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Transferência gênica em procariotos:

 Em I,  há  um  processo  de transdução,  onde o bacteriófago

reconhece a bactéria e injeta o seu material genético dentro da

bactéria;

 Em II, há um processo de conjugação;

 Em III, há um processo de transformação

 Reprodução sexuada → é a transferência horizontal em larga

escala,   via   células   especializadas,   de   partes   dos   genomas

materno e paterno.

 Possui cromossomo único → DNA dupla fita circular, exceto

em   casos,   onde   o   DNA   é   dupla   fita   linear:   streptomyces

lividans, rhodococtus fasciens e espiroquetas.

Principais características do genoma de procarioto:

 Estrutura compacta que se dedica quase que exclusivamente a codificação de proteínas;

 Capaz de se autorreplicar;

 Superposição de genes;

 Uma mesma sequência codifica mais de uma proteína.

 Vantagens → rápida replicação.

 Desvantagem → se houver uma mutação em um determinado gene, há uma perda de duas proteínas,

e não de apenas uma.

Organização genômica em operons:

 Operons → vários genes com um único regulador. Quando precisa-se de uma determinada função,

como por exemplo um carboidrato (lactose), todos os genes que estão envolvidos na degradação da

lactose estão sendo expressos por meio de um único regulador, onde esse evento ocorre APENAS em

procarioto. Em eucariotos, para que haja a degradação da lactose, é necessário produzir a enzima

lactase por meio de um controle e uma enzima permease por meio de um outro controle.

 Genes que codificam produtos com funções relacionadas;

 Responsáveis pelo controle da expressão gênica;

 Presentes apenas em procariotos;

 Regulados pela presença de substrato.
Unidades que compõem o genoma de procariotos:

 Plasmídeos;

 Bacteriófagos;

 Transposons   →   são  segmentos   de   DNA   que  apresentam   uma   característica   especial,   que   é   a

mobilidade, onde são capazes de saltar no genoma de uma posição para outra, estando associado à

resistência a antibióticos.

E. coli:

 Ausência de complemento diploide;

 Praticamente sem sequências redundantes (unidades repetitivas);

 Unidades genéticas acessórias → plasmídeo;

 Sequências codificantes em ambas as fitas;

 Colinearidade entre genes e produtos proteicos;

 Quase todo o genoma está relacionado com codificação e regulação.
https://www.studocu.com/pt-br/document/universidade-federal-fluminense/biotecnologia/resumos/organizacao-genica-de-procariotos-e-eucariotos/3420419/view

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Vídeo produzido por Discentes da UFSC

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Sequenciamento de Sanger - PPCC Biologia Molecular UFSC

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https://www.todamateria.com.br/biologia-molecular/#:~:text=A%20hist%C3%B3ria%20da%20Biologia%20Molecular,material%20presente%20no%20n%C3%BAcleo%20celular.&text=No%20ano%20de%201953%2C%20James,uma%20dupla%20h%C3%A9lice%20de%20nucleot%C3%ADdeos.

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A história da Biologia Molecular começa a ter início com a suspeita de algum tipo de material presente no núcleo celular.

Os ácidos nucleicos foram descobertos em 1869, pelo pesquisador Johann Friedrich Miescher ao analisar o núcleo de glóbulos brancos do pus de feridas. Porém, eles foram inicialmente denominados de nucleínas.

No ano de 1953, James Watson e Francis Crick elucidam a estrutura tridimensional da molécula de DNA, a qual consiste em uma dupla hélice de nucleotídeos.

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Os ácidos nucleicos são formados por nucleotídeos, que são compostos por um ácido fosfórico, um açúcar e uma base nitrogenada (observe esquema a seguir). Esses nucleotídeos estão unidos um ao outro por ligações fosfodiéster estabelecidas entre um açúcar e um fosfato.
https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/a-formacao-acidos-nucleicos.htm#:~:text=Os%20%C3%A1cidos%20nucleicos%20s%C3%A3o%20formados,um%20a%C3%A7%C3%BAcar%20e%20um%20fosfato.&text=Observe%20o%20esquema%20de%20um%20nucleot%C3%ADdeo.

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https://www.sobiologia.com.br/conteudos/Citologia2/AcNucleico3.php

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Para que isso ocorra, é fundamental que o DNA sofra “auto-duplicação”.

O modelo estrutural do DNA proposto por Watson e Crick explica a duplicação dos genes: as duas cadeias do DNA se separam e cada uma delas orienta a fabricação de uma metade complementar.

O experimento dos pesquisadores Meselson e Stahl confirmou que a duplicação do DNA é semiconservativa, isto é, que metade da molécula original se conserva íntegra em cada uma das duas moléculas-filhas.

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EXPRESSÃO GÊNICA E DIAGNÓSTICOS. APLICAÇÕES DO PCR EMTEMPO REAL

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EXPRESSÃO GÊNICA E DIAGNÓSTICOS. APLICAÇÕES DO PCR EMTEMPO REAL

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Avaliação de três métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação de DNA genômico pela técnica da PCR

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Avaliação de três métodos de extração de DNA de material parafinado para amplificação de DNA genômico pela técnica da PCR

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A eletroforese é um método habitualmente usado para separar e também purificar macromoléculas, principalmente ácidos nucleicos e proteínas. Essas macromoléculas são submetidas a um campo elétrico, na qual migram para um polo positivo ou negativo de acordo com a sua carga. No caso de uma carga positiva, seguirá para o polo negativo e se for negativa, irá na direção do polo positivo.

O fluxo migratório é determinado pelo peso molecular, na qual moléculas de menor peso migram mais rápido que as de maior peso, formando as bandas características que serão visualizadas posteriormente.
https://kasvi.com.br/principios-da-tecnica-de-eletroforese/

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https://kasvi.com.br/principios-da-tecnica-de-eletroforese/
A eletroforese é utilizada em inúmeros processos de biologia molecular, entre eles:

Ciência forense– para comparar o DNA encontrado no local do crime com o de possíveis suspeitos.

Genética– teste de paternidade, diferenciação de espécies ou linhagens e engenharia genética.

Microbiologia– detecção de diferentes patógenos como vírus, bactérias e fungos.

Bioquímica– detecção da expressão de proteínas.

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A cuba para eletroforese é utilizada para fazer a separação de moléculas de DNA, RNA e proteínas. A técnica consiste em aplicar uma corrente elétrica em um meio suporte, o que gera a migração das moléculas de acordo com o seu tamanho.
https://www.analiticaweb.com.br/produtos1.php?Bgrupo=81&tit=cuba-para-eletroforese#:~:text=A%20cuba%20para%20eletroforese%20%C3%A9,acordo%20com%20o%20seu%20tamanho.

# data[].attributes.attachment_link.title
Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose

# data[].attributes.body
Caso você tenha pensado nos nucleotídeos como uma molécula
formada por uma base nitrogenada , uma pentose e uma ligação
fosfato, a sua resposta foi acertada e certamente você percebeu a
diferença entre essas moléculas e os nucleosídeos. Como aprendemos
nessas aula, os nucleosídeos são moléculas que apresentam uma
base nitrogenada e uma pentose. Os nucleosídeos não apresentam
uma ligação fosfato. Com relação à função que os nucleotídeos
desempenham na célula você poderia pensar no ATP, um
nucleotídeo que participa das reações de transferência de energia
química na célula. Uma outra função bastante conhecida dos
nucleotídeos é que eles são moléculas envolvidas no
armazenamento e na transmissão da informação genética. Essas
funções estão associadas ao DNA e RNA. Os nucleotídeos
desempenham ainda função coenzimática (exemplo disso é o NAD) e
de segundo mensageiro (AMP cíclico e GMP cíclico).
https://www.cesadufs.com.br/ORBI/public/uploadCatalago/11282816022012Bioquimica_aula_8.pdf

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Eletroforese vertical de DNA em gel de agarose

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Células eucariotas contemporâneas evoluíram de uma simbiose.

Possuem genomas híbridos.

São genomas grandes e ricos em regiões de DNA regulador (humano = 98,5% não codificantes; E.coli =

11% não codificante). Por esse motivo possuímos pequenas chances de expressar mutações, pois a maioria

dos nossos genes são não codificantes, enquanto a E.coli possui uma grande chance.

Saccharomyces cerevisiae:

 Modelo mínimo de eucarioto, pois é unicelular e pequeno;

 2,5 vezes maior que a E.coli;

 1,5 vezes mais proteínas distintas.

Características:

 Existência de múltiplas cópias de algumas sequências (repetições);

 Presença de complemento diplóide;

 Abundância de sequências redundantes;

 Sequências codificantes em apenas uma das fitas;

 Raramente apresenta unidades genéticas acessórias;

 Quase todo genoma não apresenta codificação e regulação;

 Não há operons, onde todos os nossos genes são regulados por um único regulador para aquele gene,

exceto o verme caenorhabditis elegans, que possui 25% dos genes regulados por operons.
Genoma das organelas (PROCARIOTOS):

 Dupla fita (DNA);

 Genoma circular;

 Várias cópias por organela.

Genoma humano:

Estrutura tridimensional dos cromossomos:

 Cada célula humana possui cerca de 2 metros de DNA, corpo humano 10

13

células, portanto o corpo

humano possui cerca de 2X10

13

metros de DNA, que é 100 vezes a distância entre a Terra e o Sol;

 Consequentemente, o DNA é compactado de forma eficiente;

 Cromatina → DNA + proteínas;

 Nucleossomos → DNA + histonas (octâmero formado por 2 unidades). O DNA é enrolado duas

vezes sobre o octâmero;

 Solenoide   →   forma   helicoidizada   (produzida   artificialmente   em   altas   concentrações   de   sais)

estabilizada pela histona H1, que no centro da estrutura;

 Maior grau de helicoidização é produzido por proteínas não histonas que formam um arcabouço.
https://www.studocu.com/pt-br/document/universidade-federal-fluminense/biotecnologia/resumos/organizacao-genica-de-procariotos-e-eucariotos/3420419/view

# data[].attributes.attachment_link.title
Organização Gênica de Procariotos e Eucariotos - UFF - StuDocu

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biotecnologia: de procariotos eucariotos universais das que existam mais de 10 (podendo chegar 100 de na

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5. Técnicas de Biologia Molecular - PCR - Animação 3D

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Técnicas de PCR - Transcrição Reversa, Quantitativa, Nested e RFLP

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Universo da Biologia Molecular

# data[].attributes.attachment_link.title
Aprenda os fundamentos do sequenciamento Sanger

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Transcrição é a primeira etapa da expressão do gene. Envolve a cópia da sequência de DNA de um gene para produzir uma molécula de RNA

A transcrição é realizada por enzimas chamadas RNA polimerases, que ligam nucleotídeos para produzir uma cadeia de RNA (usando uma cadeia de DNA como modelo).

A transcrição tem três estágios: iniciação, alongamento e término.

Nos eucariontes, as moléculas de RNA devem ser processadas após a transcrição: elas são emendadas e têm um cap 5' e uma cauda poli A colocadas em suas extremidades.

A transcrição é controlada separadamente para cada gene em seu genoma.

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Resumo da transcrição (artigo) | Transcrição | Khan Academy

# data[].attributes.attachment_link.description
Na transcrição, a sequência de DNA de um gene é transcrito (copiado) para se tornar uma molécula de RNA.

