# data[].attributes.body
Katherin Ibeth Villa Mejia
20181007453

# data[].attributes.attachment_caption
González, R. M. (2020, 1 abril). PCR: qué es y qué aplicaciones tiene - El blog de. Genotipia. Recuperado 22 de febrero de 2022, de https://genotipia.com/pcr/

# data[].attributes.body
Se trata de una variante de la PCR básica que utiliza dos pares de cebadores. En un primer paso, se realiza la amplificación de una región del genoma, para después concretar más la región mediante una segunda amplificación más específica. Esta PCR se utiliza para amplificar fragmentos muy específicos del genoma

# data[].attributes.body
-  Búfer de ampliación
- Mezcla de dNTP
-Cebadores oligonucleótidos
-ADN polimerasa termoestable
-H2O
-Plantilla de ADN

# data[].attributes.body
Bacterias: Examen directo de sangre
Cebadores: Para detectar herpesvirus
Virus: Detección de VPH
Hongos: Pacientes con SIDA, utilizndo muestras de médula ósea

# data[].attributes.attachment_link.title
Natural Retro Windows Typewriter Text Lofi Music Animated Instagram Post

# data[].attributes.attachment_caption
García, N. (2018, 2 julio). Evaluación de una PCR anidada para el diagnóstico de histoplasmosis en muestras de médula ósea. PCR anidada. Recuperado 22 de febrer

# data[].attributes.body
-Alta sensibilidad y especificad
- Detectar parasitemias
-El control de la especifidad de la primera PCR

# data[].attributes.attachment_caption
García, N. (2018, 2 julio). Evaluación de una PCR anidada para el diagnóstico de histoplasmosis en muestras de médula ósea. PCR anidada. Recuperado 22 de febrer

# data[].attributes.body
1. No nos permite cuantificar lamuestra
2. Costosa
3. Se demora demasiado
4. Compleja

# data[].attributes.attachment_link.readable_text
Nataly García a,*, María Mercedes Panizo a, Víctor Alarcón a, Giuseppe Ferrara a, Ana María Capote a, Xiomara Moreno b, Maribel Dolande a

a Departamento de Micología, Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". b Instituto Médico La Floresta. Caracas, Venezuela.

* Correspondencia: E-mail: natalygarcia08@gmail.com

Resumen: La histoplasmosis es una enfermedad causada por Histoplasma capsulatum, que afecta principalmente a pacientes inmunosuprimidos, especialmente con SIDA. El objetivo de este trabajo fue realizar una comparación entre el cultivo y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada en 35 muestras de médula ósea, provenientes de pacientes con SIDA y diagnóstico clínico presuntivo de histoplasmosis diseminada, para la detección de ADN de H. capsulatum. Se obtuvieron valores de sensibilidad y especificidad del 80%, valor predictivo positivo de 61,5%, valor predictivo negativo de 91,1%, y una concordancia del 80% para la PCR anidada con respecto al cultivo. La PCR anidada evaluada en este estudio es una herramienta valiosa y complementaria para el diagnóstico de la histoplasmosis en pacientes con SIDA, utilizando muestras de médula ósea. Los resultados obtenidos deben ser interpretados tomando en cuenta aspectos epidemiológicos y la sintomatología clínica del paciente, siendo útil para predecir con éxito la ausencia de la enfermedad, sobre todo en regiones con elevada prevalencia.

Palabras clave: histoplasmosis, Histoplasma capsulatum, SIDA, médula ósea, PCR anidada, cultivo.

Evaluation of a nested PCR for the diagnosis of histoplasmosis in bone marrow specimens

Abstract: Histoplasmosis is a disease produced by Histoplasma capsulatum which mainly affects immunosuppressed patients, especially those with AIDS. The aim of this study was to compare culture and nested polymerase chain reaction (nPCR) diagnosis in 35 bone marrow specimens, from patients with AIDS and presumptive clinical diagnosis of disseminated histoplasmosis, for H. capsulatum detection. Nested PCR showed values of 80% sensitivity and specificity; 61.5% of positive predictive and 91.1% of negative predictive values, with 80% of agreement with culture. The nPCR evaluated in this study is a valuable and complementary tool for histoplasmosis diagnosis in AIDS patients using bone marrow specimens. These results should be interpreted considering epidemiological aspects and clinical symptoms of the patient, being useful to predict with success the absence of the disease, especially in high prevalence areas.

Keywords: histoplasmosis, Histoplasma capsulatum, AIDS, bone marrow, nested PCR, culture.

Recibido 20 de enero de 2017; aceptado 21 de marzo de 2017

La histoplasmosis en una micosis que se distribuye en todo el mundo, siendo endémica en el continente americano. Es causada por Histoplasma capsulatum , que comprende actualmente un complejo de hongos dimorfos que se encuentran en suelos enriquecidos con nitrógeno/fosfato, particularmente guano de aves. Las especies de Histoplasma se encuentran en el medio ambiente en forma filamentosa, reproduciéndose asexualmente mediante macroconidias y microconidias, favorecidas por temperaturas entre 18-20 ºC y humedad superior al 60%. Las microconidias pueden ser inhaladas por varias especies de mamíferos incluido el hombre, y se convierten rápidamente en levaduras a temperaturas entre 35-37 ºC, persistiendo en los tejidos del hospedero causando la enfermedad [1,2].

