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The HRI branch of the integrated stress response selectively triggers mitophagy

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Engineering a membrane protein chaperon to ameliorate the proteotoxicity of mutant huntingtin

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A liquid-like coat mediates chromosome clustering during mitotic exit

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Q1:Ki-67鄰酸化使得染色體彼此間相離，是由於帶電性產生的相斥還是有其他原因所導致？

A1:磷酸化能改變蛋白質的帶正電性，因此其主要使染色體互相分離的原因是主要是由帶電性產生的相斥導致

Q2: 和Ki-67結合的pre-mature RNA是有哪一種特定的RNA嗎，還是是隨機任一種？

A2: 目前能確定的就是那是pre-mature RNA無法確定是特定哪一種

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Q:研究採用「nocodazole ＋ flavopiridol」的方式强迫細胞退出有絲分裂，以利觀察 Ki-67；尚未呈現正常條件下的實際差異或對照數據。文中並沒提到是否做過不加藥處理的對照試驗？

A:為了只專注在Ki-67上，文中皆為採用nocodazole ＋ flavopiridol的方法，所以紡錘體的出現可能會造成其他變化，對於Ki-67如何與正常染色質互相協調，還有待探討。

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Q: Ki-67和RNA之間有什麼關聯？

A: Ki-67可以recruit RNA到condensate中，並進一步協助染色體完成聚集。

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Q: fig 1 I~K中為什麼只有J突然換成了以Ki-67 KO cell作為背景，I跟K都是以Ki-67 WT cell作為背景再加入Ki-67ΔLR?

A:等待作者回答

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Q:目前除了Ki-67，有發現其他蛋白也參與染色體的聚集分離嗎?

A:除了本篇提到的Ki-67，目前還有發現condensin以及cohesin也會參與在染色體的聚集分離。

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Q:是否不一定要通過dephosphorylation CP也可以通過直接改變電性影響Ki-67與染色體的交互作用與condensate formation

A:對，因為在研究中作者還沒有做出實驗可以直接證明染色體的聚集和Ki-67 condensate formation是因為 CP dephosphorylation導致的

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Q：想請問Full-length Ki-67(139E)由於為強制phosphorylation的狀態，想請問他是否可以再進行實驗驗證(或者有先前文獻指出)有哪些特異的位點是正常生理狀態下phosphorylation的site。(照理來說並不會全部都磷酸化)

A：作者並未詳細提到這部分，確實在正常生理情況下並不會有所有位點都產生磷酸化的情況。

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Q:文中提到，當 Wnt11 或 Ror2 被抑制時，MP 細胞會產生應力纖維，這種現象與衰老之間有什麼關聯？

A:應力纖維並分直接與老化有關係，而是代表肌肉損傷的一種指標

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Q:此篇 Paper 除了看磷酸化外還有看其他可以改變電性的修飾嗎?

A:有沒有其他修飾不確定，但作者在此篇文章除了磷酸化沒有看其他的修飾

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Q1: 文中提到甘油可以誘導肌肉退化，有點好奇甘油是如何引起肌肉退化，其中機制原因是甚麼?

A1: 待講者補充

Q2: cKO的c代表什麼?

A2: c代表condition，knock out小鼠是在有注射tamoxifen的狀況下才會產生knock out的作用

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Q: fig 4a的tSNE 1和tSNE 2是指什麼呢？

A: 當細胞距離越近代表相似度越高，這兩個數值其實是相對值，0當成最中間，數值越大代表離得越遠。tSNE是一種變換高維數據的座標軸，可以把高維空間分佈到x和y軸。

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Q:文中使用兩種不同方法建立模型，Ror2在甘油誘導的肌肉退化中比起Ctx對IMAT累積有顯著影響，想問甘油及Ctx作用上的差別？

A:Ctx建立的是急性肌肉損傷模型，而甘油則是慢性肌肉損傷模型，對於兩種處理造成肌肉損傷詳細的mechanism待講者回去做功課後回答。

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Q:作者建立Ror2 flox/flox:Pdgfra CreER/+的用意是什麼

A:Ror2 flox/flox 為 Ror2 基因兩側有 loxP的小鼠，在有Cre recombinase activation的情況下，loxp之間的基因可以被剃除，而Pdgfrα-CreER可以使Cre表現在MPs中，以tamoxifen 控制Cre的activation可以看Ror2在MP中的功能