# data[].attributes.body
Após a transcrição, o RNA resultante é chamado de transcrito primário. Os transcritos primários de RNA mensageiro (mRNA), em procariontes, sofrem pouco ou nenhum processamento após sua síntese e, em geral, são traduzidos ainda durante a sua produção. Entretanto, nos eucariotos, o transcrito primário necessita de algumas alterações para adquirir maior estabilidade e caracterizar a molécula de RNA que irá para o citoplasma ser traduzida. O conjunto dessas alterações necessárias é chamado de processamento do RNA.

O RNA transportador (tRNA) e o RNA ribossômico (rRNA), ao contrário do mRNA procariótico, são gerados por quebras e outras alterações dos transcritos recém-sintetizados. De uma única cadeia nascente de RNA contendo regiões espaçadoras podem ser produzidas, por exemplo: três tipos de moléculas de rRNA e uma de tRNA, vários tipos de tRNA ou, até mesmo, várias cópias de um mesmo tRNA - sendo isso determinado pela seqüência do transcrito.

Entre outras modificações pós-transcricionais possíveis, podemos citar a adição de nucleotídeos aos términos das cadeias de RNA e a alteração de bases e de unidades de ribose dos RNAs. É comum em procariontes a adição da seqüência terminal CCA à ponta 3' de tRNAs e a metilação de algumas bases do rRNA, já em eucariontes o que normalmente ocorre é a metilação da hidroxila 2' de uma a cada cem unidades de ribose do rRNA.

Todas as moléculas de tRNA apresentam bases incomuns (ribotimidilato, pseudo-uridilato, etc.) formadas por alteração enzimática de um ribonucleotídeo padrão no tRNA precursor. Nos eucariontes, o processamento do transcrito primário que leva a formação do tRNA maduro inclui a clivagem da seqüência líder ou inicial 5'; o splicing ou processamento de introns; a substituição do terminal 3' UU por CCA e a modificação de várias bases.

O processamento de tRNAs é bem conservado entre as espécies de eucariontes, sendo a especificidade das enzimas de splicing mantida  ao longo da evolução. O gene de uma levedura, por exemplo, pode ser transcrito e processado por Xenopus, um anfíbio.

O processamento dos mRNAs em eucariotos é realizado em três etapas principais:

	
Adição do cap 5';
	
Splicing;
	
Adição da cauda de poliadenilato;

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Após a transcrição, o RNA resultante é chamado de transcrito primário. Os transcritos primários de RNA mensageiro (mRNA), em procariontes, sofrem pouco ou nenhum processamento após sua síntese e, em geral, são traduzidos ainda durante a sua produção. Entretanto, nos eucariotos, o transcrito primário necessita de algumas alterações para adquirir maior estabilidade e caracterizar a molécula de RNA que irá para o citoplasma ser traduzida. O conjunto dessas alterações necessárias é chamado de processamento do RNA.

O RNA transportador (tRNA) e o RNA ribossômico (rRNA), ao contrário do mRNA procariótico, são gerados por quebras e outras alterações dos transcritos recém-sintetizados. De uma única cadeia nascente de RNA contendo regiões espaçadoras podem ser produzidas, por exemplo: três tipos de moléculas de rRNA e uma de tRNA, vários tipos de tRNA ou, até mesmo, várias cópias de um mesmo tRNA - sendo isso determinado pela seqüência do transcrito.

Entre outras modificações pós-transcricionais possíveis, podemos citar a adição de nucleotídeos aos términos das cadeias de RNA e a alteração de bases e de unidades de ribose dos RNAs. É comum em procariontes a adição da seqüência terminal CCA à ponta 3' de tRNAs e a metilação de algumas bases do rRNA, já em eucariontes o que normalmente ocorre é a metilação da hidroxila 2' de uma a cada cem unidades de ribose do rRNA.

Todas as moléculas de tRNA apresentam bases incomuns (ribotimidilato, pseudo-uridilato, etc.) formadas por alteração enzimática de um ribonucleotídeo padrão no tRNA precursor. Nos eucariontes, o processamento do transcrito primário que leva a formação do tRNA maduro inclui a clivagem da seqüência líder ou inicial 5'; o splicing ou processamento de introns; a substituição do terminal 3' UU por CCA e a modificação de várias bases.

O processamento de tRNAs é bem conservado entre as espécies de eucariontes, sendo a especificidade das enzimas de splicing mantidaao longo da evolução. O gene de uma levedura, por exemplo, pode ser transcrito e processado por Xenopus, um anfíbio.

O processamento dos mRNAs em eucariotos é realizado em três etapas principais:

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Após a transcrição, o RNA resultante é chamado de transcrito primário. Os transcritos primários de RNA mensageiro (mRNA), em procariontes, sofrem pouco ou nenhum processamento após sua síntese e, em geral, são traduzidos ainda durante a sua produção.

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O processo de tradução gênica consiste em unir aminoácidos de acordo com o a sequência de códons do RNA mensageiro. Códon é uma trinca de bases nitrogenadas do mRNA, que tem sua trinca complementar (anticódon) no RNA transportador correspondente.
Como a sequência do mRNA é determinada pelo gene (sequência de bases nitrogenadas do DNA), então a síntese de proteína representa a tradução da informação genética, por isso é chamada de tradução gênica.

Participam da tradução gênica um grande grupo de macromoléculas: mais de 50 polipeptídeos e três a cinco moléculas de RNA em cada ribossomo, pelo menos 20 enzimas ativadoras de aminoácidos, 40 a 60 moléculas diferentes de RNA transportador e várias proteínas solúveis envolvidas em iniciação, alongamento e término da tradução.
A tradução ocorre nos ribossomos, que estão situados no citoplasma. O mRNA é traduzido em proteína pela ação de uma variedade de moléculas de tRNA, cada uma específica para cada aminoácido. A sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA é traduzida na sequência apropriada de aminoácidos de acordo com as determinações do código genético. Existem 64 trincas possíveis de nucleotídeos, sendo que apenas 61 codificam a produção de aminoácidos (2 sinalizam o início da tradução), enquanto 3 trincas correspondem a sequências de término da tradução.

A tradução tem início com a associação de um ribossomo, um mRNA e um tRNA carregando o aminácido metionina, que se ligam ao sítio P do ribossomo. O anticódon deste tRNA é UAC e seu códon no mRNA é AUG. Essa trinca consiste no códon de inicialização. Um outro tRNA liga-se ao ribossomo no sítio A.
Assim que os dois primeiros tRNAs se encaixam nos sítios P e A, o ribossomo catalisa a ligação dos aminoácidos de seus tRNAs, deslocando-se pela molécula de mRNA, espaço correspondente a uma trinca de bases.

Conforme o ribossomo se desloca, os sítios são ocupados por novos tRNAs com seus aminoácidos correspondentes ao mRNA, e as ligações entre os aminoácidos são sintetizadas, até encontrar as sequências de sinalização de término da tradução. A tradução termina quando um códon finalizador é encontrado na mesma fita de mRNA que está sendo traduzida. Os códons são UGA, UAA ou UAG. Como estes códons não são lidos, eles não têm efeito na tradução. Por fim, o polipeptídeo é liberado do ribossomo, que se torna disponível para começar a síntese de outra proteína.

Bibliografia:
Fundamentos da Genética / D. Peter Snustad, Michael J. Simmons. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.
Biologia Molecular do Gene / James D. Watson … [et al.]. Porto Alegre: Artmed, 2006
Biologia / José Mariano Amabis, Gilberto Rodrigues Martho. São Paulo: Moderna, 2004

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As são substâncias essenciais da estrutura das células vivas, além de atuar como enzimas, participando de todos os processos bioquímicos dentro e fora das células.

O processo de tradução gênica consiste em unir aminoácidos de acordo com o a sequência de códons do RNA mensageiro. Códon é uma trinca de bases nitrogenadas do mRNA, que tem sua trinca complementar (anticódon) no RNA transportador correspondente.

Como a sequência do mRNA é determinada pelo gene (sequência de bases nitrogenadas do DNA), então a síntese de proteína representa a tradução da informação genética, por isso é chamada de tradução gênica.

Participam da tradução gênica um grande grupo de macromoléculas: mais de 50 polipeptídeos e três a cinco moléculas de RNA em cada ribossomo, pelo menos 20 enzimas ativadoras de aminoácidos, 40 a 60 moléculas diferentes de RNA transportador e várias proteínas solúveis envolvidas em iniciação, alongamento e término da tradução.

A tradução ocorre nos ribossomos, que estão situados no citoplasma. O mRNA é traduzido em proteína pela ação de uma variedade de moléculas de tRNA, cada uma específica para cada aminoácido. A sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA é traduzida na sequência apropriada de aminoácidos de acordo com as determinações do código genético. Existem 64 trincas possíveis de nucleotídeos, sendo que apenas 61 codificam a produção de aminoácidos (2 sinalizam o início da tradução), enquanto 3 trincas correspondem a sequências de término da tradução.

A tradução tem início com a associação de um ribossomo, um mRNA e um tRNA carregando o aminácido metionina, que se ligam ao sítio P do ribossomo. O anticódon deste tRNA é UAC e seu códon no mRNA é AUG. Essa trinca consiste no códon de inicialização. Um outro tRNA liga-se ao ribossomo no sítio A.

Assim que os dois primeiros tRNAs se encaixam nos sítios P e A, o ribossomo catalisa a ligação dos aminoácidos de seus tRNAs, deslocando-se pela molécula de mRNA, espaço correspondente a uma trinca de bases.

Conforme o ribossomo se desloca, os sítios são ocupados por novos tRNAs com seus aminoácidos correspondentes ao mRNA, e as ligações entre os aminoácidos são sintetizadas, até encontrar as sequências de sinalização de término da tradução. A tradução termina quando um códon finalizador é encontrado na mesma fita de mRNA que está sendo traduzida. Os códons são UGA, UAA ou UAG. Como estes códons não são lidos, eles não têm efeito na tradução. Por fim, o polipeptídeo é liberado do ribossomo, que se torna disponível para começar a síntese de outra proteína.

Bibliografia:
Fundamentos da Genética / D. Peter Snustad, Michael J. Simmons. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.
Biologia Molecular do Gene / James D. Watson ... [et al.]. Porto Alegre: Artmed, 2006
Biologia / José Mariano Amabis, Gilberto Rodrigues Martho. São Paulo: Moderna, 2004

Texto originalmente publicado em https://www.infoescola.com/genetica/traducao-genica/

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Artigo sobre a tradução genética, como acontece a síntese de proteínas, o processo em detalhes, etc.

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A mensagem genética contida no DNA é formada por um alfabeto de quatro letras que correspondem aos quatro nucleotídeos: A, T, C e G.

Com essas quatro letras é preciso formar “palavras” que possuem o significado de “aminoácidos”. Cada proteína corresponde a uma “frase” formada pelas “palavras”, que são os aminoácidos.
Uma proposta brilhante sugerida por vários pesquisadores, e depois confirmada por métodos experimentais, foi a de que cada três letras (uma trinca de bases) do DNA corresponderia uma “palavra”, isto é, um aminoácido. Nesse caso, haveria 64 combinações possíveis de três letras, o que seria mais do que suficiente para codificar os vinte tipos diferentes de aminoácidos (matematicamente, utilizando o método das combinações seriam, então, 4 letras combinadas 3 a 3, ou seja, 43 = 64 combinações possíveis).