H. capsulatum sensu lato es un complejo de al menos ocho clados distribuidos geográficamente de la siguiente manera: Australia, Países Bajos, Eurasia, América del Norte clases 1 y 2 (NAm 1 y NAm 2), América Latina grupos A y B (LAm A y LAm B) y África. Con la excepción del grupo Eurasiático, los clados se consideran especies filogenéticos [2].

La histoplasmosis afecta principalmente a pacientes inmunosuprimidos, especialmente a los que cursan con Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), en los cuales hay una inadecuada respuesta inmune mediada por linfocitos T. Tradicionalmente, el diagnóstico no es sencillo y se realiza mediante cultivo (considerado el patrón de oro), detección de antígeno y anticuerpos, coloraciones y estudios histopatológicos [1-6].

La severidad de la enfermedad depende básicamente del grado de exposición al hongo y el estado inmune del individuo. En pacientes con SIDA, la histoplasmosis es una infección oportunista y la forma clínica diseminada es la presentación más frecuente y severa, con una elevada tasa de mortalidad si no es diagnosticada y tratada a tiempo; por lo tanto, es importante desarrollar técnicas que permitan realizar un diagnóstico precoz y rápido de la enfermedad [1,3-6].

Entre la variedad de muestras clínicas que se pueden emplear para el estudio de esta entidad clínica se encuentra la médula ósea, considerada una muestra necesaria e importante cuando se requiere el estudio de citopenias, enfermedades infecciosas invasoras y fiebre de origen desconocido, condiciones generalmente presentes en pacientes con SIDA. Algunos autores han sugerido que es una muestra de gran utilidad para el diagnóstico de esta micosis, indicando que su cultivo favorece la mayor recuperación del hongo [4,7].

Por las razones antes expuestas, el objetivo de este trabajo fue realizar una comparación entre el cultivo y la (PCR) anidada en muestras de médula ósea, para la detección de ADN de H. capsulatum.

Para la primera ronda de la PCR anidada se utilizó 5 μL del ADN extraído en una mezcla de reacción que contenía 50 mM de MgCl (Invitrogen); buffer 10X (Invitrogen);100 mM de oligonucleótidos (Promega); 0,1 mM de ditiotrietol (Invitrogen); 40 U de RNase Out -inhibidor recombinante de nucleasas- (Invitrogen); 10 mM de cada uno de los cebadores externos Hc I y Hc II (Bioneer Corporation); 5 U/μL de Taq ADN polimerasa (Promega) y agua libre de nucleasas (Invitrogen), hasta completar un volumen de 50 μL por reacción. Para la segunda ronda se realizó una dilución 1:100 del producto de la primera ronda, el cual fue diluido con agua libre de nucleasas (Invitrogen). Para la preparación de la mezcla de esta ronda se utilizaron 5 μL de la dilución realizada y los mismos componentes de la primera, con excepción del ditiotrietol, el inhibidor recombinante de nucleasas y los cebadores internos: Hc III y Hc IV (Bioneer Corporation). Ambas rondas se realizaron en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems), bajo las mismas condiciones: 94 °C por 5 minutos; 35 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 65 °C por 30 segundos y 72 °C por un minuto, y finalmente un ciclo a 72 °C por 7 minutos. Se tomaron como muestras positivas aquellas donde se evidenció una banda de 210 pb en la segunda ronda.

Como controles de la PCR anidada se utilizó ADN de la cepa F-412000-231 de H. capsulatum perteneciente a la colección de hongos del INHRR como control positivo de muestras y agua libre de nucleasas como control negativo. Adicionalmente, se utilizó como control interno de prueba la detección de una región blanco del gen humano de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (GenBank número de acceso J04038.1), para comprobar la presencia de ADN amplificable, sugerido por Bialek [3]. Para ello se desarrolló una PCR anidada, que se estandarizó a las condiciones del laboratorio. Para la primera ronda se utilizaron los cebadores gap 1 y gap 2, y para la segunda ronda se utilizaron los cebadores gap 3 y gap 4 (Bioneer Corporation). Las mezclas de reacciones fueron idénticas a las descritas anteriormente, tanto para la primera como para la segunda ronda, y la amplificación se realizó usando el mismo termociclador. Las condiciones de amplificación de la primera ronda fueron: 94 °C durante 5 minutos; 35 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 56 °C por 30 segundos, 72 °C por 45 segundos, finalizando a 72 °C durante 5 minutos. Para la segunda ronda las condiciones fueron las mismas, exceptuando que se realizó en 40 ciclos. Se consideraron muestras con amplificación de este gen aquellas donde se observaron bandas de 325 pb y 248 pb en la segunda ronda. Todos los controles se procesaron bajo las condiciones en que se manejaron las muestras.

Los amplicones, obtenidos de ambas PCR anidadas, se sometieron a corridas electroforéticas de 120 voltios durante 30 minutos en geles de agarosa (Invitrogen) preparados al 2%, teñidos con bromuro de etidio (10 mg/mL, GIBCO, BRL). Se utilizaron marcadores de peso molecular de 50 y 100 pb (Promega). Los productos se visualizaron en un sistema de documentación de imágenes (Gel Doc XR , Bio-Rad).