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Q1:Tamoxifen在小鼠實驗的作用是什麼？注射三次有什麼特殊功用嗎？

Q1:Tamoxifen可促使實現 MPs 特異性的 Ror2 基因敲除。使cKO的效果更顯著。

Q2:而Pdgfra這段promoter對細胞的特異性是如何運作的？

A2:待講者整理

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Q:想知道作者在整個實驗過程中特別選用TA muscle有什麼原因嗎？

A:可能原因如下。1、先前研究中常用 :TA muscle在肌肉退化和再生研究中經常被研究，因為它易於注射glycerol或cardiotoxin。2、結構均勻單一:其相對均勻的結構使其更容易在組織學研究中分析肌纖維橫截面積、纖維化和脂肪堆積

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Q: SPiDER-βGal 染色如何評估 MPs 細胞是否衰老以及詳細機制

A:在衰老細胞內，由於 Lysosome 增加，βGal 表達上升，可催化 SPiDER-βGal 進行水解反應產生螢光訊號被偵測。

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Q:為什麼 CCCP 造成的膜電位的喪失會導致 Parkin ?

A:CCCP 會攜帶質子進入內膜，使膜電位下降，而導致粒線體受損後氧化壓力增加，造成 Parkin ，但更詳細機制可能要講者補充

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Q1: figure 1中作者使用BFA-1來抑制mitophagy的目的是什麼?

A1: 作者想雙重確認DFP誘導的的PINK1/Parkin pathway有成功的導致mitophagy

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Q: 這篇文獻的co-localized實驗是在酸性環境下進行的嗎?還是要特別調pH?

A: 不是，此時已經在粒線體中，並不是lysosome，所以也不用特別調pH。

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Q:為什麼作者在figure3D選擇用CReP看p-EIF2a的去磷酸化對mitophagy的影響，而不是用同樣可以去磷酸化p-EIF2a的GADD34

A:因為GADD34只有在ISR被啟動時才會高度表現，而CReP在細胞正常狀態下就可以調控p-EIF2a濃度，因此可以證明在figure3D的mitophagy會降低不是因為ISR的影響，而是因為p-EIF2a被去磷酸化

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Q:作者是如何確保粒線體fractionation的純度使其不會受到細胞質的污染而產生偏差？

A:將去除細胞核的細胞利用sucrose進行比重分層，最下層的就會是粒線體。由於是用比重分，所以純度不高，只是該部分粒像體比例較高，還是有可能會受到細胞質的影響。

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Q:會不會跟阿茲海默症相關？以及你認為這種xm染色體在男性身上如果被高度表現是否也會產生這種記憶認知變差的問題？

A:阿茲海默症有可能有相關，這要看基因方面的表達。因為男性的Xm都是由maternal所提供，因此若是都表達Xm Chromosome的話則也會有這方面的問題。

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Q: ABCB7是如何影響DELE1的?

A: ABCB7為運輸 Fe-S cluster 的關鍵因子，而在iron chelation時，Fe-S cluster的不足會影響TOM/TIM channel使DELE1無法進入粒線體基質被degrade，使DELE1停留在粒線體內外膜間隙中被OMA1切割後釋放出s-form DELE1到粒線體外活化HRI kinase啟動ISR

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Q: 想問 fig 3 的 c 圖右側的 gene 和什麼有關或主要參與在哪些 pathway?

A:主要都和免疫有關

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Q:HRI在不同cell type中是否是走相同的pathway?

A:是相同的，在這篇作者所使用的cell line分別為子宮頸癌及白血病的細胞株，所以是走相同的pathway。

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Q:為什麼在ISR的四個分支之中，只有 HRI這會觸發選擇性的粒線體自噬？它相較於其他分支具備了哪些關鍵差異？

A:因為其他分支(PERK、PKR、GCN2)雖然也能p-EIF2α，但只有 HRI 所生成的 p-EIF2α會明顯累積在粒線體上。以及HRI 被 OMA1/DELE1 所活化，這一通路直接來自粒線體感知到壓力的反應，像是 DFP 或 CCCP 引發的粒線體損傷。