O código genético do DNA se expressa por trincas de bases, que foram denominadas códons. Cada códon, formado por três letras, corresponde a um certo aminoácido.

A correspondência entre o trio de bases do DNA, o trio de bases do RNA e os aminoácidos por eles especificados constitui uma mensagem em código que passou a ser conhecida como “código genético”.

Mas, surge um problema. Como são vinte os diferentes aminoácidos, há mais códons do que tipos de aminoácidos! Deve-se concluir, então, que há aminoácidos que são especificados por mais de um códon, o que foi confirmado. A tabela abaixo, especifica os códons de RNAm que podem ser formados e os correspondentes aminoácidos que especificam. Dizemos que o código genético é universal, pois em todos os organismos da Terra atual ele funciona da mesma maneira, quer seja em bactérias, em uma cenoura ou no homem.

O códon AUG, que codifica para o aminoácido metionina, também significa início de leitura, ou seja, é um códon que indica aos ribossomos que é por esse trio de bases qe deve ser iniciada a leitura do RNAm.

Note que três códons não especificam nenhum aminoácido. São os códons UAA, UAG e UGA, chamados de códons e parada durante a “leitura” (ou stop códons) do RNA pelos ribossomos, na síntese protéica.

Diz-se que o código genético é degenerado porque cada “palavra” (entenda-se aminoácido) pode ser especificada por mais de uma trinca.

# data[].attributes.attachment_link.readable_text
A mensagem genética contida no DNA é formada por um alfabeto de quatro letras que correspondem aos quatro nucleotídeos: A, T, C e G.

Com essas quatro letras é preciso formar "palavras" que possuem o significado de "aminoácidos". Cada proteína corresponde a uma "frase" formada pelas "palavras", que são os aminoácidos. De que maneira apenas quatro letras do alfabeto do DNA poderiam ser combinadas para corresponder a cada uma das vinte "palavras" representadas pelos vinte aminoácidos diferentes que ocorrem nos seres vivos?

Uma proposta brilhante sugerida por vários pesquisadores, e depois confirmada por métodos experimentais, foi a de que cada três letras (uma trinca de bases) do DNA corresponderia uma "palavra", isto é, um aminoácido. Nesse caso, haveria 64 combinações possíveis de três letras, o que seria mais do que suficiente para codificar os vinte tipos diferentes de aminoácidos (matematicamente, utilizando o método das combinações seriam, então, 4 letras combinadas 3 a 3, ou seja, 43 = 64 combinações possíveis).

O código genético do DNA se expressa por trincas de bases, que foram denominadas códons. Cada códon, formado por três letras, corresponde a um certo aminoácido.

A correspondência entre o trio de bases do DNA, o trio de bases do RNA e os aminoácidos por eles especificados constitui uma mensagem em código que passou a ser conhecida como "código genético".

Mas, surge um problema. Como são vinte os diferentes aminoácidos, há mais códons do que tipos de aminoácidos! Deve-se concluir, então, que há aminoácidos que são especificados por mais de um códon, o que foi confirmado. A tabela abaixo, especifica os códons de RNAm que podem ser formados e os correspondentes aminoácidos que especificam.

Dizemos que o código genético é universal, pois em todos os organismos da Terra atual ele funciona da mesma maneira, quer seja em bactérias, em uma cenoura ou no homem.

O códon AUG, que codifica para o aminoácido metionina, também significa início de leitura, ou seja, é um códon que indica aos ribossomos que é por esse trio de bases qe deve ser iniciada a leitura do RNAm.

Note que três códons não especificam nenhum aminoácido. São os códons UAA, UAG e UGA, chamados de códons e parada durante a "leitura" (ou stop códons) do RNA pelos ribossomos, na síntese protéica.

Diz-se que o código genético é degenerado porque cada "palavra" (entenda-se aminoácido) pode ser especificada por mais de uma trinca.

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A mensagem genética contida no DNA é formada por um alfabeto de quatro letras que correspondem aos quatro nucleotídeos: A, T, C e G. Com essas quatro letras é preciso formar "palavras" que possuem o significado de "aminoácidos". Cada proteína corresponde a uma "frase" formada pelas "palavras", que são os aminoácidos.

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A síntese proteica é o processo de formação das proteínas. Esse processo é realizado por estruturas denominadas de ribossomos, presentes tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Na molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico) estão contidas todas as informações genéticas do indivíduo, assim, para que a síntese de uma determinada proteína seja realizada, é necessário que a região específica do DNA onde está contida essa informação seja decodificada.

Nesse processo ocorre a transcrição dos nucleotídeos dessa região em uma molécula de RNA (ácido ribonucleico), que irá direcionar a síntese proteica em um processo denominado de tradução. A molécula de RNA que carregará essa informação até o local onde ocorrerá a síntese de proteínas é denominada de RNAm (RNA mensageiro).

Para que ocorra a síntese proteica, a informação genética fluirá do DNA para o RNA e, em seguida, para as proteínas. Esse princípio é conhecido como Dogma Central da Biologia Molecular. Em células procarióticas, como não há núcleo definido, o DNA não está separado das demais estruturas envolvidas na síntese, e, assim, o processo de tradução inicia-se enquanto ainda ocorre a transcrição. Nas células eucarióticas, o processo de transcrição ocorre no núcleo e o RNAm é transportado para o citoplasma, no qual ocorrerá a tradução.
A síntese proteica ocorrerá por meio de um processo de tradução, no qual a informação presente no RNAm, uma sequência de nucleotídeos, será traduzida numa sequência de aminoácidos, que dará origem a um polipeptídeo (proteína). Essa tradução é realizada pelo RNAt (RNA transportador), o qual traduz cada série de códons (trincas de nucleotídeos) presente no RNAm em um aminoácido.

O RNAt apresenta uma trinca de nucleotídeos (anticódon), em uma de suas extremidades, e um aminoácido correspondente, na outra extremidade. O RNAt transportará então o aminoácido específico até os ribossomos, estruturas celulares nas quais ocorre a síntese de proteínas, pareando seu anticódon ao códon complementar do RNAm.

Etapas da síntese proteica

Na síntese proteica ocorre três etapas, que estão descritas de forma sintetizada a seguir:

Iniciação da tradução

Nessa etapa ocorre a união das duas subunidades do ribossomo com o RNAm e RNAt, este trazendo o primeiro aminoácido da cadeia polipeptídica.

Alongamento da cadeia polipeptídica

Durante essa etapa, os demais aminoácidos que compõem a cadeia polipeptídica são adicionados. O anticódon do RNAt pareia-se com o RNAm no sítio A. O RNAr (RNA ribossômico) catalisa a formação da ligação peptídica entre o novo aminoácido e a cadeia em formação.

O polipeptídio é separado do RNAt presente no sítio P e ligado ao aminoácido do RNAt do sítio A. O RNAt presente no sítio P é deslocado ao sítio E e retirado, em seguida, do ribossomo, enquanto o RNAt do sítio A é deslocado ao sítio P. O RNAm também é deslocado no ribossomo e leva ao sítio A o próximo códon a ser traduzido, dando sequência ao processo até a identificação do códon de término.

Término da tradução

Após a identificação do códon de término, uma proteína, chamada de fator de término, liga-se a esse códon induzindo a ligação de uma molécula de água na porção final da cadeia, fazendo com que ocorra a quebra da ligação entre o peptídio e o RNAt presente no sítio P. O peptídio formado é então liberado através do túnel de término presente na subunidade maior do ribossomo.

Após esse processo, as cadeias polipeptídicas formadas podem passar por diferentes processos de transformação, de modo a tornar essas proteínas funcionais.

Leia também: Respiração celular: processo em que os organismos obtêm energia

Proteínas

As proteínas são macromoléculas que constituem a maior parte da massa seca das células, sendo, assim, um dos principais componentes dos seres vivos. Elas são moléculas tridimensionais, constituídas por aminoácidos unidos por ligações peptídicas, também chamadas de polipeptídeos.

Elas apresentam uma cadeia polipeptídica principal ligada a cadeias laterais, constituídas por porções dos aminoácidos que não estão presentes na cadeia principal. Existem 20 aminoácidos, com propriedades químicas diferentes, presentes nas proteínas.

Há milhares de proteínas diferentes, e elas apresentam funções específicas que dependem do número e tipos de aminoácidos presentes e de sua estrutura tridimensional. Dentre suas funções, podemos destacar: papel estrutural, catalisação de reações químicas, defesa e movimento. Aumente seus conhecimentos a respeito dessas moléculas essenciais para os seres vivos lendo o seguinte texto: Proteínas.

Ribossomos

Os ribossomos são estruturas celulares responsáveis pela síntese de proteínas. Essas estruturas são formadas por duas subunidades, uma maior e uma menor, constituídas por RNAr e proteínas. Pelo fato de não apresentarem membranas, alguns autores não os consideram como organelas.

Os ribossomos estão presentes em células procarióticas e eucarióticas. Em células nas quais há uma intensa síntese de proteínas, essas estruturas são encontradas em maior quantidade, como nas células do pâncreas, em que são produzidas inúmeras enzimas digestivas.

As células podem apresentar dois tipos de ribossomos: os livres, dispersos no citosol, cujas proteínas atuarão dentro do citosol; e os ligados, que se encontram presos ao retículo endoplasmático e ao envelope nuclear. As proteínas produzidas pelos últimos podem ser inseridas nas membranas para serem utilizadas por organelas, como os lisossomos, ou para serem secretadas para fora da célula. Saiba mais sobre essa importante estrutura acessando: Ribossomos.

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Síntese proteica é o processo pelo qual são produzidas as proteínas. Esse processo ocorre nos ribossomos tanto de células procarióticas quanto eucarióticas.

A síntese de proteínas é essencial para que ocorra a manutenção e o crescimento celular e ocorre em três etapas: iniciação da tradução, alongamento da cadeia polipeptídica e término da tradução.

A seguir, descreveremos mais detalhadamente cada uma das etapas desse processo e falaremos sobre as proteínas, destacando a sua importância para todos os seres vivos.

O que é síntese proteica?

Na síntese proteica, a informação contida no DNA é transcrita para o RNAm e, em seguida, traduzida numa sequência de aminoácidos, formando a proteína.

A síntese proteica é o processo de formação das proteínas. Esse processo é realizado por estruturas denominadas de ribossomos, presentes tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Na molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico) estão contidas todas as informações genéticas do indivíduo, assim, para que a síntese de uma determinada proteína seja realizada, é necessário que a região específica do DNA onde está contida essa informação seja decodificada.

Nesse processo ocorre a transcrição dos nucleotídeos dessa região em uma molécula de RNA (ácido ribonucleico), que irá direcionar a síntese proteica em um processo denominado de tradução. A molécula de RNA que carregará essa informação até o local onde ocorrerá a síntese de proteínas é denominada deRNAm (RNA mensageiro).