Análisis estadístico : Los resultados obtenidos fueron analizados mediante una tabla de contingencia de 2x2 y Chi cuadrado de McNemar con corrección de Yates, utilizando el programa estadístico Statgraphics 5.0, considerando valores de p ≤ 0,05 como significativos. Se calcularon los valores de sensibilidad (S), especificidad (E), valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN), razones de verosimilitud positivas y negativas (RVP y RVN), así como el porcentaje de concordancia (C) de la PCR anidada con respecto al cultivo [15].

En este trabajo se logró evaluar una PCR anidada para el diagnóstico de se observan en la H. capsulatum en muestras de médula ósea, obteniéndose los siguientes resultados: de las 35 muestras analizadas 8 resultaron positivas por cultivo y PCR anidada, 2 resultaron negativas por cultivo y positivas por PCR anidada, 5 positivas por cultivo y negativas por PCR anidada y 20 resultaron negativas por ambas técnicas. En total, 10 muestras fueron positivas por PCR anidada. Se obtuvieron valores de S: 80%; E: 80%; VPP: 61,5%; VPN: 91%; RVP: 4; RVN: 0,25 y concordancia: 80% para la PCR anidada. Los resultados obtenidos en la segunda ronda de la PCR anidada para la detección de H. capsulatum figura 1, para 3 de las 35 muestras de médula ósea, ensayadas en este estudio. Se encontró una asociación estadísticamente significativa entre la PCR anidada y el cultivo (p < 0,05), por lo tanto, se considera que la PCR anidada estandarizada se puede utilizar para el diagnóstico de la histoplasmosis en pacientes con SIDA, utilizando muestras de médula ósea. Además, el VPN indicó que la PCR anidada es capaz de excluir la enfermedad en un 91%, demostrando que es una prueba de elevado poder diagnóstico, sin embargo se recomienda su uso como técnica complementaria al cultivo de la médula ósea.

Estos resultados son comparables a los reportados en la literatura utilizando como blanco el gen que codifica para la proteína de 100 kDa de H. capsulatum [3,4,9], pero es importante destacar que en los estudios revisados se utilizaron varios tipos de muestras, incluyendo en algunos la médula ósea. En el estudio de Bialek [3], tomado como base para la realización de este trabajo, se utilizaron biopsias de tejido para la estandarización de la PCR anidada, logrando la detección del ADN de la proteína de 100 kDa de este hongo en las muestras utilizadas, con una especificidad para la prueba de 100%. La secuencia del gen que codifica esta proteína es única y específica para H. capsulatum , así como esencial para su supervivencia en las células humanas, de allí los resultados de especificidad obtenidos en este trabajo y que avalan su utilización posterior en otros estudios. Por su parte, Maubon [4], utilizaron 40 muestras de diversa procedencia, de las cuales 15 fueron positivas por cultivo y por PCR anidada, donde solamente 11 fueron muestras de médula ósea. De estas muestras, 10 resultaron positivas y 1 negativa; los valores de sensibilidad y especificidad de este estudio fueron del 100%, respectivamente. Muñoz [9] utilizaron 146 muestras clínicas de diversa procedencia, de las cuales sólo 7 correspondieron a sangre total, obteniendo 2 muestras positivas por cultivo y 3 por PCR anidada; los valores de sensibilidad y de especificidad para esta prueba, utilizando muestras clínicas, fueron de 100% y 95,2%, respectivamente. Para la evaluación de la PCR anidada en este trabajo sólo se utilizaron muestras de médula ósea, por lo que los valores obtenidos de sensibilidad y especificidad para esta técnica cobran una gran importancia.

El gen de la proteína de 100 kDa ha demostrado ser un blanco específico para la detección de H. capsulatum en diversas muestras clínicas, y Bialek [3] reconocieron en su trabajo la necesidad de probar e implementar la PCR anidada desarrollada por ellos en regiones con alta endemicidad para la histoplasmosis, reto que fue asumido inicialmente por Maubon [4] en Guyana Francesa, Muñoz [9] en Colombia y por Colella y col [8] y los autores de este trabajo en Venezuela. La histoplasmosis es endémica en las américas, pero no es una enfermedad de notificación obligatoria, por lo que su prevalencia es difícil de calcular. Desde el inicio de la epidemia del SIDA, los reportes afirman que la histoplasmosis diseminada es la más frecuentemente diagnosticada en estos pacientes, como enfermedad definitoria del síndrome [1,16]. Esta información ha sido confirmada por estudios venezolanos [17-19]. En esta investigación se determinaron las RVP y RVN, obteniendo resultados de 4 y 0,25 respectivamente. Estos valores indican que un resultado positivo por la PCR anidada es aproximadamente 4 veces más probable de obtener en un paciente con histoplasmosis que en un individuo sin la enfermedad, datos que avalan el uso de esta técnica para la detección y descarte de la enfermedad en poblaciones con elevada prevalencia. Particularmente, en pacientes con SIDA, es importante detectar la presencia de H. capsulatum cuando el cultivo ha resultado negativo debido a la baja carga del hongo en la muestra; sin embargo, no se debe olvidar que el resultado debe relacionarse con los antecedentes epidemiológicos y la sintomatología clínica del paciente. Estos resultados son similares a los obtenidos por Muñoz mencionados anteriormente en este estudio [9].

