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1- Recolher o sangue com a zaragatoa
2- Cortar a ponta da zaragatoa para o microtubo
3- Adicionar 1000 ul de água destilada
4- Colocar no agitador por 20 minutos
5- Centrifugar por 15 minutos a 14000 rpm (não esquecer de colocar um microtubo no lado oposto da centrifugadora com o mesmo volume de alguma substância de modo a não haver desequilíbrios)
6- Recolher e rejeitar o sobrenadante com a micropipeta
7- Adicionar ao «pellet» 100 ul de Chelex(5%)
8- Colocar a 56ªC em banho térmico por 30 minutos
9- Colocar a 100ªC por 10 minutos
10- Centrifugar por 15 minutos a 14000 rpm
11- Recolher o sobrenadante com a micropipeta
12- DNA pronto. Armazenar a 4ªC

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Legenda: Centrifugadora

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Legenda: Materiais necessários para o método de Chelex.

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Legenda: Agitador

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No método de Chelex,depois de agitarmos a amostra de DNA com água destilada, centrifugamo-la, o que levou à formação de um depósito de DNA, por este ser mais denso, e um sobrenadante (que foi recolhido com a micropipeta). Seguidamente aplicamos Chelex, que contém proteases K, essenciais para impedir a degradação do DNA, já que inibem a ação das DNases.
A 2º centrifugação é usada para retirar resíduos de proteases ainda restantes.
Na preparação das amostras o aspeto mais importante a ser realçado é de que adicionamos ao DNA a enzima de restrição EcoR1, que o corta em locais específicos, formando fragmentos que vão ser usados na eletroforese.
Na eletroforese verificamos o deslocamento dos fragmentos de DNA do polo negativo para o positivo da tina (dado o DNA ser uma molécula de carga negativa, devido à presença do grupo fosfato), coberta com um gel de agarose e uma solução tampão, que permitem o transporte do DNA e a condução de corrente, respetivamente. Observamos também que os fragmentos menores se deslocaram mais para longe do polo positivo, por se moverem com maior velocidade

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1- Adicionar 10 ul de DNA para um microtubo
2- Pôr 10 ul de EcoR1 ao microtubo
3- Colocá-lo a 37ªC durante 45 minutos
4- Tirá-lo da estufa

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Legenda: Materiais da preparação das amostras e da eletroforese.

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1- Fazer um gel de agarose e colocá-lo na tina de eletroforese juntamente com a solução tampão
2- Colocar o Loading Dye na amostra de DNA
3- Fechar a tina e ligar a fonte de alimentação por 30 minutos a 100V
4- Desligar a fonte de alimentação e colorar o gel de agarose com o «Fast Blast DNA Stain»

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O objetivo do trabalho realizado no IPATIMUP prende-se em aprender a realizar o método de Chelex e em reconhecer e realizar o processo da eletroforese.

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O método de Chelex é um dos vários métodos existentes para a extração de DNA e consiste na utilização de Chelex (5%)como material essencial para a realização da experiência.

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Já a eletroforese é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com o seu tamanho, permitindo obter o movimento de partículas com carga elétrica através da aplicação de uma diferença de potencial.
A eletroforese é um processo que tem várias aplicações nas mais diversas áreas como nas ciências forenses, na genética, na microbiologia, na bioquímica e, no caso em que trabalhamos, na criminologia. Ao compararmos os fragmentos de DNA padrão com os obtidos, podemos por exemplo concluir acerca de quem é o culpado de entre um grupo de suspeitos numa situação criminal.

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Ao realizar estas experiências ficamos a conhecer todos os processos necessários para realizar a extração de DNA através do método de Chelex, a preparar amostras de DNA e a realizar o processo de eletroforese que é útil em várias áreas do conhecimento como a genética, a microbiologia e a criminologia. Assim, seguindo todos estes passos fomos capazes de extrair, preparar e obsevar o deslocamento de fragmentos de DNA.

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Após a realização desta experiência pudemos observar o deslocamento dos fragmentos de DNA ao longo do gel de agarose colorado com o «Fast Blast DNA Stain» e conseguimos observar que todos os fragmentos de DNA se deslocaram do polo negativo, onde se encontravam inicialmente, para o polo positivo. Conseguimos observar que o a quarta coluna de DNA coincide com a coluna de DNA escada. Os fragmentos maiores deslocaram-se menos do que os fragmentos menores.
Legenda: Fragmentos de DNA após aplicação da tensão de 100 V.

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Legenda: Fragmentos de DNA no polo negativo.