Para que ocorra a síntese proteica, a informação genética fluirá do DNA para o RNA e, em seguida, para as proteínas. Esse princípio é conhecido como Dogma Central da Biologia Molecular. Em células procarióticas, como não há núcleo definido, o DNA não está separado das demais estruturas envolvidas na síntese, e, assim, o processo de tradução inicia-se enquanto ainda ocorre a transcrição. Nas células eucarióticas, o processo de transcrição ocorre no núcleo e o RNAm é transportado para o citoplasma, no qual ocorrerá a tradução.

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Como ocorre a síntese proteica?

A síntese proteica ocorrerá por meio de um processo de tradução, no qual a informação presente no RNAm, uma sequência de nucleotídeos, será traduzida numa sequência de aminoácidos, que dará origem a um polipeptídeo (proteína). Essa tradução é realizada pelo RNAt (RNA transportador), o qual traduz cada série de códons (trincas de nucleotídeos) presente no RNAm em um aminoácido.

O RNAt apresenta uma trinca de nucleotídeos (anticódon), em uma de suas extremidades, e um aminoácido correspondente, na outra extremidade. O RNAt transportará então o aminoácido específico até os ribossomos, estruturas celulares nas quais ocorre a síntese de proteínas, pareando seu anticódon ao códon complementar do RNAm.

Na síntese proteica, a informação presente no RNAm será traduzida numa sequência de aminoácidos, que dará origem a um polipeptídeo.

Na tradução, existem dois métodos de reconhecimento entre as moléculas que garantem com que esse processo ocorra adequadamente. No primeiro método, o RNAt deve ligar-se ao aminoácido específico que ele transportará ao ribossomo. Diferentes moléculas de RNAt podem codificar um mesmo aminoácido, e a ligação entre elas é feita por meio da ação das enzimas denominadas de aminoacil-RNAt-sintases. Existem cerca de 20 tipos diferentes dessas enzimas, sendo que cada uma acondiciona uma combinação específica de aminoácido e RNAt.

O segundo processo é o pareamento entre RNAt e RNAm. Existem cerca de 45 moléculas de RNAt, e essas são capazes de parear-se com diferentes códons do RNAm. Isso se deve à flexibilidade existente no pareamento da terceira base do códon, chamada de movimento de pêndulo, na qual a existência de um códon sinônimo, o qual apresenta uma diferença apenas na terceira base, permite a codificação de um mesmo aminoácido, por diferentes códons.

Os ribossomos são constituídos por duas subunidades (uma maior e uma menor) que se unirão, na realização da síntese proteica, ao RNAm e RNAt. Durante esse processo, o RNAm descola-se pelo ribossomo, enquanto o RNAt traduz as suas sequências de nucleotídeos em aminoácidos. Quando se encontra um códon de término (uma trinca que indica o fim do processo de tradução), o ribossomo libera a proteína produzida e suas subunidades separam-se.

Os ribossomos apresentam três sítios de ligação: o sítio P, em que a molécula de RNAt está ligada à cadeia polipeptídica que está sendo formada; o sítio A, em que está presente o RNAt que carrega o próximo aminoácido a ser adicionado; e o sítio E, em que o RNAt, após deixar o aminoácido que será adicionado, sai do ribossomo. O processo de síntese nos ribossomos ocorrerá em três etapas.

Leia também: Tipos de RNA: quais são e como funcionam?

Etapas da síntese proteica

Nasíntese proteica ocorre três etapas, que estão descritas de forma sintetizada a seguir:

Nessa etapa ocorre a união das duas subunidades do ribossomo com o RNAm e RNAt, este trazendo o primeiro aminoácido da cadeia polipeptídica.

Durante essa etapa, os demais aminoácidos que compõem a cadeia polipeptídica são adicionados. O anticódon do RNAt pareia-se com o RNAm no sítio A. O RNAr (RNA ribossômico) catalisa a formação da ligação peptídica entre o novo aminoácido e a cadeia em formação.

O polipeptídio é separado do RNAt presente no sítio P e ligado ao aminoácido do RNAt do sítio A. O RNAt presente no sítio P é deslocado ao sítio E e retirado, em seguida, do ribossomo, enquanto o RNAt do sítio A é deslocado ao sítio P. O RNAm também é deslocado no ribossomo e leva ao sítio A o próximo códon a ser traduzido, dando sequência ao processo até a identificação do códon de término.

Após a identificação do códon de término, uma proteína, chamada de fator de término, liga-se a esse códon induzindo a ligação de uma molécula de água na porção final da cadeia, fazendo com que ocorra a quebra da ligação entre o peptídio e o RNAt presente no sítio P. O peptídio formado é então liberado através do túnel de término presente na subunidade maior do ribossomo.

Após esse processo, as cadeias polipeptídicas formadas podem passar por diferentes processos de transformação, de modo a tornar essas proteínas funcionais.

Leia também: Respiração celular: processo em que os organismos obtêm energia

Proteínas

As proteínas são macromoléculas que constituem a maior parte da massa seca das células, sendo, assim, um dos principais componentes dos seres vivos. Elas são moléculas tridimensionais, constituídas por aminoácidos unidos por ligações peptídicas, também chamadas de polipeptídeos.

Elas apresentam uma cadeia polipeptídica principal ligada a cadeias laterais, constituídas por porções dos aminoácidos que não estão presentes na cadeia principal. Existem 20 aminoácidos, com propriedades químicas diferentes, presentes nas proteínas.

Há milhares de proteínas diferentes, e elas apresentam funções específicas que dependem do número e tipos de aminoácidos presentes e de sua estrutura tridimensional. Dentre suas funções, podemos destacar: papel estrutural, catalisação de reações químicas, defesa e movimento. Aumente seus conhecimentos a respeito dessas moléculas essenciais para os seres vivos lendo o seguinte texto: Proteínas.

Ribossomos

Os ribossomos são estruturas celulares responsáveis pela síntese de proteínas. Essas estruturas são formadas por duas subunidades, uma maior e uma menor, constituídas por RNAr e proteínas. Pelo fato de não apresentarem membranas, alguns autores não os consideram como organelas.

Os ribossomos estão presentes em células procarióticas e eucarióticas. Em células nas quais há uma intensa síntese de proteínas, essas estruturas são encontradas em maior quantidade, como nas células do pâncreas, em que são produzidas inúmeras enzimas digestivas.

As células podem apresentar Saiba mais sobre essa importante estrutura acessando: dois tipos de ribossomos: os livres, dispersos no citosol, cujas proteínas atuarão dentro do citosol; e os ligados, que se encontram presos ao retículo endoplasmático e ao envelope nuclear. As proteínas produzidas pelos últimos podem ser inseridas nas membranas para serem utilizadas por organelas, como os lisossomos, ou para serem secretadas para fora da célula. Ribossomos.

Exercício sobre síntese proteica

Questão 1 (UEL-PR). Uma proteína formada por 20 aminoácidos é codificada por uma molécula de RNA _____________ de, no mínimo, _________nucleotídeos.

Para completar corretamente a frase, os espaços I e II devem ser preenchidos, respectivamente, por:

a) mensageiro e 20.

b) transportador e 30.

c) ribossômico e 30.

d) mensageiro e 60.

e) transportador e 60.
Solução
Alternativa d. Cada série de códons (trincas de nucleotídeos) presente no RNAm (RNA mensageiro) é traduzida em um aminoácido. Se a proteína formada apresenta 20 aminoácidos, ela é codificada por 60 nucleotídeos (20 aminoácidos x 3 nucleotídeos = 60 nucleotídeos).

Por Helivania Sardinha dos Santos

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Síntese proteica: o que é, como ocorre, etapas - Biologia Net

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Síntese proteica é o processo pelo qual são produzidas as proteínas. Esse processo ocorre nos ribossomos tanto de células procarióticas quanto eucarióticas. A síntese de proteínas é essencial para que ocorra a manutenção e o crescimento celular e ocorre em três etapas: iniciação da tradução, alongamento da cadeia polipeptídica e término da tradução.

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As mutações gênicas são mudanças ocasionais que ocorrem nos genes, ou seja, é o procedimento pelo qual um gene sofre uma mudança estrutural. As mutações envolvem a adição, eliminação ou substituição de um ou poucos nucleotídeos da fita de DNA.
A mutação proporciona o aparecimento de novas formas de um gene e, consequentemente, é responsável pela variabilidade gênica.
Quando ocorre por adição ou subtração (mutações deletérias) de bases, altera o código genético, definindo uma nova sequência de bases, que consequentemente poderá alterar o tipo de aminoácido incluído na cadeia proteica, tendo a proteína outra função ou mesmo inativação da expressão fenotípica.
Por substituição, ocorre em razão da troca de uma base nitrogenada purina (adenina e guanina) por outra purina, ou de uma pirimidina (citosina e timina) por outra pirimidina, sendo esse processo denominado de transição e a substituição de uma purina por uma pirimidina, ou vice-versa, denominada de transversão.

Por Krukemberghe Fonseca
Graduado em Biologia

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Mudanças ocasionais que ocorrem nos genes.

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Artigo Sobre Mecanismos de Reparo Gênico

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Artigo Sobre Mecanismos de Reparo Gênico

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O que são? Como Funcionam? Quais os tipos? Como são identificadas?

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O que são? Como Funcionam? Quais os tipos? Como são identificadas?

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Os polimorfismos são variações genéticas que aparecem como consequências de mutações, podendo ter diferentes classificações dependendo da mutação original. A categoria mais básica de polimorfismo é originada a partir de uma simples mutação, quando ocorre uma troca de um nucleotídeo por outro. Este polimorfismo é conhecido por Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de nucleotídeo único. Outros polimorfismos conhecidos ocorrem quando há inserção ou deleção de pedaços do DNA. O padrão de nucleotídeos repetidos é conhecido como variable number of tandem repeats (VNTRs), ou também chamados de minissatélites. Existe também o polimorfismo de bases repetidas do DNA, que podem ser duas, três ou quatro bases, chamado de simple tandem repeats (STRs) ou microssatélites.

O genoma humano possui o número estimado entre 30.000 e 35.000 genes e a sequência do DNA apresenta similaridade de 99,9% entre os indivíduos. Esta diferença de 0,1% se deve à presença dos polimorfismos.

Os polimorfismos mais frequentes são os SNPs, pois essa variação pode ocorrer em 1 a cada 1000 pares de base. De forma geral, os SNPs podem ser definidos como alterações genéticas presentes em mais de 1% da população e podem estar localizados em várias regiões do gene: promotora, codificadora (éxons) e não codificadoras. Os SNPs na região promotora e codificadora têm maior probabilidade de modificar o funcionamento do gene e, consequentemente, a proteína formada.
 
Após o projeto genoma humano foram mapeados cerca de 3,7 milhões de SNPs, o que possibilitou a identificação de genes associados a doenças crônicas, incluindo câncer, diabetes e doenças cardiovasculares. Os SNPs podem repercutir em processos como digestão, absorção e metabolismo de nutrientes, no qual surge nesse contexto o conceito de nutrigenética. A nutrigenética analisa os efeitos da variação genética na interação dieta-doença, o que inclui a identificação e caracterização do gene relacionado ou até mesmo responsável pelas diferentes respostas aos nutrientes.

