# data[].attributes.body
Maak voor jezelf een overzicht van de labdag. Dat kan in een lijst zijn of visueel, dat maakt niet uit, zolang maar duidelijk is wat er gedaan moet worden.

# data[].attributes.body
Je weet van tevoren de concentratie DNA niet, die verschilt per epje op het lab. Bedenk wel hoe je dat snel kan berekenen en bereiden.

Je wil per monster: 1 ug DNA in 5 ul eindvolume, dat is een concentratie van 200 ng/ul

Maak voor 4 monsters (1 overmaat)

Dat is

Per monster 1000 ng / 5 ul

Per 4 monsters 4000n ng / 20 ul

Vanuit de V1*C1 = V2*C2 formule kan je bedenken:

4000 ng DNA / [aangeleverd DNA in ng * 1 ul] = X ul DNA nodig

20 ul eindvolume - X ul DNA = Y ul demi nodig

# data[].attributes.body
Soms weet je van tevoren een concentratie nog niet, maar moet je je wel voorbereiden. Een voorbeeldberekening noteren helpt dan. Hier staan 2 voorbeelden voor berekenen van hoeveelheid DNA in een reactiemix

# data[].attributes.attachment_caption
Pipetteerschema's voor het bereiden van de TAE oplossingen

# data[].attributes.body
De voorraadoplossing TAE heeft een concentratie van 10x. Er is 1x TAE nodig voor de agarosegel en 0.25x TAE voor het runnen van de gel.

Verdunnen TAE:
- 1 oplossing 1x TAE voor het bereiden van de agarosegel
- 1 oplossing 0.25x TAE voor in de gelbak tijdens het runnen

# data[].attributes.headline
Pipetteerschema monsters maken uit reactiemix

# data[].attributes.subject
Pipetteerschema monsters maken uit reactiemix

# data[].attributes.body
In de reactiemix pipetteer je geen DNA, dat voeg je pas toe wanneer je monsters maakt uit de reactiemix. Maak een berekening voor hoeveel  DNA er bij de reactiemix gepipetteerd moet worden. Ga ervan uit dat de concentratie DNA ongeveer 500 ng/ul is. De precieze concentratie is nog niet bekend omdat dat per epje van de fabrikant verschilt, op het lab moet je het dus nog een keer berekenen.
Noteer hoe je het hebt berekend zodat je op het lab binnen een minuut de berkening met de echte stockconcentratie DNA kan uitvoeren.

Verdunnen DNA: voorbeeldberekening
Ik wil: 1 ug DNA in 5 ul
ik heb: [DNA] 0,5 ug/ml
Berekening: 1 ug / 0,5 ub/ml = 2 ul DNA nodig
5 ul eindvolume - 2 ul DNA = 3 ul demi nodig

De werkelijke concentratie DNA verschilt per epje, bereken dit op het lab opnieuw met de werkelijke concentratie, pas je pipetteerschema reactiemix daar op aan, de hoeveelheid demiwater wordt dan anders...

Monsters maken uit verdund DNA
15 ul reactiemix + 5 ul verdund DNA

# data[].attributes.headline
Voorbeeld: Voorbereiding in labjournaal a.h.v. deze padlet

# data[].attributes.subject
Voorbeeld: Voorbereiding in labjournaal a.h.v. deze padlet

# data[].attributes.body
Wanneer je de info uit deze padlet in je labjournaal zet ziet de voorbereiding er ongeveer zo uit

# data[].attributes.body
Beschrijf hier de apparaatinstellingen die je gaat gebruiken

Deze staan in het voorschrift

Waterbad: 37 o C, 30 minuten incuberen
Agarose gelelectroforese: 60 minuten, 100 V

# data[].attributes.body
Deze periode ga je voor de voorbereiding veel doen. wanneer je niet samenwerkt kan het teveel zijn om alleen te doen in een reëele tijd.

Gebruik deze padlets om samen voor te bereiden. Als je met een groepje in een padlet werkt kan iedereen er tegelijkertijd aanvullingen in zetten.

# data[].attributes.body
Noteer hier informatie over welke buffer je gebruikt

Restrictie enzymen zijn kwetsbaar. Bij een verkeerde behandeling werken ze niet meer. Een buffer houdt de pH constant, het is belangrijk de correcte buffer te kiezen. In de afbeelding staat informatie van de fabrikant over de buffer.

HinDIII knipt goed in buffer R, bij 37 o C

# data[].attributes.attachment_caption
Voorbeeld van hoe je een planning kan noteren

# data[].attributes.body
Het kan handig zijn om een planning te bedenken om overzicht te houden over de labdag. Uiteindelijk op de praktijktoets word gekeken of je weet wat je moet doen, of dat in je hoofd zit of op papier mag je zelf bepalen.

Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:

Materialen verzamelen

Gelplek inrichten

Waterbad aanzetten en opwarmen

Epjes beschrijven

agarosegel oplossing maken, verwarmen, DNA dye toevoegen

agarosegel gieten

agarosegel laten stollen

reactiemix maken

Monsters bereiden uit reactiemix

Restrictie incuberen in waterbad

Loading dye toevoegen aan DNA monsters

DNA monsters in de gel doen

Gel runnen (stroom erop zetten)

Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen

Opruimen

# data[].attributes.body
Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier.

1: exp detectiegrens
2: exp detectiegrens
3: exp detectiegrens
4: exp detectiegrens
5: exp detectiegrens
7: exp detectiegrens
8: exp detectiegrens
9: positieve controle
10: negatieve controle
11: DNA ladder 1000 bp (nodig om de grootte van bandjes te kunnen schatten)
12: Analysemonster
13: Analysemonster duplo (wanneer je daar voor kiest)6:
14:
15:

# data[].attributes.body
Zoek hier uit welke verwachting je hebt bij elk monster. Vul met deze info de verwachting aan

Controles zijn pas goed te interpreteren wanneer je weet hoe het resultaat er uit ziet als de controle 'goed' is.

Analysemonster: verschillende bandjes met groottes zoals NEBcutter voorspelt
Positieve controle: verschillende bandjes met groottes zoals NEBcutter voorspelt / zoals aangegeven in het document met DNA ladders
Negatieve controle: een bandje met de grootte van lambda DNA. Lambda DNA is 48502 bp lang, dus een bandje bij 48502 bp (Dit zal bovenaan de gel zitten)

# data[].attributes.body
Noteer hier welke monsters je gaat maken voor dit experiment

Het is vaak handig om te beschrijven hoe je de monsters behandelt of wat er wel of niet bij de controles aanwezig is

Het doel van dit experiment is het namaken van de lambda DNA / HinDIII ladder

Wat ga je hiervoor doen? lambda DNA knippen met HinDIII
Analysemonster
Lambda DNA knippen met HinDIII
evt: duplo analysemonster:  lambda DNA knippen met HinDIII

Positieve controle
Dit monster moet een positief resultaat geven, het ziet er op gel uit als een lambda DNA / HinDIII ladder
positieve controle: labmda HinDIII DNA  (uit experiment DNA detectiegrens weten we dat dat DNA aanwezig is)

Negatieve controle
Dit monster moet eruit zien zoals een mislukt experiment eruit ziet. Als er bij restrictie iets mis gaat dan wordt je DNA niet geknipt (dit kan bijvoorbeeld komen door verkeerde temperatuur, zoutconcentratie, buffer of een kapot restrictie enzym).
Negatieve controle: ongeknipt lambda DNA

DNA ladder
Om de grootte van de bandjes te kunnen schatten moet je de bandjes van de monsters ergens mee vergelijken: met een DNA ladder. Kijk naar het document met DNA ladders en kies een ladder waarbij je de meeste bandjes zou kunnen vergelijken. Je verwacht bij dit experiment bandjes van 125 bp tot ~48000 bp. Geen enkele ladder is 'breed' genoeg om dit te doen. De 50 bp ladder en 100 bp ladder gaan tot maximaal 1000bp, dat is met weinig bandjes te vergelijken. De 1000bp ladder gaat van 1000 bp tot 10 000 bp, daar kan je meer bandjes uit je analysemonster mee vergelijken. je kan in NEBcutter, bij gelview, ook ladders aanvinken om te zien of ze handig zijn.
Ladder: 1000 bp ladder

# data[].attributes.body
Bij restrictie analyse maak je altijd een reactiemix. Een reactiemix is een oplossing met daarin alle enzymen en buffer, maar nog niet het DNA. Uit de reactiemix maak je dan individuele monsters door aan een hoeveelheid reactiemix DNA toe te voegen. Elk monster dat je maakt noemen we een 'reactie'. Maak altijd reactiemix voor 1 reactie meer dan je monsters hebt.

Bedenk:

Voor hoeveel reacties maak je reactiemix?

reactiemix analysemonster

reactiemix analysemonster duplo

twee monsters, dus voor 3 monsters reactiemix maken

Reactiemix enkeldigestie HinDIII enzym
1 reactie                   ___ reacties
DNA (1 ug)                                     ___ ul               _____________
10x RE buffer (welke)                    2 ul                _____________
Restrictie enzym HinDIII (5U) ___  ul                 _____________
Demiwater                                   ___  ul                 _____________
Eindvolume                                  20 ul                      _____ ul

Als je dit berekent wordt de reactiemix zoals in de afbeelding.