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Q: Fig 3d中藍色的內圈是指什麼？

A: 內圈是把fig 3c中篩選出的11個基因呈現出來，原本想看這些基因所在的位置有沒有特別，但結果來看是平均分佈的。

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Q:為何作者特別聚焦在海馬迴的表觀遺傳時鐘，而未延伸到其他區域進行測試？

A:海馬迴擔當著關於記憶，以及空間定位的作用，且在X 偏斜之其他細胞例如肌肉細胞等，未有明顯差別

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Q:粒線體在發生mitophagy時，是如何選要走HRI還是PINK1/PARKIN路徑？

A: 觸發兩個的路徑的壓力種類不同，觸發PINK1/PARKIN的主要是粒線體膜電位的改變，觸發HRI的主要是缺氧

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Q:figure2中老化會如何影響Epigenetic age of blood?

A:待講者補充資料

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Q:Figure 3C中，Z score中的0是以什麼為基準，能看到Xm與Xp中基因表達的上調及下調？

A:將Xm與Xp中基因表達量取平均值，以平均值為零，尋找在Xm與Xp上調及下調的基因。

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Q:Figure 6E 中的 shCENPF + USP4 仍出現轉移，那 USP4 的促轉移效果是不是不完全依賴 CENPF？這樣會不會跟作者的結論『USP4 是透過穩定 CENPF 促轉移』這個結論牴觸？

A:KD就只是降低表達量，還是會有CENPF的表達，所以還是促進轉移。

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Q:APEX2 在活化後能標記周遭許多蛋白質，研究團隊如何真正標記到需要之蛋白質(MED1、FUS)

A:APEX2被設計成只與被標記的binding，而作者為了更近一步確認結合之專一性，還有另外做實驗確認結合之蛋白質種類，結果顯示為結合專一性高

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Q: 在結果圖3的實驗中，作者分別從condensate進MED1和FUS的蛋白質中各挑出了三個蛋白，請問挑選是依據甚麼挑選出這三個蛋白?

A: 作者在前一個實驗中分析出了前10%的partitioned ratio，猜測是從這前10%當中最高的去做挑選

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Q: 想請問 Transwell assay 為什麼上面沒有加 serum 下面有加 serum ?

A:驅使細胞可以往有營養物質的方向移動

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Q:Fig. 1 B，作者有無試過如果只突變一位點的話會有甚麼樣的效果

A:有試過，但與WT沒兩樣

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Q:在fig 2g中得到會與MED1 interaction的四種蛋白質為何在後續實驗中是輪流出現驗證而非全部都進行驗證?

A:作者會針對想研究的特性去特別挑選出實驗所使用的蛋白質。例如在fig 3c中，因為需要對序列進行更動，而HTATSF1被研究的較多，IDR序列較明確，所以選用其進行實驗。

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Q:想問 cell-based Lac-APEX method 和 cell-free extract method 有什麼差別?

A:兩者的差別在於一個是 in vitro 一個 in vivo

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Q:動物模型中，論文如何定量測量肝臟中轉移病灶的數量？

A:未特別說明如何定量，但有提到為人工，多次數病灶數量。

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Q: 在第三個結果圖中，作者將USP4的C311位點胺基酸替換掉來，為何選擇替換的胺基酸是Serine?

A: 因為cysteine結構中有S-H，替換成Serine後較不容易形成共價鍵也就是說不太和CENPF交互作用，透過這樣的方法來確定是否是透過這個位點來調控CENPF

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Q: 圖2A為什麼要看shCENPF1和shCENPF2？

A: 想看他有沒有脫靶效應，所以又做了CENPF2這個knockdown的組別。

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Q: APEX有提到兩種不同方法Proximity Biotinylation 和 Electron Microscopy，這兩種方法上的差異是什麼，作者為什麼選用Proximity Biotinylation?