Por exemplo, um dos genes polimórficos mais estudados é o MTHFR (metilenotetrahidrofolato redutase), que codifica uma enzima envolvida no metabolismo do ácido fólico. O polimorfismo nesse gene, conhecido como C677T, resulta na substituição do aminoácido alanina por valina, e tem sido associado com elevação da concentração plasmática de homocisteína, declínio dos níveis de folato plasmáticos, estando associados com aumento do risco para o desenvolvimento de câncer coloretal e mama.

Com isso, o desafio da atualidade é descobrir o impacto dessas variações genéticas sobre a resposta aos nutrientes, a fim de promover orientações nutricionais personalizadas.

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Esta página da Biblioteca Virtual da FAPESP reúne informações referenciais de bolsas e auxílios de diversas modalidades de pesquisa apoiada pela FAPESP, que possuem o assunto Polimorfismo genético.

A caixa de "Apoio FAPESP em Números" permite a visualização da totalidade de auxílios e bolsas concedidos, em andamento ou concluídos, com o assunto Polimorfismo genético.

No centro da página, podem-se ver algumas informações desses projetos apoiados, no Brasil e no exterior.

Na lista de "Assuntos relacionados" podem-se ver quais outros assuntos foram mais citados em pesquisas apoiadas com o assunto Polimorfismo genético.

Em "Refinar por" é possível filtrar o total das pesquisas com o assunto Polimorfismo genético, de acordo com os seguintes parâmetros: por modalidades de Auxílios à pesquisa, por modalidades de Bolsas, por Área do conhecimento, por Instituição e por Ano de início, e gerar resultados mais específicos.

Os Mapas e Gráficos contribuem visualmente para a identificação da distribuição geográfica do fomento da FAPESP no Estado de São Paulo, e do histórico do fomento, por ano, das pesquisas vigentes com o assunto Polimorfismo genético.

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assuntos na biblioteca virtual da fapesp

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Polimorfismo genético - Biblioteca Vitual da FAPESP

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Esta página da Biblioteca Virtual da FAPESP reúne informações referenciais de bolsas e auxílios de diversas modalidades de pesquisa apoiada pela FAPESP, que possuem o assunto Polimorfismo genético. A caixa de "Apoio FAPESP em Números" permite a visualização da totalidade de auxílios e bolsas concedidos, em andamento ou concluídos, com o assunto Polimorfismo genético.

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A clonagem molecular é uma técnica da engenharia genética conhecida também por DNA recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica. Essa tecnologia permite pegar um "pedaço" do DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes combinações genéticas.

Quando usamos a palavra clonagem é muito comum realizar a associação com o clone de um organismo inteiro, como o caso da ovelha Dolly. Nos anos 90, os pesquisadores do Roslin Institute of Scotland anunciaram que haviam conseguido clonar com sucesso uma ovelha. O animal foi o primeiro mamífero clonado a partir de uma célula adulta e nasceu em 5 de julho de 1996.

Entretanto, clonar significa fazer uma cópia geneticamente exata, seja de um organismo completo ou até mesmo de um pequeno fragmento de DNA. É aqui que entra a clonagem molecular usada amplamente na ciência, medicina, agricultura e indústria.

Desde os anos 60 uma série de descobertas revolucionaram o estudo da genética e permitiram um grande desenvolvimento da engenharia genética. Desde então a utilização do DNA recombinante ganhou espaço e tem crescido absurdamente com inúmeras aplicações e aprimoramento das técnicas.

A clonagem molecular pode fazer com que genes estranhos sejam expressos em bactérias e leveduras ou mesmo em outras células superiores. As indústrias química, farmacêutica e agrária investem milhões em seu desenvolvimento. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.

A clonagem molecular ou DNA recombinante é um método que permite fazer várias cópias idênticas (clones) de um pedaço específico de DNA. Para que isso ocorra é necessário realizar alguns passos que acompanharemos a seguir:

1. Isolar o gene de interesse

Primeiramente é necessário isolar o fragmento de DNA de interesse. Para que se tenha o DNA recombinante, de duas origens diferentes, é necessário utilizar as enzimas de restrição. Essas enzimas reconhecem a sequência alvo específica e cortam seletivamente o fragmento que será utilizado.

2. Unir o gene ao vetor: DNA recombinante

O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um gene é inserido para construir a molécula de DNA recombinante. Geralmente os plasmídeos (moléculas de DNA circulares existentes naturalmente nas bactérias) são usados como vetores para clonar fragmentos de DNA. Eles são projetados para permitir a inserção de um DNA exógeno, têm origens de replicação e são capazes de se replicar independentemente do cromossomo bacteriano.

Assim, o fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da DNA ligase, formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse. A DNA ligase é a responsável por selar as lacunas do eixo do DNA, funcionando como uma "cola".

3.Transformação

A molécula de DNA recombinante produzida é introduzida em um organismo hospedeiro, podendo então ser replicadas. Esse processo é conhecido como transformação, no qual as células bacterianas captam o DNA do ambiente externo.

As células hospedeiras copiam o DNA do vetor juntamente com o próprio DNA, criando múltiplas cópias do DNA inserido. Alguns exemplos de células hospedeiras são as bactérias Escherichia coli e Bacillus subtilis e a levedura Saccharomyces cerevisiae.

Na prática, esse procedimento gera uma mistura de construções recombinantes. Algumas células contêm o gene clonado de interesse, ao passo que outras podem conter outros genes do DNA original.

4. Seleção dos clones recombinantes

Para selecionar apenas as células de interesse o vetor possui um marcador selecionável que permite a identificação de moléculas recombinantes. Um marcador de antibiótico é frequentemente usado, assim uma célula hospedeira sem o vetor morre quando exposta a um determinado antibiótico, enquanto o hospedeiro com o vetor sobrevive e se multiplica, porque é resistente.

6. Multiplicação ou expressão do gene

Após as células com o plasmídeo recombinante serem identificadas, elas podem crescer em grande escala, replicando o fragmento de DNA. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a proteína alvo.

As bactérias servem como "mini fábricas", produzindo grandes quantidades de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina.

A proteína de interesse é então purificada, separada dos demais conteúdos das células, por exemplo, outras proteínas e macromoléculas. Isso garante que não haja nenhuma impureza, restando apenas o produto final, como no caso da insulina.

Aplicação da clonagem de DNA

A clonagem molecular possui inúmeras aplicações e vem ganhando cada vez mais importância nos últimos anos. Entre as possibilidades estão o desenvolvimento de proteínas recombinantes mais seguras para o tratamento de doenças, o aprimoramento da terapia genética, a produção vacinas, além do uso na agricultura.

Veja abaixo algumas das aplicações da técnica de DNA recombinante:

Insulina - foi a primeira proteína humana produzida comercialmente utilizando bactérias modificadas por engenharia genética. Hoje outros hormônios e proteínas humanas estão sendo produzidos.

Plantas com inseticidas - Um uso pioneiro e economicamente importante é a engenharia genética de plantas que produzem seus próprios inseticidas. A bactéria Bacillus thuringiensisproduz naturalmente uma proteína, conhecida como toxina Bt, letal para muitos insetos. Essa toxina é particularmente atraente como inseticida porque é específica para alguns insetos, degradada rapidamente no ambiente e não tóxica para os humanos e outros animais.

Produção de leite - A somatotrofina bovina recombinante é amplamente usada nos Estados Unidos para aumentar a produção de leite no gado leiteiro.

Terapia genética - Em algumas desordens genéticas, os pacientes não possuem a forma funcional de um gene particular. A terapia genética tenta fornecer uma cópia normal do gene para as células do corpo do paciente. É utilizada no tratamento da fibrose cística.

Hormônio de crescimento humano - a administração deste hormônio durante a infância possibilita a correção da baixa estatura em casos correlacionados com a ausência ou pequena produção do hormônio do crescimento (GH).

Anticoagulantes - ativadores de plasminogênio tecidual ativam a plasmina, enzima que dissolve os trombos. Usado no tratamento de derrames, prevenção de coágulos sanguíneos e ataques cardíacos.

Produtos Kasvi

MADIGAN, Michael T., MARTINKO, John M., BENDER, Kelly S., BUCKLEY, Daniel H., STAHL, David A. Microbiologia de Brock, 14ª edição . ArtMed, 2016.

PIERCE, Benjamin A. Genética - Um Enfoque Conceitual, 5ª edição. Guanabara Koogan, 2016.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular biology of the cell. Isolating, Cloning, and Sequencing DNA. 4ª edição. Nova Iorque: Garland Science; 2002.

JÚNIOR, CAMPOS, Dioclécio, BURNS, Dennis Rabelo, LOPEZ, Fabio Ancona. Tratado de Pediatria, 3ª edição . Manole, 2015.

Visão geral: Clonagem de DNA. Definição, finalidade e os passos básicos da clonagem do DNA.

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Os princípios da clonagem molecular: DNA recombinante

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A clonagem molecular é uma técnica da engenharia genética conhecida também por DNA recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica. Essa tecnologia permite pegar um "pedaço" do DNA e combiná-lo com outro, produzindo muitas cópias de diferentes combinações genéticas. Quando usamos a palavra clonagem é muito comum realizar a associação com o clone de um organismo inteiro, como o caso da ovelha Dolly.

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1 - https://varstation.com/pt/blog/artigos/o-que-e-sequenciamento-de-nova-geracao-ngs/
2 - https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/dna-sequencing

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Estudos de expressão gênica utilizando-se microarrays: delineamento, análise, e aplicações na pesquisa zootécnica

Microarray gene expression studies: experimental design, statistical data analysis, and applications in livestock research

Guilherme Jordão de Magalhães RosaI; Leonardo Bernardes da RochaI, II; Luiz Roberto FurlanIII

IDepartment of Dairy Science, University of Wisconsin, Madison WI, USA 53705 email: grosa@wisc.edu
IIDepartamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista UNESP, Jaboticabal-SP. Bolsista do CNPq
III Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal, Universidade Estadual Paulista UNESP, Botucatu-SP

Palavras-chave: análise estatística, microarrays, pesquisa zootécnica, planejamento de experimentos

Microarray technology allows monitoring thousands of genes simultaneously in a specific tissue of an organism, in different developmental stages or environmental conditions. Microarrays are very common in functional genomics experiments with both animals and plant species, and they have been increasingly used also in different areas of livestock research, such as growth and metabolism, reproduction, immune response to diseases and parasites, response to non-infectious stress factors (such as dietary restriction, exposure to toxic elements and other unfavorable environmental conditions) as well as animal breeding. Such experiments, however, are still considerably expensive and time consuming and, consequently, they are performed with relatively small sample sizes. Nonetheless, microarray experiments are extremely complex, as they involve a number of laboratorial procedures such as sample collection, RNA extraction, reverse transcription and labeling, and the final hybridization. Hence, microarray assays require careful experimental planning and statistical data analysis. In this manuscript, basic principles of experimental design for microarray studies are reviewed, as well as the most common statistical and computational tools used for their analysis. In addition, some examples of application of microarray technology in animal science are discussed, and some concluding remarks are presented afterward.

Key words: animal science, experimental design, microarrays, statistical analysis

Os arranjos de DNA, também conhecidos como chips de DNA em alusão ao componente eletrônico miniaturizado que carrega milhões de transistores, são coleções de segmentos de DNA que se encontram ordenadamente distribuídos sobre uma superfície sólida. O pré-requisito fundamental para qualquer tipo de arranjo de DNA é a existência de um "endereço próprio" para cada componente da coleção, ou seja, uma posição individual para cada componente do arranjo (Chaudhuri, 2005).

