식하는 부위는 회문구조라는 특수한 구조를 가진다. 제한효소는 숙주 DNA와는 다른 특징을 갖는 바이러스 DNA를 선택적으로 인지하여 이들을 잘라낸다. 제한효소 절단 부위는 4~8개의 뉴클레오티드로 이루어져 있다. 이들은 주로 앞뒤 역순상 동일한 서열을 나타내는 형태(palindromic)로 존재한다. 제한효소의 종류에 따라 잘리는 형태가 달라진다. 제한효소에 의해 잘려진 DNA의 말단이 5’ 혹은 3’ 말단이 돌출되어 서로 다른 길이로 존재할 경우 돌출된 말단을 접착 말단(sticky end)이라 한다. 이와는 다르게 제한효소의 작용으로 잘려진 DNA의 말단이 같은 길이일 경우 각 말단을 평활말단(blunt end)이라 한다. 이번 실험에서 이용할 제한효소는 EcoRI 제한효소이다. 이 제한효소를 이용하여 open circular, supercoiled 형태의 DNA를 linear 형태로 만들 수 있다.

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플라스미드와 숙주세포의 염색체 DNA

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플라스미드와 숙주세포의 염색체 DNA는 G+C(구아닌+시토신)의 양, 즉 DNA의 밀도가 종종 다름으로 인하여 세포추출물의 DNA 부분을 cybergreen 염색약 첨가조건에서 염화세슘(CsCl)의 밀도 기울기로 초원심분리하여 정제할 수 있다. 즉, 염화세슘-DNA 혼합물에 특정염로인 cybergreen을 첨가하여 두 DNA 밀도의 차이를 확대할 수 있는 것이다. cybergreen 염료는 DNA 분자의 핵에 있는 염기쌍 층 사이로 끼어들어 DNA 나선을 살짝 풀어 밀도를 감소시킨다. DNA가 폐쇄된 분자라면 삽입되는 cybergreen 분자의 수가 증가함에 따라 압력이 증가하여 양성의 초나선형(Supercoli) 회전이 생기고 그 이상의 염료가 결합하는 것을 방해한다. 그러나 선상 DNA 분자는 삽입에 반응하여 자유로이 회전할 수 있어서 압력이 감소되므로 그러한 제한이 적용되지 않는다. 결과적으로, 선상 DNA에는 환상 DNA보다 cybergreen이 훨씬 더 많이 삽입되어 밀도가 크게 감소한다. Cybergreen의 존재 하에서 밀도 기울기 초원심분리를 이용하여 염색체 DNA로부터 플라스미드를 분리하는 것은 세포로부터 추출하는 동안 선상으로 조각난 염색체 DNA와 환상으로 남아있는 플라스미드 DNA에 달려있다. 세포를 파괴하고 추출하는 과정에서 큰 조각의 염색체는 절단에 의해 필연적으로 깨지기 쉽지만 더 작은 플라스미드는 깨지지 않으므로 절단력을 최소로 하는 적절한 예방책을 세우면 플라스미드를 완전하게 추출할 수 있다. 플라스미드 DNA의 가닥에 파열이나 틈이 생기면 자유로이 회전하여 초나선형이 파괴된다. 이 결과로 생긴 열린 환상(open circle)구조에는 선상조각만큼 cybergreen이 많이 삽입되므로 그런 구조는 cybergreen을 함유하는 염화세슘의 밀도기울기로 초원심분리하는 동안 염색체 DNA와 함께 이동한다.

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2023학년도 메타볼리즘 실험탐구 활동 계획(양식)

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실험 계획서(미생물의 플라스미드 DNA 관찰과 이해)

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실험 계획서(미생물의 플라스미드 DNA 관찰과 이해)

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미생물의 플라스미드 DNA 관찰과 이해(박시은,김태원,황서윤,신예빈)