Con el uso de la PCR anidada, al igual que con otras técnicas moleculares, es importante destacar que es posible la obtención de resultados "falsos negativos": en el caso de este trabajo, cinco muestras resultaron negativas por PCR anidada y positivas por cultivo, por lo que deben considerarse factores clínicos, epidemiológicos y aquellos inherentes a la técnica al momento de realizar e interpretar los resultados de la prueba.

El aspirado de médula ósea es usado comúnmente en la práctica clínica para el diagnóstico de enfermedades infecciosas invasoras en pacientes con SIDA, particularmente las causadas por Mycobacterium avium intracellulare , M. tuberculosis e H. capsulatum . El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) afecta todos los linajes celulares hematopoyéticos y esto, sumado a las infecciones oportunistas, causa supresión de la médula ósea e induce citopenias específicas. La afinidad del H. capsulatum por el sistema retículoendotelial hace de la médula ósea la muestra ideal para el cultivo, ya que la probabilidad de aislar al hongo es elevada; esto haría pensar que también podría considerarse una muestra idónea a ser utilizada en ensayos moleculares [7,20].

La toma de muestra de la médula ósea es un procedimiento invasor y depende de personal bien entrenado, recipientes de recolección estériles (los cuales en sí mismos representan un riesgo de contaminación), así como del envío y transporte adecuado e inmediato al laboratorio para su procesamiento, aspectos que escapan del control del mismo y que son primordiales [13,14].

Debido a que H. capsulatum es un hongo intracelular, la utilización de un método como el de lisis-centrifugación (Isolator, Wampole Laboratories Inc., USA), que produce la lisis de los eritrocitos y leucocitos, es el más recomendable para aumentar la posibilidad de recuperación del hongo. Las muestras de médula ósea utilizadas en este estudio fueron colectadas en tubos Vacutainer con EDTA, debido a que en los centros hospitalarios no se dispone del método anteriormente nombrado, se centrifugaron y se separó la capa de glóbulos blancos, también conocida como "buffy coat". Varios estudios han reportado la utilidad del "buffy coat", obtenido con este sistema comercial, para la extracción de ADN proveniente de muestras sanguíneas. El EDTA es un excelente agente anticoagulante y estabilizador celular que, durante la centrifugación, fomenta la separación adecuada de los componentes celulares según sus diferentes densidades; de esta forma, los linfocitos y monocitos forman una capa (buffy coat) justo por encima de los granulocitos y los glóbulos rojos; recolectarla es muy sencillo y su uso favorece el aislamiento del hongo, la obtención de elevadas concentraciones de ADN posterior a su extracción y por ende, eleva el rendimiento de una prueba de PCR [12-14].

Si las muestras no son enviadas y transportadas adecuadamente al laboratorio para su procesamiento son susceptibles a que las ADNasas y ARNasas humanas actúan sobre el ADN del hongo, disminuyendo su cantidad en la muestra o degradándolo por completo. Por otra parte, la médula ósea es un tejido que posee gran cantidad de hemoglobina y una alta celularidad, por lo tanto, la detección del ADN del hongo representa un reto, debido al desequilibrio existente entre las cantidades de ADN humano y del hongo; ambos elementos pueden inhibir la prueba de PCR [6,13,14,20]. Estos aspectos pueden mejorarse incluyendo un control interno de prueba, en nuestro caso la detección del gen GADPH (datos no mostrados) [3], y la escogencia de un método de extracción como el utilizado en este estudio (columnas de sílica) [13,14], sin embargo, es posible que estos inhibidores no puedan ser removidos totalmente [6,20]. Adicionalmente, se conoce que una inhibición de la amplificación es común en muestras hematológicas, en las cuales los resultados falsos negativos pueden superar el 20%, principalmente por el contenido de hemoglobina presente. Por lo tanto, factores de inhibición, baja cantidad o degradación del ADN del hongo en la muestra y el método de extracción pueden ser los responsables de la aparición de resultados falsos negativos. Debido a lo expuesto anteriormente, la PCR anidada debe ser usada como una técnica complementaria en el diagnóstico de la histoplasmosis en pacientes con SIDA [6,20].

Al personal auxiliar y administrativo del Departamento de Micología (Mary Rosales, Ismelda Sierra, Gennesys Roque y Johan Isturiz), al personal del Departamento de Virología (Meybe Saavedra, Elsy Gudiño, Pierina D'Angelo y Lieska Rodríguez) y al personal de Microbiología de Alimentos (Anabel Bandes) del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel"

Los autores no presentan conflictos de intereses.