Assim sendo, organizações como a Microarray Gene Expression Data Society - MGED ( http://www.mged.org/) e o European Bioinformatics Institute - EBI ( http://www.ebi.ac.uk/), têm estabelecido guias de orientação que auxiliam os pesquisadores a planejar e implementar seus experimentos com microarrays, cujo objetivo é padronizar as variantes dessa tecnologia, para que os resultados obtidos em experimentos diferentes possam ser comparados e utilizados como base para o planejamento de novas pesquisas sobre o mesmo tema. Um desse guias é o Minimum Information About a Microarray Experiment (MIAME), que contém diversas recomendações e padrões para coleta e análise de dados provenientes de experimentos com microarrays, para que estes possam ser corretamente interpretados e reproduzidos (Jaluria et al., 2007).

Do ponto de vista de delineamento e análise estatística de experimentos de microarray, a distinção mais importante entre as diferentes tecnologias existentes refere-se ao número de amostras hibridizadas em cada lâmina. Neste sentido, os diversos tipos de tecnologias de microarrays podem ser divididos em dois grupos básicos: sistema de uma cor ( single-color ou single-channel microarray) e sistema de duas cores ( two-color microarray). Neste artigo estas duas tecnologias básicas serão referidas por lâminas de hibridizações independentes e lâminas de hibridizações competitivas, respectivamente. No sistema com hibridizações independentes, cada amostra de RNA é marcada e hibridizada individualmente numa lâmina. Uma vantagem deste tipo de tecnologia é que a condução dos experimentos é geralmente mais simples, mas por outro lado variações naturais entre as lâminas ficam de certa maneira confundidas com as diferenças entre as amostras. Este problema, no entanto, é minimizado se as diferenças entre as lâminas não forem importantes, e também a partir da utilização de procedimentos estatísticos específicos de ajuste dos dados para a correção dos mesmos, como discutido posteriormente neste artigo.

Acredita-se que a hibridização conjunta de pares de amostras (também chamada hibridização competitiva) minimiza o problema de variabilidade entre lâminas. Outra vantagem é que lâminas de hibridização competitiva, tanto com sondas de cDNA quanto de oligonucleotídeos longos, estão disponíveis para um maior número de espécies de interesse zootécnico. Ainda, como existem lâminas deste tipo produzidas por universidades e instituições de pesquisa sem fins lucrativos, elas podem ser adquiridas a um preço normal. No entanto, experimentos de microarray com hibridizações competitivas são um pouco mais complexos, especialmente quando mais do que dois grupos experimentais são comparados, como será discutido a seguir.

Planejamento de experimentos com Microarrays

O planejamento de estudos de expressão gênica utilizando-se microarrays envolve uma série de aspectos, como a escolha do(s) tecido(s) a ser(em) estudado(s) - ou até mesmo a escolha do tipo de célula(s) de interesse -, e o(s) estágio(s) de desenvolvimento a serem avaliados. Como exemplo, suponha um estudo de genômica funcional para a comparação dos níveis de expressão gênica de diferentes raças bovinas em resposta à infestação com carrapatos. Neste caso, o pesquisador terá que escolher se investigará mudanças de expressão gênica na pele, em linfonodos, ou algum outro tecido, bem como em que estágio após a infestação, como por exemplo, algumas horas, após um dia ou uma semana, etc.

Mesmo após a escolha do tecido(s) de interesse, pesquisadores ainda devem refletir em relação à complexidade do(s) mesmo(s) para julgar se extrações de RNA devem ser conduzidas considerando-se cada tecido como um todo ou se as extrações devem ser específicas para determinado(s) tipo(s) de célula(s) de interesse em cada tecido. Quando o RNA total de determinado tecido é utilizado nos experimentos, mudanças na expressão gênica em específicos componentes deste tecido podem ser mascaradas pela contribuição de transcritos de outros tipos de células e componentes que não apresentam variação nos níveis de expressão, ou até mesmo que apresentam mudança em direção oposta. Uma outra situação similar seria um determinado tecido no qual não ocorre qualquer alteração nos níveis de expressão gênica em nenhum dos seus componentes em resposta a diferentes estímulos ou tratamentos, mas sim uma modificação nas proporções dos diferentes tipos de células que compõem este tecido. Como alguns genes podem estar expressos diferencialmente nos diferentes tipos de células que compõem o tecido, uma alteração na proporção destes tipos de células em resposta aos diferentes tratamentos pode levar à falsa conclusão de que estes genes apresentam expressão alterada em decorrência dos tratamentos. Desta maneira, ainda que a complexidade e os custos dos experimentos sejam aumentados, muitas vezes a utilização de populações de células específicas (obtidas, por exemplo, utilizando-se a técnica de dissecção por laser) é necessária (Smith & Rosa, 2007).

A escolha do tipo de lâmina a ser utilizada, entretanto, é geralmente restringida pela disponibilidade de alternativas para o organismo em estudo. Por exemplo, lâminas de cDNA estão disponíveis apenas para espécies para as quais ESTs já foram obtidas de bibliotecas de cDNA. No caso de lâminas com sondas de oligonucleotídeos, as mesmas só podem ser geradas se seqüências de DNA estão disponíveis e, ainda, um conjunto adequado de sondas de oligonucleotídeo só pode ser obtido para aquelas espécies com os genomas completamente seqüenciados. Desta maneira, tem-se uma diversidade maior de tipos de lâminas disponíveis para experimentos envolvendo humanos e organismos modelos (como animais de laboratório) do que para a maioria dos animais de interesse zootécnico ou animais selvagens.

Uma vez estabelecidos os grupos experimentais a serem considerados, bem como o número de amostras em cada grupo e o número de lâminas disponíveis, outro passo fundamental no delineamento experimental para ensaios com microarrays refere-se à estratégia de hibridização das amostras de RNA nas diferentes lâminas.

Existem ainda situações nas quais o número de amostras é um fator limitante, pelo custo ou dificuldade de obtenção das mesmas, como por exemplo, em estudos com clonagem ou doenças raras. Nestes casos, cada amostra biológica pode ser hibridizada em múltiplas lâminas para uma medida mais precisa dos níveis de expressão gênica em cada amostra. Experimentos desta natureza apresentam dois níveis de replicação, denominados replicação biológica (relativo às amostras independentes dentro de cada grupo experimental) e replicação técnica (relativa às medidas repetidas ou subamostras de cada amostra biológica).

Dentro deste contexto, os delineamentos experimentais mais amplamente utilizados para experimentos de microarray com hibridizações competitivas referem-se aos delineamentos circulares (ou em loop) e aos delineamentos com amostra referência (Kerr & Churchill, 2001; Yang & Speed, 2002). Estas duas estruturas básicas estão representadas na Figura 1, onde cada tratamento é indicado por uma letra maiúscula e cada lâmina é representada por um segmento, o qual conecta as duas amostras hibridizadas na mesma.

No delineamento com amostra referência ( Figura 1a), uma única amostra (denominada amostra referência, e representada aqui pela letra R) é hibridizada com cada uma das amostras de cada tratamento ou grupo experimental (A, B e C), semelhantemente a experimentos agronômicos em blocos incompletos com tratamentos comuns. Como comparação, em experimentos com microarrays cada bloco (lâmina) tem tamanho dois, e existe um único tratamento comum (a amostra referência). A comparação entre tratamentos se dá, então, de maneira indireta. Por exemplo, a comparação entre os tratamentos A e B é estimada usando-se informação referente à diferença entre os contrastes entre o tratamento A e a referência, e o tratamento B e a referência, isto é: (A - R) - (B - R).

Já em delineamentos circulares, ao invés da utilização de amostra referência, as amostras são pareadas alternando-se tratamentos ( Figura 1b) de maneira que diferenças entre tratamentos são estimadas por combinações entre comparações diretas e indiretas. Por exemplo, na Figura 1b os tratamentos A e B são comparados diretamente em uma das lâminas, além da comparação indireta a partir da conexão entre eles pelo tratamento C nas outras duas lâminas.

A principal vantagem de delineamentos com amostra referência é que eles são mais simples de serem conduzidos no laboratório. A desvantagem, entretanto, relaciona-se ao fato de que metade das observações refere-se à amostra referência, a qual não é de interesse direto no experimento (ela é utilizada simplesmente para corrigir os dados para o efeito de lâminas). Já o delineamento circular refere-se a uma estrutura mais complexa, na qual o pareamento e a marcação das amostras exigem um cuidado adicional. Entretanto, estruturas circulares são geralmente mais eficientes do que delineamentos com amostra referência (Kerr & Churchill, 2001; Yang & Speed, 2002; Tempelman, 2005).

A Figura 1 apresentada, entretanto, é uma simplificação destes dois tipos básicos de delineamentos para experimentos de microarray com hibridizações competitivas. Evidentemente, múltiplas amostras são necessárias para cada tratamento e, em cada lâmina, tem-se ainda que designar qual marcação será usada para cada amostra. A utilização de diferentes níveis de replicação (as chamadas replicação biológica e replicação técnica, como discutido anteriormente), bem como as diferentes maneiras para se marcarem as amostras em cada lâmina, gera uma imensa variedade de possíveis experimentos dentro destas duas estruturas básicas de delineamentos.

Como exemplos, na Figura 2 são representadas algumas alternativas de delineamentos com amostra referência para um experimento com três tratamentos (A, B e C) e seis lâminas. No primeiro caso ( Figura 2a), duas replicações biológicas de cada grupo experimental (isto é, amostras de RNA de duas unidades experimentais de cada tratamento) são hibridizadas com a amostra referência com inversão da marcação, ou seja, numa lâmina a amostra referência é marcada com Cy3 e na outra com Cy5. É importante ressaltar que no experimento ilustrado na Figura 2a, a amostra referência é na verdade constituída de amostragens independentes de um grupo controle, ou grupo referência. Esta situação é semelhante ao que ocorre em experimentos agronômicos com tratamentos comuns, nos quais o tratamento comum pode ser uma determinada variedade, e amostras (plantas) desta variedade específica são colocadas em cada bloco.

Em experimentos com microarrays, entretanto, uma mesma amostra de RNA pode ser fracionada e hibridizada em múltiplas lâminas (inclusive com diferente marcação). Desta maneira, um experimento com amostra referência pode ser conduzido como ilustrado na Figura 2b, no qual a amostra referência é constituída de uma única extração de RNA replicada em cada uma das lâminas. Uma outra diferença deste delineamento em relação ao experimento da Figura 2a é que a amostra referência está sempre com a mesma marcação (no caso, Cy3) e os tratamentos com a outra (Cy5). Nestas circunstâncias, existe um confundimento entre a diferença entre cada tratamento e a referência, e a diferença entre as duas marcações. O efeito de marcação, no entanto, se cancela quando efetuam-se as comparações indiretas entre tratamentos, isto é, em lâminas com o tratamento A tem-se comparações do tipo [(A + Cy5) - (R + Cy3)] e em lâminas com o tratamento B tem-se [(B + Cy5) - (R + Cy3)], mas quando se comparam os tratamentos A e B tem-se [(A + Cy5) - (R + Cy3)] - [(B + Cy5) - (R + Cy3)] = [A - B].

