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Ya que has logrado preparar muy juiciosamente tu mezcla de reacción de PCR, ahora vamos a realizar el genotipado de tres individuos: Laura 👩 , Valentina 👩‍🦱  y Miguel 👦🏽

En el laboratorio remoto pasado vimos los diferentes métodos para extraer ADN genómico, entre ellos protocolos para extraer ADN humano de sangre o saliva. Con muy poca cantidad de ADN empleado como molde (10 a 100 ng) en cada reacción se logra una amplificación exitosa.

Para realizar el genotipado, sigue estas instrucciones:

Descarga una a una las secuencias de ADN molde de los 3 individuos en tu computador haciendo click en los íconos siguientes:

Laura: 👩
Valentina: 👩‍🦱
Miguel: 👦🏽
(Asegúrate de que tengan el nombre de cada individuo).

Dirígete al siguiente enlace para PCR virtual haciendo click aquí

sube una a una las secuencias descargadas (formato .txt) haciendo click en el botón "upload". (sé paciente, el software a veces falla...)

haz click en PCR y pega tus dos secuencias de primers Fw y Rev que diseñaste en uno de los puntos anteriores, selecciona uno de los ADN moldes y haz click en el botón "amplify"

Fíjate en el resultado: si aparece que no hay amplificación, entonces debes revisar tus primers nuevamente o tu secuencia de ADN molde, y vuelves a empezar pegando las secuencias de primers corregidas hasta que aparezca  un cuadrito con posición y longitud del amplicón.

Anota los tamaños de los amplicones (fragmentos amplificados) para cada individuo y discute qué genotipo tiene cada uno en el locus PV92.

🧠¿Cómo crees que se haría el "revelado" del genotipado tras la amplificación por PCR realizada?
Esto lo veremos en la próxima práctica...😉

sólo si alcanza el tiempo: Haz click en el número azul de posición: aparecerá la secuencia completa del amplicón, y un link llamado Blast.
Al hacer clic en ese link, te dirige a una búsqueda por homología en una base de datos pública de secuencias génicas: fíjate bien en la secuencia homóloga encontrada: si es el locus PV92 del cromosoma 16 , entonces todo salió bien !!! Es una forma de verificar la especificidad de tus primers como si pudieras secuenciar el producto amplificado y verificarlo...

¡Felicitaciones!, esperamos que te haya servido y gustado esta práctica remota 👏🏽😉🦾

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Para realizar la PCR es importante contar con todos los materiales, reactivos e insumos para que el procedimiento sea exitoso. No olvides tener muy bien ubicados y marcados todos los tubos. Los componentes que serán utilizados para la PCR deben estar a baja temperatura (en hielo), para garantizar su estabilidad y evitar su degradación y contaminación.

A continuación, se listan los componentes típicos de la mezcla de reacción presentados en forma de soluciones  stock:

- Agua destilada desionizada esteríl (H2Odd).

- Tubo con la mezcla de los cuatro desoxinucleótidos (dNTPs) a una concentración de 10 mM cada uno

- Tubo con primer Alu forward (Fw) a una concentración de 10 µM

- Tubo con primer Alu reverse (Rev) a una concentración de 10 µM

- Tubo con Cloruro de magnesio ( MgCl2) a una concentración de 25 mM

- Tubo con Buffer para PCR a una concentración 2X

- Tubo con la enzima Taq DNA polimerasa a una concentración de 1 U/ µl

- Tubo con ADN humano extraído y cuantificado espectrofotométricamente.

Con base en la información anterior, vamos ahora a calcular los volúmenes que debemos emplear para obtener una mezcla de reacción de PCR conocida como mastermix o mezcla maestra.
El master mix debe incluir todos los componentes de la reacción excepto el ADN, que será el último componente que se añadirá. Generalmente hay más de una muestra a genotipar, más el control negativo (reacción sin ADN molde), por lo que una buena práctica de laboratorio consiste en preparar un sólo master mix para todas las muestras a analizar y repartir esa mezcla en los diferentes tubos.
Sólo después de esta repartición es que se añadirá a cada tubo una muestra de ADN molde diferente.

Descarga ahora la siguiente plantilla word, y realiza los cálculos indicados en la misma para la correcta preparación del mastermix para genotipado del locus PV92:
Enlace a la plantilla: 📝

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Vamos a continuación a diseñar los dos primers delantero (Fw) y reverso (Rev) necesarios para amplificar el locus PV92 y que permitan realizar el genotipado, es decir detectar si hay inserción o no.

Esta es la secuencia del locus PV92, descárgala aquí:📝

🧠 Con base en esta secuencia diseña dos primers, uno Fw y otro Rev que te permitan amplificar el locus, pero ojo🤔 , ten en cuenta los posibles sitios señalados de inserción del elemento Alu para el diseño, de modo que los primers que propongas sirvan para genotipar...

Igualmente debes elegir dos primers que no varíen en más de 5 grados entre sus respectivas Tm (temperatura de fusión).
Para esto, verifica rápidamente la Tm de cada uno de tus primers con esta herramienta :
(haz clic en el ícono) 🧬
Discute tu propuesta con tus compañeros y profesor, conserva bien las secuencias de tus dos primers para  la última actividad.

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El locus PV92 es uno de los 7000 loci Alu específicos de humanos y es polimórfico o más correctamente dimórfico: la razón se debe a que en el locus puede haber o no inserción de un elemento Alu, por lo tanto sólo hay dos alelos posibles: presencia o no del elemento en el locus. Sin embargo, como somos organismos diploides, heredamos un alelo paterno y otro materno y entonces las combinaciones permiten generar hasta 3 haplotipos por individuo:

🧬 elemento Alu ausente en ambos alelos (homocigoto -/-)

🧬elemento Alu presente sólo en uno de los dos alelos (heterocigoto -/+)

🧬elemento Alu presente en ambos alelos
(homocigoto +/+)

🧠 ¿Cómo poder entonces identificar el genotipo en cada alelo del locus y deducir el haplotipo?

Mira con detenimiento la anterior figura que representa  las dos posibilidades existentes de variación (alelos) en el locus PV92 de uno de los cromosomas de un individuo (si le haces clic, se agranda) e intenta entender cómo funcionará el genotipado basado en PCR. ¿Qué amplificaciones se obtendrían según las posibles combinaciones de alelos que pueda tener un individuo?🤔

Discutir con el profesor

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🕵️‍♂️ Letras A a D: Averigua cómo es el mecanismo de transposición de los transposones de cola poliA.

🕵🏾‍♀️ Letras E a I:  Buscarás qué son las secuencias SINEs en nuestro genoma, su abundancia  y qué las diferencia de las secuencias LINEs.

🕵🏻‍♀️Letras J a O:  indagarás acerca de qué enfermedades hereditarias o tipos de cáncer se han asociado con  inserciones de elementos Alu.

🕵🏻‍♂️ letras P a Z:  buscarás cuántas copias de elementos Alu existen en forma dispersa en nuestro genoma,  qué tamaño en pb tiene un elemento Alu, y qué porcentaje de nuestro genoma representan estos elementos Alu en su totalidad.