Wanneer je de werkelijke concentratie DNA weet moet je pipetteerschema nog aangepast worden, de hoeveelheid demiwater zal veranderen wanneer de concentratie niet precies 500 ng/ul is...

# data[].attributes.headline
Pipetteerschema toevoegen loading dye aan monster

# data[].attributes.subject
Pipetteerschema toevoegen loading dye aan monster

# data[].attributes.body
Wanneer DNA klaar is om op de agarosegel gezet te worden moet er nog loading dye bij. Dat gaat altijd in een verhouding van 1 loading dye : 6 DNA

Als je 10 ul monster hebt en daar 2 ul loading dye bij doet voldoet het aan die verhouding

Pipetteerschema loading dye toevoegen aan DNA
DNA                  10 ul
Loading dye    2 ul
eindvolume    12 ul

pipetteer hiervan 10 ul in de agarosegel

# data[].attributes.body
Vul hier het pipetteerschema voor agarosegel in

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

Kijk in de voorschriften, daar staat dat 0,7% agarose (tenzij er anders aangegeven is) vaak een goede concentratie agarose is

Er staat ook dat er 50 ml agarosegel nodig is

Agarosegel
______________________0,7_____ % gel
agarose _____________________g
TAE _________________________ ml
eindvolume _________50_____ ml

Dan is de hoeveelheid agarose en TAE makkelijk te berekenen.
0,7% = 0,7 g per 100 ml gel
er is 50 ml nodig, dus 0,35 g agarose
TAE is een buffer (hint: er staat ml in het pipetteerschema), dus aanvullen met TAE tot 50 ml

Het pipettteerschema is dan zoals in de afbeelding

Noteer nog hoeveel ul sybrsafe erbij moet, zonder sybrsafe blijft het DNA in de gel onzichtbaar. Waarschijnlijk is het sybrsafe op het lab 10x verdund i.v.m. veiligheid

Toevoegen aan gel voordat hij gegoten wordt:
puur sybrsafe:                     1 ul of
10x verdund sybrsafe:     10 ul

# data[].attributes.body
Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan.
Doe de paginas met informatie over alle stoffen voor dit experiment vooraan in de map.

Correct gebruik van de veiligheidsmap wordt beoordeeld bij professionele werkhouding en tijdens de praktijktoets.

Zoek in de veiligheidsregels op welke maatregelen van toepassing zijn op dit experiment.
Zoek op internet naar veiligheidsinformatie (SDS) van alle gebruikte chemicalien.

# data[].attributes.body
Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren
Er zijn materialen nodig voor de voorschriften Agarose gelelectroforese en Restrictie analyse: enkeldigestie
TIP: Lambda / HinDIII DNA betekent: DNA dat ik geknipt met enzym HinDIII

Materiaal, concentratie, bewaarinstructie, fabrikant
____
____
____
____

# data[].attributes.body
Noteer hier de verwachting van het experiment

De verwachting zal je zelf moeten bedenken, wel zijn er vaak hints te vinden in de opdracht of in de voorschriften. De vragen in de padlet staan er om je te helpen nadenken over de verwachting

Wat verwacht je dat er uit komt?

Een DNA ladder

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet

Bandjes DNA met een bekende grootte

Welke grootte bandjes verwacht je te vinden? Onderbouw dit met NEBcutter

NEBcutter is een digitale tool om restrictie na te bootsen. Volgens NEBcutter ontstaan de volgende DNA-fragmenten wanneer je lambda DNA knipt met restrictie enzym HinDIII:

in bp: 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130

Als het ongeknipt blijft: ~48502 bp (dit verwacht ik niet)

Onderbouw je verwachting altijd: Ik verwacht, zoals onderzocht in NEBcutter dat lambda DNA geknipt met HinDIII DNA fragmenten geeft van 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130. Ik verwacht dat het grootste fragment bovenaan de gel zal blijven en het kleinste fragment het verst naar onder migreert.
Positieve controle: Ik verwacht dat dit er uit ziet zoals voorspeld in NEBcutter (fragmenten van 125, 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130_
Negatieve controle: Ik verwacht dat dit een bandje geeft van ongeveer 48000 bp (de grootte van ongeknipt lambda DNA)

# data[].attributes.body
Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?

Principes hoeven niet in je labjournaal, maar het is belangrijke kennis over technieken. Op de praktijktoets wordt naar principes gevraagd

Dit kan je vaak vinden in de voorschriften. Ook de informatie op moodle over achergrond van de technieken en google en youtube kunnen je informatie hierover geven.