Como um terceiro exemplo, tem-se na Figura 2c uma outra alternativa de delineamento bastante usual na literatura, na qual cada replicação biológica é hibridizada duas vezes com marcação alternada (o chamado dye-swap, em inglês). Como este delineamento envolve replicação técnica de cada amostra, o dobro de lâminas é necessário para um mesmo tamanho amostral (em termos de replicação biológica) relativamente aos experimentos das Figuras 2a e 2b. Usuários deste tipo de delineamento experimental defendem que somente com dye-swap é possível se corrigir eficientemente os dados para o efeito de marcação. Outros pesquisadores, no entanto, incluindo os autores deste artigo, defendem que para um número fixo de lâminas (e em situações nas quais a disponibilidade de amostras biológicas não é um fator limitante), o aumento do número de replicações biológicas é geralmente mais vantajoso do ponto de vista estatístico do que a utilização de replicação técnica. Para uma detalhada discussão entre replicação biológica versus replicação técnica veja, por exemplo, Churchill (2002), Rosa et al. (2005) e Tempelman (2005). Especificamente com relação às diferentes estratégias para delineamentos com amostra referência, bem como a modelagem estatística de dados em experimentos desta natureza, consulte Steibel & Rosa (2005).

Assim como com o delineamento com amostra referência, inúmeras variações da estrutura circular também são possíveis, considerando-se diferentes níveis de replicação (técnica e biológica) e a maneira com a qual as amostras são marcadas. Por exemplo, na Figura 3 tem-se duas destas variações, as quais são comumente encontradas na literatura. Similarmente aos delineamentos ilustrados na Figura 2, tem-se aqui também um experimento com 3 tratamentos (A, B e C) e seis lâminas.

Na Figura 3a tem-se o chamado delineamento circular conectado. O termo 'conectado' refere-se ao fato de que cada amostra de RNA é hibridizada em múltiplas lâminas (neste caso específico, em duas lâminas). Veja que o delineamento representado nesta figura apresenta dois " loops", um com as amostras A ₁, B ₁ e C ₁, e outro com as amostras A ₂, B ₂ e C ₂. No primeiro loop, a amostra A ₁ é marcada com Cy3 e amostra B ₁ é marcada com Cy5 numa das lâminas, depois a mesma amostra B ₁ é marcada com Cy3 e hibridizada com a amostra C ₁, a qual é marcada com Cy5, e finalmente o loop se completa com a amostra C ₁ sendo marcada com a Cy3 e hibridizada com a amostra A ₁, a qual é agora marcada com Cy5. O segundo loop é elaborado de maneira similar, mas com marcações em ordem invertida. Por exemplo, a lâmina envolvendo os tratamentos A e B tem a amostra A ₂ marcada com Cy5 e amostra B ₂ marcada com Cy3, e assim por diante. É importante notar que neste delineamento da Figura 3a tem-se duas replicações biológicas para cada tratamento, com duas replicações técnicas de cada amostra.

A utilização de conexões entre lâminas utilizando-se replicações técnicas, ainda que bastante comum em experimentos encontrados na literatura, não é de maneira alguma necessária do ponto de vista estatístico, para a comparação entre médias de tratamentos. Neste sentido, na Figura 3b é apresentada uma alternativa de delineamento na qual há ainda certa circularidade na maneira pela qual as amostras são pareadas e hibridizadas nas lâminas, mas aqui é dada preferência para replicação biológica ao invés de replicação técnica. Veja que neste delineamento numa primeira lâmina tem-se a comparação de uma amostra do tratamento A com uma amostra do tratamento B (as quais são marcadas com Cy3 e Cy5, respectivamente, de maneira similar ao experimento da Figura 3a), mas numa segunda lâmina uma outra amostra do tratamento B é hibridizada com uma amostra do tratamento C. Neste caso, ainda com somente seis lâminas no experimento, tem-se agora quatro amostras independentes de cada grupo experimental, mas sem replicação técnica de qualquer amostra.

Tanto o delineamento da Figura 3a quanto o da Figura 3b são, na medida do possível, balanceados em termos do número de replicações para cada tratamento, lâminas e marcações, e até mesmo para certas combinações destes fatores, como por exemplo, tratamento x marcação. Existem vantagens e desvantagens para cada um destes delineamentos, mas do ponto de vista estatístico mais uma vez é geralmente recomendado priorizar-se replicação biológica. Para uma comparação mais detalhada em termos de eficiência e poder estatístico destas alternativas de delineamento, bem como a robustez destes delineamentos em relação à perda de lâminas (por exemplo, por problemas técnicos na condução das hibridizações no laboratório), veja, por exemplo, Rosa et al. (2005), Steibel & Rosa (2005) e Tempelman (2005).

Outra importante questão em experimentos com microarrays, a qual não é abordada neste trabalho, refere-se ao cálculo do poder estatístico e tamanho de amostras. Como mencionado anteriormente, muito freqüentemente o tamanho dos experimentos de microarray são definidos por restrições orçamentárias em termos do número de lâminas disponíveis. Nestes casos, busca-se uma otimização dos experimentos em termos do delineamento experimental para a maximização do poder estatístico e eficiência de tais ensaios. Exemplos de cálculos neste contexto são apresentados, por exemplo, por Rosa et al. (2005) e Tempelman (2005) num contexto de modelos lineares de efeitos mistos. Cui et al. (2005) apresentam também cálculos dos custos de experimentos em termos de replicações técnicas e biológicas. Dada a multiplicidade de testes que são efetuados em cada experimento de microarray, os quais geralmente envolvem milhares de genes, cálculos relativos a poder de teste e tamanho amostral para tais experimentos devem ser baseados, por exemplo, no conceito de taxa de falsos positivos (FDR, do termo em inglês False Discovery Rate), como apresentado por Gadbury et al. (2004), Muller et al. (2004), Dobbin & Simon (2005), Hu et al. (2005) e Jung (2005).

A análise estatística de dados de microarray geralmente envolve três componentes: 1) obtenção dos dados e eliminação de valores espúrios; 2) pré-ajuste dos dados para efeitos sistemáticos (este ajuste é conhecido por normalização dos dados); e 3) análise estatística propriamente dita, a qual geralmente utiliza ferramentas metodológicas relativas a testes de significância, análise discriminante ou análise de agrupamento.

A obtenção dos dados refere-se à análise de imagem de cada lâmina para a extração dos valores de intensidade fluorescente em cada spot, os quais são medidas indiretas da abundância de transcritos de RNA dos genes representados pelas sondas. Existe uma série de procedimentos e programas computacionais disponíveis para a leitura das imagens para diferentes tipos de lâminas. Para lâminas de cDNA ou oligos longos utilizando o sistema de hibridizações competitivas, os valores de intensidade são geralmente obtidos a partir da classificação de cada pixel da imagem como pertencente a determinado spot (i.e., sonda) ou a espaços vazios entre spots, denominados foreground e background, respectivamente. Posteriormente, para cada lâmina, os pixels de foreground relativos a cada spot são combinados em alguma medida resumo, como média, mediana ou intensidade total, as quais muitas vezes são ajustadas para valores de background. Este mesmo procedimento é efetuado tanto para as intensidades relativas à Cy3 quanto aquelas relativas à Cy5, de maneira que para cada spot têm-se duas medidas de intensidade, das quais obtém-se uma medida da expressão relativa de cada gene nas duas amostras hibridizadas em cada lâmina.

Onde AvDiff g é a medida de expressão relativa ao gene g, PM gi e MM gi são as intensidades PM e MM relativas ao j-ésimo par de probes (j=1,2,...,K) do gene g.

Após a obtenção dos dados e eliminação de valores espúrios em decorrência de possíveis problemas na fixação das sondas, marcação das amostras, hibridização etc., um ajuste geral dos dados é geralmente necessário antes de uma análise estatística mais formal dos mesmos. Este processo de correção dos dados é geralmente denominado normalização, e considera ajustes para diferenças entre lâminas (em termos de média ou mediana e variância), efeito de marcação, etc. Alguns procedimentos de normalização dos dados baseiam-se em somente alguns genes presentes nas lâminas (como genes controles ou genes com expressão supostamente constante nos diversos grupos experimentais), outros baseiam-se em todos os genes e utilizam procedimentos estatísticos robustos, com a suposição de que a maioria dos genes é não diferencialmente expressa entre os grupos experimentais.

Onde y smgtr representa as intensidades de expressão, na escala logarítmica; µ é uma constante geral; S s, M m e (SM) sm são os efeitos de lâminas, marcação (Cy3 e Cy5), e a interação entre lâminas e marcação, os quais são genericamente denominados como fatores globais; G grefere-se aos efeitos dos genes; (SG) sg representa a interação entre genes e lâminas; (MG) mg refere-se a efeitos de marcação específicos para cada gene; (TG) tg representa os efeitos de tratamentos na expressão de cada gene (e são portanto os efeitos de interesse); e e smgtr é um termo residual com variância .

Onde os termos são como definidos no modelo (1). A partir deste modelo de normalização global são obtidos os resíduos estimados, ê smgtr. O segundo estágio compreende uma série de modelos específicos para cada gene, os quais são expressos como:

Onde µ g, S sg, M mg e T tg são constante geral, efeito de lâmina, efeito de marcação e efeito de tratamento, específicos para cada gene g. Componentes de variância, também específicos para cada gene, são estimados para os efeitos aleatórios de lâmina e resíduo. Outros fatores devem ainda ser incluídos no modelo (veja Rosa et al. (2005) para uma discussão neste sentido), dependendo da estrutura de tratamentos (por exemplo, experimentos fatoriais) e do delineamento experimental.

Um outro problema bastante interessante na análise de dados de ) microarray refere-se ao fato de que múltiplos testes são efetuados em cada experimento (um para cada gene), de maneira que um grande número de falsos positivos é esperado mesmo em situações nas quais não há qualquer expressão diferenciada entre os grupos experimentais. Para se entender melhor este problema, basta lembrar que para determinado nível de significância a adotado, a probabilidade de rejeição errônea de uma hipótese nula (erro tipo I) é a. Da mesma maneira, se forem testados múltiplos genes, e assumindo-se que estes são expressos independentemente, tem-se probabilidade [1-(1- α m] de pelo menos uma falsa rejeição, onde m é o número de testes efetuados. Por exemplo, se for adotado α = 0,05 para determinado estudo de expressão gênica tem-se 5% de chance de se detectar um específico gene como diferencialmente expresso em dois grupos experimentais quando na verdade não existe diferença entre os grupos. Se 10 genes (independentes) forem considerados no estudo, tem-se aproximadamente 40% de chance de pelo menos um falso positivo. Esta probabilidade sobe para algo em torno de 64% no caso de 20 genes, e ultrapassa 90% com apenas 45 genes.