1. Bahr NC, Antinori S, Wheat LJ, Sarosi GA. Histoplasmosis infections worldwide: thinking outside of the Ohio River valley. Curr Trop Med Rep. 2015; 2:70-80. [ Links ]

4. Maubon D, Simon S, Aznar C. Histoplasmosis diagnosis using a polymerase chain reaction method. Application on human samples in French Guiana, South America. Diag Microbiol Infect Dis. 2007; 58:441-4. [ Links ]

6. Lion Thomas, editor. Methods in molecular biology 1508. Human fungal pathogen identification. Methods and protocols. New York: Springer Nature Humana Press; 2017. [ Links ]

7. Calore EE, Tanaka PY, Pérez NM, de Almeida LV. Bone marrow pathology in AIDS. Pathol Res Pract. 2004; 200:591-7. [ Links ]

11. Babady E, Buckwalter S, Hall L, Le Febre K, Binnicker M, Wengenack N. Detection of Blastomyces dermatitidis and Histoplasma capsulatum from culture isolates and clinical specimens by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2011; 49:3204-8. [ Links ]

13. Chen SCA, Halliday CL, Meyer W. A review of nucleic acid-based diagnostic tests for systemic mycoses with emphasis on polymerase chain reactions-based assays. Med Mycol. 2002; 40:333-57. [ Links ]

14. Holland NT, Smith MT, Eskenazi B, Bastaki M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 2003; 543:217-34. [ Links ]

15. Riegelman RK, Hirsch RP, editores. Cómo estudiar un estudio y probar una prueba: lectura crítica de la literatura médica. Publicación científica 531. Washington, DC: Organización Panamericana de la Salud; 1992. [ Links ]

16. Nacher M, Adenis A, Arathoon E, Samayoac B, Lau-Bonilla L, Gómez B, et al. Disseminated histoplasmosis in Central and South America, the invisible elephant: the lethal blind spot of international health organizations. The neglected histoplasmosis in Latin America Group. AIDS. 2016; 30:167-70. [ Links ]

17. Reviakina V, Panizo M, Dolande M, Selgrad S. Diagnóstico inmunológico de las micosis sistémicas durante cinco años 2002-2006. Rev Soc Ven Microbiol. 2007; 27:112-9. [ Links ]

18. Mata-Essayag S, Colella MT, Roselló A, de Capriles CH, Landaeta ME, de Salazar CP, et al. Histoplasmosis: a study of 158 cases in Venezuela, 2000-2005. Medicine (Baltimore). 2008; 87:193-202. [ Links ]

19. Redondo MC. Disseminated histoplasmosis in Venezuelan AIDS patients. Infect Dis Clin Pract. 1995; 4:300-3. [ Links ]

20. Singh UB, Vijaya Bhanu N, Naga Suresh V, Arora J, Rana T, Seth P. Utility of polymerase chain reaction in diagnosis of tuberculosis from samples of bone marrow aspirate. Am J Trop Med Hyg. 2006; 75:960-3. [ Links ]

# data[].attributes.attachment_link.title
Evaluación de una PCR anidada para el diagnóstico de histoplasmosis en muestras de médula ósea

# data[].attributes.attachment_link.description
Nataly García a,*, María Mercedes Panizo a, Víctor Alarcón a, Giuseppe Ferrara a, Ana María Capote a, Xiomara Moreno b, Maribel Dolande a a Departamento de Micología, Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". b Instituto Médico La Floresta. Caracas, Venezuela.

# data[].attributes.attachment_link.readable_text
Antecedentes

La esporotricosis causada por el hongo dimorfo Sporothrix schenckii puede presentar una gran diversidad de formas clínicas. El diagnóstico de laboratorio se lleva a cabo por estudio micológico y serológico. Muy pocos estudios se han enfocado a la evaluación de su diagnóstico molecular.

Ensayar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada en el diagnóstico de la esporotricosis experimental en órganos de ratones y compararla con los estudios micológico y serológico.

Ratones BALB/c fueron inoculados con concentraciones crecientes de las 2 fases morfológicas del hongo. Los animales fueron sacrificados un mes después de la inoculación, evaluándose muestras de hígado, bazo, pulmón y testículo para el estudio micológico (examen directo y cultivo) y molecular por PCR anidada, y muestras de sangre para la captación de anticuerpos específicos contra S. schenckii por inmunodifusión doble.

Resultados

Los resultados de patogenicidad con las diferentes concentraciones del hongo, y el aislamiento del mismo por cultivo mostraron pocas diferencias en el estudio de las muestras de los órganos infectados con las 2 fases morfológicas de S. schenckii. En las muestras de ratones inoculados con la fase micelial los porcentajes de positividad del cultivo y examen directo fueron mayores (100 y 37,5%), en comparación con los encontrados con los de levadura (73 y 2%). Sin embargo, en el diagnóstico molecular por PCR anidada, en estas últimas muestras, los porcentajes de positividad fueron mayores (75%), encontrándose con el micelio un 43% de resultados positivos. La detección de anticuerpos específicos fue positiva en el 100% de todos los grupos de ratones infectados.

Conclusiones

En el estudio de la esporotricosis experimental en ratones, el cultivo demostró ser una herramienta de gran eficacia, así como también la detección de anticuerpos específicos, mientras que la prueba de PCR anidada y el estudio microscópico resultaron ser de de inferior valor diagnóstico.

Esporotricosis experimental

Reacción anidada en cadena de la polimerasa

Background

Sporotrichosis caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii can presents in a variety of clinical forms. Routine diagnosis is made by mycology and serology studies. Few investigations have been focused on the evaluation of the molecular diagnosis.