A: 同樣都是透過APEX標定目標的蛋白，只是兩個方法是使用不同的substrate，Proximity Biotinylation 是使用biotin-phenol，Electron Microscopy則是使用DAB，且是用電子顯微鏡進行觀察，但作者在本篇並未提到為什麼是使用Proximity Biotinylation。

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Q:是同類型的IDR偏好進入的condensate都相同嗎？還是在不同細胞或蛋白質中的偏好會有所不同？

A:本篇作者想表示的應是只要是同類型的IDR就可以進入同類型的comdensate，但他還沒有在其他蛋白質中確認過

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Q:作者在Figure2開始用三個不同的cell line，是這三種有什麼特別的不同嗎？

A:這三種細胞分別是大腸癌不同癌症階段的細胞，SW480是中早期，DLD1是中晚期，而HCT116是具侵略性的晚期大腸癌細胞

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Q: figure 6A的replace charge blocks是指把哪部分charge residue的換掉，還是全部序列中的charge全部換掉？

A: 看補充資料中序列應該是全部都換掉

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Q: CRC可能轉移到不同器官，那在spleen injection後的老鼠觀察肝臟腫瘤是否存在著機率問題，造成結果不公平？

A:不會不公平，因為隨著血流方向，脾臟後所到達的第一個器官即為肝臟，以肝臟轉移相互比較是沒問題的

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Q:作者是否有將fig 6的marker用於測量TNM分期中去觀察臨床表現?

A:沒有

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Q: 為什麼篩選出L288F和E292V後，又從E292V找了E292I，但沒有找L288F的其他突變位點？

A: 因為F的整體結構較穩定，所以作者不想影響到L288F，就沒有再找其他的位點。

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Q:想請問作者是否有針對DNAJA2-mono的:想請問作者是否有針對DNAJA2-mono的β-hairpin驗證DNAJA2 必須以dimerization同時使用兩個 β-hairpin 才能有效夾住 mutant p53 的不穩定區域，單體結構因無法提供穩定多點交互作用，導致無法抑制聚集與保護變性蛋白。

A:作者沒有進一步測試「一個分子上有兩個 β-hairpin」但不dimerization的狀態，來真正驗證「幾何構型」對功能的貢獻。

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Q:作者有另外去看hsPEX19-FV並不能使mHttex1 aggregation復原，那又該如何解釋fig 5c的實驗結果?

A:應該用預防新生的角度去看，因為所有果蠅都是有Httex1被overexpression的。

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Q:為甚麼作者會想選用 Ataxin3 做實驗去驗證N17 domain的功能，是因為它與 huntingtin protien 有甚麼相似之處?

A:Ataxin3 與huntingtin protien 一樣有polyQ的domain，且Ataxin3也與神經退化性疾病有關。

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Q:如圖2E,F，為何可以確定Fluorescence intensity的降低就表示其產生fibril formation？

A:由於圖F可以直接看出它形成cluster like的結構，因此作者推測其螢光強度降低是由於產生fibril。

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Q: AF488是什麼?

A: 是一種螢光標記染料，用來標記 DNAJA2 蛋白，以便後續透過fluorescence anisotropy實驗測量其與 p53 蛋白的結合強度。

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Q: fig2E的beta-4和beta-9是最晚暴露出來的，要如何從圖中看出來呢?

A: 蛋白溶在D2O裡面，去看他的energy，有沒有重氫被change掉，他如果是包在裡面的，就會很慢才被暴露出來。

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Q: figure 2E中有unassigned 的部分，可能是什麼原因造成的

A:可能標記不好，或在裡面無法接觸到 D₂O

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Q:正常的Huntington protein皆有β-sheet，為何mutant Huntington protein會堆積

A:因mutant Huntington protein被切成短片段時，polyQ 區較容易形成 β-sheet 堆疊而形成聚集體。

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Q:在Hsp40被抑制掉後Hsp70可以解開misfolding protein嗎?

A:可以，有其他的chaperon替她抓住misfolding protein他仍然可以解開

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Q:在aggregation assay裡是用什麼讓越aggregation 的protein顏色會比較深

A:在detect protein的抗體上可能帶有螢光訊號讓抗體bind 的protein越多螢光訊號越強

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Q: HSP70最後會如何讓HSP40釋放未經摺疊或部分摺疊錯誤的p53釋放出來?

A: HSP70會透過結合在在HSP40結合位上改變HSP40的結構來將p53釋放

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Q:在Figure 3B中，將DNAJA2 的 Dimerization domain mutate 成 F337D後就無法形成dimer?

A:因為影響了疏水性及分子之間的引力，導致無法有interaction形成dimer。