Outra maneira de se pensar este problema de testes múltiplos em experimentos com = 0,05. Isso significa que a probabilidade de obtenção de p-valores menores do que 0,05 é 5%, como conseqüência do fato de que p-valores obtidos a partir de múltiplos testes independentes, todos sob a hipótese de nulidade, apresentam distribuição uniforme entre 0 e 1 (Allison microarrays é que o número esperado de falsos positivos é igual a α x m. Por exemplo, suponha um experimento com microarrays no qual cada amostra de RNA é subdividida e hibridizada em duas lâminas, as quais são então divididas aleatoriamente em dois grupos (A e B), de maneira que cada animal tem uma lâmina no grupo A e outra no grupo B. Nestas circunstâncias tem-se um experimento no qual não existe qualquer diferença real na expressão gênica entre os dois grupos experimentais. Assim, para um experimento considerando-se m = 10.000 genes, por exemplo, espera-se que 500 deles sejam detectados como diferencialmente expressos se α et al., 2002).

Existem vários procedimentos disponíveis para o ajuste do nível de significância quando múltiplos testes são efetuados num experimento, os quais variam em relação às suposições consideradas (por exemplo, independência entre os testes) e o tipo de controle desejado do erro tipo I. O método mais simples e utilizado para a correção do nível de significância em ensaios com testes múltiplos é denominado correção de Bonferroni, o qual controla a probabilidade global de qualquer falso positivo (i.e., um ou mais falsos positivos) no experimento. Para se aplicar a correção de Bonferroni, simplesmente especifica-se o nível de significância geral a desejado, o qual é então divido pelo número de testes a serem realizados. Este nível de significância corrigido α * = α /m é então utilizado como limite de significância para cada um dos testes efetuados.

No caso de microarrays, entretanto, dada a grande quantidade de genes estudados (da ordem de milhares), a correção de Bonferroni passa a ser muitíssimo conservativa, diminuindo drasticamente o poder de teste para a detecção de genes diferencialmente expressos. Além disso, num experimento com tantos genes e testes considerados, dificilmente é este o tipo de controle desejado de erro tipo I e, em geral, os pesquisadores aceitam maiores riscos em termos de falsos positivos para diminuir a chance de que importantes diferenças em expressão gênica não sejam detectadas (erro tipo II, relativo a falsos negativos).

Um critério menos restritivo para múltiplos testes refere-se à taxa de falsos positivos (FDR), definida como a proporção esperada de falsos positivos entre todos os testes significativos (Benjamini & Hochberg, 1995), i.e., E[V/(V+S)] = E[V/R], onde os valores V, S e R são definidos na Tabela 1. Desta maneira, ao invés de se controlar a probabilidade de V > 0, como no caso da correção de Bonferonni, o FDR controla a proporção de hipóteses nulas erroneamente rejeitadas entres todas as hipóteses rejeitadas para um dado experimento. Um procedimento de FDR cada vez mais comum na literatura refere-se ao conceito de q-valor, definido como o menor valor de FDR para o qual uma determinada hipótese seria rejeitada (Storey, 2003). Para uma extensiva revisão dos diferentes métodos para controle do erro tipo I com testes múltiplos veja, por exemplo, Dudoit et al. (2003). Programas computacionais disponíveis gratuitamente para análises de experimentos de microarray, incluindo testes de significância utilizando-se procedimentos baseados em estimadores de encolhimento (como os programas LIMMA e R/MAANOVA) e métodos de FDR podem ser encontrados na página de web do Bioconductor ( http://www. bioconductor.org/).

A comparação dos padrões de expressão gênica entre grupos experimentais não se limita à geração de uma lista de genes supostamente diferencialmente expressos, obtidos a partir de testes de significância. Procedimentos complementares de análise estatística e bioinformática são geralmente utilizados, como a análise de agrupamento para o estudo de genes co-regulados, e o estudo de listas de genes super-representadas (Hosack et al., 2003). Por exemplo, os genes podem ser classificados em termos de processos metabólicos ou grupos ontológicos ( gene ontology) gerando tabelas de contingência 2 x 2, uma para cada processo metabólico ou grupo ontológico. No exemplo ilustrado na Tabela 2, tem-se R genes detectados como diferencialmente expressos e (m - R) genes tidos como similarmente expressos entre os grupos experimentais, de um total de m genes considerados. Estes mesmos m genes são então classificados como pertencentes ou não a determinado grupo de genes (baseado, por exemplo, em ontologia ou informação relativa a processos metabólicos), sendo que no exemplo m G e genes foram classificados como pertencentes ou não ao grupo de interesse, respectivamente. A seguir, as freqüências m GD m D e / são comparadas, para cada grupo ontológico, utilizando-se por exemplo testes de qui-quadrado e/ou teste exato de Fisher, para a identificação de grupos de genes com proporções significativamente maiores de genes detectados como diferencialmente expressos (Beissbarth & Speed, 2004).

Exemplos de aplicação na pesquisa zootécnica

Devido sua característica prospectiva e capacidade de analisar milhares de genes simultaneamente, a tecnologia de microarrays está sendo cada vez mais utilizada em pesquisas da área animal, notadamente nos estudos que envolvem características de herança complexa e/ou de baixa herdabilidade.

Aplicações dessa tecnologia podem ser encontradas em diferentes áreas da zootecnia, incluindo crescimento e metabolismo, reprodução, resposta imune a doenças e parasitoses, e resposta a fatores de estresse não-infecciosos como restrição alimentar, exposição a elementos tóxicos e outras condições ambientais desfavoráveis. Nesta secção são apresentados alguns exemplos dessas aplicações.

Na tentativa de entender os mecanismos moleculares envolvidos na resposta hepática aos lipopolissacarídeos (LPS) produzidos por bactérias gram-negativas, Cao et al. (2006) utilizaram um microarray de cDNA bovino contendo 109 seqüências de genes associados com o processo inflamatório, sistema endócrino e resposta imune para analisar a expressão gênica no fígado de ovinos desafiados com diferentes dosagens de LPS de E. coli 0111:B4. Os autores não apenas identificaram diversos genes que desempenham funções importantes no processo inflamatório, mas sugeriram também que a resposta aos LPS é dependente de vários fatores, dentre os quais o intervalo de amostragem do tecido, a dosagem e o tipo de LPS utilizado. Abordagem semelhante foi utilizada por Gu & Bertone (2004), que produziram microarrays contendo sondas de oligonucleotídeos representando 3.098 genes de eqüinos e avaliaram o padrão de expressão gênica em sinoviócitos de cavalos adultos desafiados com LPS de E. coli 055:B5 w . Além de identificar um conjunto de 102 genes cuja expressão foi modulada pela endotoxina, os autores descobriram indícios de novos padrões de sinalização e adesão celular que abrem perspectivas para novas pesquisas.

Os neutrófilos são células sanguíneas leucocitárias de ação fagocítica, que estão presentes em fenômenos agudos de inflamação devido ao seu alto potencial de diapedese e rápida velocidade de migração. No entanto, possuem um curto tempo de vida (seis horas). Desse modo, Madsen et al. (2004) usaram microarrays de cDNA com 1.056 genes provenientes de leucócitos ( http://cafg.msu.edu) para estudar as mudanças induzidas pelo parto na expressão gênica de neutrófilos obtidos antes, durante e depois do parto de vacas Holandesas e identificaram diversos genes diferencialmente expressos cujas funções estão relacionadas com a regulação da apoptose. Baseados nestes e também em outros resultados de experimentos biológicos, os autores sugeriram que o parto em bovinos pode prolongar a sobrevivência de neutrófilos.

A adeno-hipófise ou glândula pituitária anterior exerce função preponderante na regulação do sistema endócrino, sintetizando e secretando os hormônios tróficos que modulam as secreções de outras glândulas endócrinas e, portanto, está diretamente relacionada com o controle de diversos processos fisiológicos, dentre os quais o crescimento e o metabolismo.

Abordagem similar foi utilizada por Cagnazzo et al. (2006) que investigaram as diferenças nos perfis de transcritos músculo-específicos durante o desenvolvimento pré-natal de suínos das raças Duroc e Pietrain, que diferem na taxa de crescimento e na composição da carcaça na fase adulta, verificando que nos estágios iniciais do desenvolvimento (14 a 49 dias de gestação), os embriões da raça Duroc apresentaram maior expressão de genes relacionados à miogênese, enquanto que nos estágios mais avançados (63 a 91 dias de gestação), a expressão desse grupo de genes foi maior nos embriões da raça Pietrain.

A tecnologia de microarrays também tem sido útil para decifrar a complexa interação existente entre os componentes químicos das dietas (nutrientes) e o material genético dos indivíduos (genótipo), ou seja, dos mecanismos moleculares envolvidos na interação nutrientes-genótipo e a maneira como estas afetam o fenótipo (Kaput & Rodriguez, 2004).

De forma similar ao que está ocorrendo com as demais espécies exploradas pela zootecnia, a tecnologia de microarrays começa a ser utilizada em estudos com insetos utilizados em sistemas de produção comercial, como o são a sericicultura e a apicultura. Entretanto, essas pesquisas iniciais não estão focadas diretamente nas questões relativas à produção, mas sim em outros aspectos biológicos, uma vez que tais insetos também são utilizados como modelo de estudo em diversas áreas da biologia.

Como pode ser observado nos exemplos que foram apresentados, a tecnologia de microarrays está reformulando a maneira tradicional de se fazer pesquisa na área de zootecnia, pois permite que questões relevantes sejam abordadas sob uma perspectiva na qual genética e fisiologia estão totalmente integradas, favorecendo o surgimento de novos paradigmas científicos que passam a nortear os rumos das pesquisas dessa área.

Neste sentido, é preciso destacar o caráter prospectivo da tecnologia de microarrays que, ao estabelecer associações entre grupos de genes e características fisiológicas, também define a ligação que existe entre o genoma e os processos biológicos envolvidos na manifestação do fenótipo, gerando novas hipóteses para serem testadas em estudos posteriores, mediante uso de abordagens mais direcionadas.

Uma vez conduzidos os experimentos com microarray, o desafio seguinte refere-se à análise dos dados obtidos. Primeiro, dadas as dimensões e complexidade de tais conjuntos de dados, metodologias computacionais apropriadas são necessárias para a eficiente armazenagem e manuzeio dos arquivos de dados, principalmente para experimentos com grande número de lâminas ou para a análise conjunta de múltiplos experimentos independentes. Segundo, métodos estatísticos específicos são necessários para uma análise apropriada dos mesmos, principalmente em relação à multiplicidade de testes efetuados em cada experimento, a qual pode gerar uma taxa de falsos positivos inadvertidamente alta se não for modelada objetivamente.

Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pela concessão da bolsa de doutorado sanduíche no exterior ao aluno Leonardo B. Rocha.

WILLIAMS, T.D.; DIAB, A.M.; GEORGE, S.G. estradiol. et al. Gene expression responses of European flounder ( Platichthys flesus) to 17- β Toxicology Letters, v.168, p.236-248, 2007. [ Links ]

Correspondências devem ser enviadas para: grosa@wisc.edu

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Estudos de expressão gênica utilizando-se microarrays: delineamento, análise, e aplicações na pesquisa zootécnica

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Estudos de expressão gênica utilizando-se microarrays: delineamento, análise, e aplicações na pesquisa zootécnica Microarray gene expression studies: experimental design, statistical data analysis, and applications in livestock research Guilherme Jordão de Magalhães RosaI; Leonardo Bernardes da RochaI, II; Luiz Roberto FurlanIII IDepartment of Dairy Science, University of Wisconsin, Madison WI, USA 53705 email: grosa@wisc.edu IIDepartamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista UNESP, Jaboticabal-SP.