Bij restrictie wordt een enzymatische reactie gebruikt om DNA in fragmenten te ‘knippen’. Restrictie enzymen zijn specifiek: ze herkennen een DNA sequentie en knippen daar. Hierdoor is (wanneer de sequentie van een stuk DNA bekend is) van tevoren te voorspellen hoe groot de DNA fragmenten na restrictie zijn. Door een stuk DNA in fragmenten te knippen kan een DNA ladder gemaakt worden: een verzameling DNA fragmenten met bekende grootte.

In het experiment 'detectiegrens van DNA bji agarose gelelectroforese' is een lambda/HinDIII DNA ladder gebruikt. Door lambda DNA te knippen met HinDIII moet deze ladder na te maken zijn.

# data[].attributes.body
Wat is het doel van het experiment?

Voor het doel staan vaak hints in de opdracht tekst

Het maken van een moleculair gewichtsmarker (oftewel DNA ladder).

# data[].attributes.body
Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften

Agarose gelelectroforese

Restrictie analyse: enkelrestrictie

Kiezen restrictie buffers

NEB cutter

Document 'DNA sequenties, ladders en primers' (bij studiemateriaal op moodle)

# data[].attributes.body
Restrictie: Maak een DNA ladder van lambda DNA

Bij agarose gelelekroforese wordt altijd een DNA ladder, of moleculair gewichtsmarker gebruikt.  Een DNA ladder bevat DNA fragmenten met bekende grootte, dit is nodig om de DNA fragmenten uit analysemonsters mee te vergelijken zodat de grootte geschat kan worden.

In het experiment waarin je de detectiegrens van DNA op agarosegelelektroforese bepaalt, is HinDIII geknipt lambda DNA gebruikt. Hiervan zijn de groottes van de bandjes bekend, het kan dus ook gebruikt worden als referentie (moleculaire gewichtsmarker, of DNA ladder). Maak deze moleculair gewichtsmarker na door restrictie enkeldigestie toe te passen op lambda DNA en analyseer of dit gelukt is. Zorg dat je de correcte buffer gebruikt voor het restrictie enzym HinDIII. Vergeet niet het experiment in silico (digitaal) uit te voeren met NEB cutter om te controleren of je de goede opzet bedacht hebt.

HinDIII is een restrictie enzym, lambda DNA is het DNA van de lambda bacteriofaag.

Bij een restrictie wordt DNA in fragmenten ‘geknipt’. De grootte van de verschillende fragmenten analyseer je op gel.

Voor veiligheid is het belangrijk te weten dat met DNA dye (sybrsafe in dit geval) met de 2-handschoenen methode wordt gewerkt, zoek dit op in de veiligheidsregels.

De voorbereiding van dit experiment staat niet in een filmpje, maar deze week  is in de padlet vaak het antwoord al gegeven (kijk naar de afbeeldingen). Hierdoor zie je wat de bedoeling is en gaat de voorbereiding van de eerste labdag niet te moeizaam. Een planning die je kan maken lijkt verdacht veel op het voorbeeldwerkplan...

Alles wat je voor deze opdracht moet doen kan je als 1 experiment in je labjournaal noteren, ook wanneer er meerdere voorschriften nodig zijn.

# data[].attributes.body
Deze periode gaan jullie via padlet samen voorbereiden voor op het lab. Het voordeel is vooral dat je samen meer weet dan alleen. Tijdens de voorbereidingslessen kan je vragen stellen aan de docent, maar je zal het meeste echt zelf (samen) moeten doen.

Er zijn deze week 2 experimenten uit te voeren op het lab, in deze padlet staat de voorbereiding voor Restrictie: maak een DNA ladder van lambda DNA.

Deze week kan je onvoorbereid het lab op gaan, zeker studenten die op maandag les hebben zullen nog geen tijd gehad hebben om voor te bereiden. In deze padlet staat de voorbereiding voor de opdracht 'detectiegrens bij agarose gelelectroforese' voorgedaan, je kan het overnemen in je labjournaal. Alles wat je zelf zou moeten bedenken is al ingevuld. Hierdoor kan je zien wat de bedoeling is als je het in latere weken zelf gaat doen.

OPDRACHT:

Kijk goed wat er in geel genoteerd is en probeer te achterhalen hoe dat bedacht is aan de hand van de opdracht en voorschriften.

Zoek zelf nog veiligheidsinformatie voor dit experiment op.

Dat de voorbereiding al voorgedaan is betekent niet dat je deze week geen tijd in voorbereiding hoeft te steken, neem de moodleopdrachten goed door (desnoods achteraf). Kijk ook goed naar de informatie over de achtergrond van de technieken, die kennis heb je de rest van de periode hard nodig.