To determine the value of the nested PCR technique for the diagnosis of experimental sporotrichosis in organs of mice, and to compare the results with the established laboratory diagnostic procedures.

BALB/c mice were inoculated with growing concentrations of the 2 morphological phases of the fungus. The infected animals were sacrificed one month later and specimens from liver, spleen, lung and testicle were obtained to perform wet mount, culture and molecular diagnosis by the nested PCR technique. Blood samples were obtained for determination of specific antibodies against S. schenckii by the double immunodiffusion procedure.

The pathogenicity observed with the different concentrations of the fungus inoculated and its isolation by culture, showed scarce differences in the study of specimens from organs infected with the 2 morphological phases of S. schenckii. Specimens from organs of mice inoculated with the mycelial phase when studied by wet mount and culture, showed a higher positivity (100 and 37.5%) than those from mice inoculated with the yeast phase (73 and 2%). However, diagnosis by the nested PCR molecular technique applied to the latter specimens showed a higher percentage of positivity (75%) and 43% of positive results coming from animals infected with the mycelial phase. Specific antibody detection was positive in 100% all groups of infected mice.

Conclusions

In the study of experimental sporotrichosis in mice, the culture, as well as the antibody detection, was an effective diagnostic procedure, while the nested PCR and microscopic studies had a lower diagnostic value.

Experimental sporotrichosis

Nested polymerase chain reaction

Resultados Discusión Financiación Conflicto de intereses

La esporotricosis es una micosis cosmopolita causada por el hongo dimorfo Sporothrix schenckii, el cual se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza como saprófito de plantas y suelos, afectando al hombre y a otros mamíferos. Esta especie era considerada como la única responsable de producir la patología. Sin embargo, estudios moleculares recientes han demostrado que esta constituye un complejo de especies filogenéticas. La infección se produce la mayoría de las veces como consecuencia de la inoculación traumática del hongo, ocasionando lesiones cutáneas y subcutáneas muy polimorfas; la esporotricosis sistémica puede desarrollarse a partir de una lesión inicial cutánea o también con la inhalación por conidios. Las formas clínicas más severas afectan a pacientes inmunocomprometidos. En América Central, tiene una mayor incidencia en México. En Sudamérica la prevalencia es mayor en Brasil.

En Venezuela la esporotricosis constituye la micosis subcutánea de mayor incidencia en el área urbana. Las zonas más afectadas son los Estados Centrales, Mérida, Táchira y Bolívar. Su diagnóstico se realiza regularmente mediante examen micológico e inmunológico. Sin embargo, el estudio micológico puede presentar una serie de limitaciones para el diagnóstico, ya que en el examen microscópico es difícil la visualización del microorganismo a partir de la muestra clínica, y el estudio por cultivo requiere un lapso de tiempo de 8 a 20 días para el crecimiento del hongo y su identificación. Por otra parte, el diagnóstico serológico presenta por lo general baja sensibilidad en las formas cutáneas fijas. Estos métodos son tardíos en cuanto a la necesidad de un diagnóstico rápido y específico de la patología. Por ello, el ensayo de otras técnicas que permitan la detección del hongo en un lapso corto de tiempo podría contribuir a la obtención de un diagnóstico temprano de la micosis. Como la mayoría de los hongos dimorfos, S. schenckii se encuentra en el tejido en forma de levadura, mientras que su fase saprofítica es la que comúnmente infecta al huésped. Siendo esta fase micelial poco estudiada en los trabajos de infección experimental en ratones, en esta investigación se evaluó el diagnóstico molecular por la técnica de reacción anidada en cadena de la polimerasa (PCR), empleando para la infección las 2 fases morfológicas del hongo a diferentes concentraciones de inóculos, y comparando estos resultados con los métodos de estudio micológico y serológico.
Materiales y métodos Microorganismo Animales de experimentación Inoculación en animales de experimentación Diagnóstico inmunológico Diagnóstico por PCR anidada
Los resultados del diagnóstico micológico obtenidos a partir de las muestras de ratones inoculados con las 2 fases morfológicas del hongo a diferentes concentraciones no mostraron mayores diferencias.

De los ratones inoculados con la fase de micelio, de un total de 60 órganos se procesaron 40 (5 ratones murieron antes de la fecha de sacrificio); con la fase de levadura se evaluaron 48 muestras (3 ratones murieron antes de la fecha de sacrificio).

En la actualidad es aún un reto en la mayoría de los laboratorios de Micología la estandarización, implementación y validación de las pruebas moleculares para el diagnóstico de las micosis endémicas y oportunistas. La estandarización y comparación de estas técnicas con los métodos diagnósticos convencionales nos podrían permitir evaluar el alcance e impacto que estas nuevas metodologías tienen en el estudio de las micosis que más afectan a la población. En nuestro trabajo se realizó la inducción de la esporotricosis experimental en ratones, con las 2 fases morfológicas del hongo (micelio y levadura), con el objeto de llevar a cabo posteriormente el diagnóstico micológico (examen directo y cultivo), molecular por PCR anidada y la evaluación serológica, resultados que fueron posteriormente analizados y comparados.

Trabajo financiado por el Proyecto N.° PI-09-6588-2006 del Consejo Desarrollo Científico y Humanístico-Universidad Central de Venezuela (CDCH-UCV), Caracas, Venezuela.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Las 2 fases morfológicas del hongo inoculadas en los ratones a concentraciones crecientes para la inducción de la esporotricosis experimental no mostraron diferencias en cuanto al grado de afectación y diseminación de la enfermedad. La levadura es la fase parasitaria del hongo en el tejido y ha sido empleada con frecuencia para el desarrollo de la esporotricosis experimental. Por otra parte, la fase de micelio, una vez que ha penetrado en el tejido del huésped, requiere de un periodo para su conversión de hifa a levadura, sin embargo, pese a estas diferencias, los 2 grupos de ratones infectados mostraron un desarrollo bastante similar de las lesiones, observándose nódulos internos, hepatoesplenomegalia y orquitis, pero los ratones inoculados con el micelio mostraron un mayor número de nódulos a lo largo de la cola, y en algunos casos estos estaban ulcerados. Esto podría estar relacionado con el mayor grado de respuesta inmune del tejido del ratón ante la fase saprofítica del hongo, o a una mayor capacidad del micelio para la invasión y degradación del tejido.

Por otra parte, los resultados de la detección del hongo por examen directo en las muestras de los órganos de ratones inoculados con la fase de micelio presentaron un mayor porcentaje de resultados positivos (37,5%), en comparación a los resultados obtenidos con la fase de levadura (2%). En el diagnóstico por cultivo, fueron también las muestras provenientes de ratones inoculados con el micelio las que mostraron un 100% de resultados positivos. Estos mayores porcentajes de positividad obtenidos en el examen directo y cultivo se correlacionan con la severidad de las lesiones que presentaron los ratones inoculados con el micelio. También se observó que el mayor porcentaje de resultados positivos, tanto en el examen directo como en el cultivo, fue obtenido con las muestras de testículos, independientemente de la fase del hongo que se empleara para la inoculación, demostrándose, una vez más, el tropismo de S. schenckii por este órgano en la infección experimental.

Los resultados obtenidos por el estudio de PCR anidada, contrariamente a lo conseguido con el diagnóstico micológico, mostraron que las muestras de órganos de ratones inoculados con la fase de levadura dieron un mayor porcentaje de positividad (75%) que los encontrados en la fase de micelio (43%), resultados estos de difícil interpretación, y aunque se valoró la cantidad y calidad del ADN total extraído de las muestras, hay que tomar en cuenta que la mayor cantidad de este ADN obtenido proviene de las células del ratón y no del ADN del hongo.

Sin embargo, el mayor porcentaje de resultados positivos obtenido en el estudio molecular en las muestras con el inóculo de levadura se correlaciona con los resultados de otros investigadores donde se emplea la fase parasitaria del hongo en el modelo experimental para evaluar el diagnóstico por PCR anidada, y señalan la alta sensibilidad y especificidad de esta técnica en el diagnóstico de la esporotricosis, así como en otras micosis.

Por otra parte, los resultados que se obtuvieron del estudio molecular a partir de las muestras de sangre completa de los ratones inoculados con las concentraciones crecientes del micelio mostraron un mayor porcentaje de positividad (67%) que el obtenido con las muestras de órganos (43%), demostrándose que con la inoculación con la fase de micelio, la captación del hongo por estudio molecular fue más eficaz en la sangre completa que en los órganos evaluados. Estos resultados podrían aportar cierta confianza en la técnica molecular en el diagnóstico de casos de septicemia por el hongo.

La evaluación molecular de las muestras adicionales incluidas de biopsias embebidas en parafina dio buenos resultados (83%). Una buena sensibilidad también fue obtenida por esta técnica en la detección de Histoplasma capsulatum en muestras de bazo de ratones embebidas en parafina. En las biopsias que fueron mantenidas por congelación, el estudio molecular fue negativo. Sin embargo, otros trabajos señalan una gran eficacia en la detección del hongo en este tipo de muestras. Posiblemente, la fracción de la biopsia congelada y procesada en nuestro estudio no fue suficiente para la captación del ADN del hongo.

La determinación de anticuerpos específicos contra el antígeno de S. schenckii por IDD mostró 100% de positividad con los sueros de ratones inoculados con ambas fases morfológicas del hongo, demostrando una vez más la eficacia de esta prueba en la detección de anticuerpos y su gran utilidad en la orientación diagnóstica de la enfermedad. Su empleo ha sido sugerido en la orientación diagnóstica de los casos de esporotricosis cutánea por los buenos resultados obtenidos con respecto a la especificidad y sensibilidad. Sin embargo, se debe tener presente que en este tipo de técnica inmunológica, el resultado depende del estado inmunológico del huésped y de la forma clínica que presente la enfermedad.

En base a los resultados obtenidos en este estudio, se demostró la alta eficacia que sigue teniendo el cultivo en el estudio de la esporotricosis experimental y la captación de anticuerpos específicos, en comparación con la evaluación microscópica y la técnica de PCR anidada. El estudio molecular resultó ser más eficaz en el diagnóstico de las muestras de órganos infectados con la fase de levadura, y las muestras de órganos infectados con la fase de micelio dieron un mayor porcentaje de positividad en el diagnóstico micológico (examen directo y cultivo).

Podemos concluir que el estudio micológico por cultivo y examen directo fue más eficaz para el diagnóstico de la esporotricosis experimental diseminada en ratón que el estudio molecular por PCR anidada. Y de acuerdo con los resultados obtenidos con la fase morfológica de levadura, la técnica molecular también podría ser considerada para la detección del hongo en las muestras de órganos, así como en sangre completa y biopsias embebidas en parafina.

Por otra parte, la prueba de IDD (en la que se obtuvieron líneas de precipitinas en todos los casos), independientemente de la fase morfológica del hongo empleada para la inoculación, sigue siendo una herramienta altamente eficaz en la captación de anticuerpos específicos contra el hongo, y para la orientación diagnóstica de la enfermedad.

En este trabajo se demuestra una mayor eficacia del cultivo, el examen directo, así como de la captación de anticuerpos específicos contra el hongo, en comparación con la prueba de PCR anidada en el estudio de la esporotricosis experimental diseminada en ratón. Futuros estudios son necesarios para continuar la evaluación de los métodos moleculares en el diagnóstico de esta y otras micosis.

La determinación de la presencia del hongo en los órganos (hígado, bazo, pulmón y testículo) de los ratones inoculados con la fase de micelio mostró al examen directo un 37,5% (15/40) de positividad; 25 muestras fueron negativas (62,5%) ( tabla 1). Las estructuras observadas en el examen directo fueron levaduras ovales. Los cultivos de todas estas muestras fueron positivos (100%), obteniéndose a temperatura ambiente colonias filamentosas de color beige a marrón. Su evaluación microscópica con azul de lactofenol mostró hifas delgadas hialinas, abundantes conidios sésiles dispuestos lateralmente a lo largo de las hifas, y en rosetas en el ápice de las células conidiógenas, características compatibles con el género del complejo Sporothrix. Estudios bioquímicos y moleculares son necesarios para corroborar la especie.

Los resultados obtenidos por cada órgano a partir de las diferentes muestras de los ratones inoculados con la fase de micelio del hongo mostraron en el examen directo del testículo un 100% de resultados positivos, seguido por hígado, pulmón y bazo ( fig. 1). Contrariamente, con la fase de levadura se obtuvo en el examen directo solo un 2% de positividad (un resultado positivo de testículo) ( tabla 1).

Los resultados del aislamiento del hongo por cultivo a partir de las muestras de los diferentes órganos de los ratones inoculados con levadura mostraron un 73% (35/48) de resultados positivos; 13 fueron negativos (27%). Similarmente a los resultados obtenidos para la fase de micelio con el cultivo, el órgano de donde se aisló con mayor frecuencia el hongo fue el testículo, seguido por hígado, bazo y pulmón ( fig. 2). Se corroboró la morfología macro y microscópica de todas las colonias, las cuales fueron compatibles con el género del complejo Sporothrix.

En el estudio molecular por PCR anidada de los diferentes órganos de ratones inoculados con micelio, se encontró que la menor concentración de ADN con la cual se obtuvo reacción positiva fue de 0,0861ng/μL, y de 0,0622ng/μL para la fase de levadura. De las 40 muestras de los diferentes órganos de ratones inoculados con la fase de micelio, se detectó el ADN del hongo por la técnica PCR anidada en 17 casos (43%), obteniéndose 23 (57%) con resultados negativos.

De las muestras de órganos de ratones inoculados con la fase de levadura, se obtuvieron 36 resultados positivos y 12 negativos, lo cual representó el 75 y 25% respectivamente. En las pruebas moleculares, las muestras de testículo continuaron presentando el mayor número de resultados positivos, seguido por pulmón, hígado y bazo ( figs. 1 y 2).

La evaluación molecular por PCR anidada de las muestras de sangre completa de los ratones inoculados con la fase de micelio mostró 6/9 resultados positivos (67%) ( tabla 1).

La evaluación serológica por la técnica IDD de los sueros de los ratones inoculados con micelio y levadura mostraron bandas de precipitinas frente al antígeno de S. schenckii, obteniéndose un 100% de positividad ( tabla 1).

De 9 biopsias de pacientes con diagnóstico micológico previo de esporotricosis incluidas en este estudio para el diagnóstico molecular, 3 de las mantenidas por congelación resultaron negativas por PCR anidada, mientras que 5/6 de las biopsias embebidas en bloques de parafina fueron positivas, lo cual representó el 83% de positividad.

A las Doctoras Isabel Tapia, María Antonia de la Parte y Nieves González, Profesoras Insignes de la Escuela de Medicina de la Universidad Central de Venezuela, por su disposición y valioso apoyo brindado.

# data[].attributes.attachment_link.title
Evaluación de la técnica PCR anidada para el diagnóstico de la esporotricosis experimental | Revista Iberoamericana de Micología

# data[].attributes.attachment_link.description
Antecedentes La esporotricosis causada por el hongo dimorfo Sporothrix schenckii puede presentar una gran diversidad de formas clínicas. El diagnóstico de laboratorio se lleva a cabo por estudio micológico y serológico. Muy pocos estudios se han enfocado a la evaluación de su diagnóstico molecular.

# data[].attributes.attachment_link.authors[].name
Laboratorio de Fisiología Molecular Y Estructural