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Para a análise das impressões digitais, foi seguido um procedimento que incluiu a revelação e a recolha das marcas deixadas nas superfícies.

Foi utilizado um pincel com pó revelador, que foi aplicado com movimentos suaves e circulares sobre a superfície suspeita, no caso, a faca. As impressões digitais latentes foram progressivamente reveladas através deste método.

Após a revelação, foi colocada uma fita de levantamento sobre a impressão digital e aplicada uma leve pressão. A fita foi então retirada e fixada num cartão de recolha apropriado.

Com o auxílio de uma lupa, a impressão foi observada e foram identificadas as suas características dactiloscópicas, como o tipo de padrão e pontos de minutiae. Por fim, a impressão recolhida foi comparada com as impressões digitais da vítima e dos suspeitos, com o objetivo de estabelecer uma possível correspondência.

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Os testes de orientação servem para identificar a possível presença de um vestígio específico.

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O sangue é uma evidência comum em cenas de crime. Tipificando o sangue encontrado, é possível associar ou excluir um ou mais suspeitos de uma cena de crime. No entanto, não funciona como prova, pois várias pessoas compartilham o mesmo tipo sanguíneo.

O tipo sanguíneo é determinado pela presença ou ausência de determinados antigénios (A, B e Rh) nos glóbulos vermelhos.

Pelo sistema ABO, existem quatro tipos principais: A, B, AB (ambos os antigénios presentes) e O (nenhum antigénio presente). Além disso, existe o fator Rh (positivo ou negativo).

A identificação do tipo sanguíneo é feita com anticorpos específicos (anti-A, anti-B e anti-Rh), que vão reagir com os respetivos antigénios, levando à aglutinação dos glóbulos vermelhos.

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A quantificação do DNA é feita através de espectrofotometria. A espectrofotometria baseia-se na medida quantitativa da absorção da luz pelas soluções. Assim, a concentração de DNA na solução é proporcional à quantidade de luz absorvida.

Além disso, através desta análise, é possível avaliar a pureza do DNA. Esta é medida através do rácio das absorbâncias: A260/A280. Os possíveis resultados são:

1.8 - DNA "puro"

< 1.8 - pode indicar contaminação com proteínas ou fenóis

> 1.8 - pode indicar contaminação por RNA.

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Protocolo de Amplificação de DNA Mitocondrial (Região HVI – “Core Kit”)

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Protocolo de Amplificação de DNA Mitocondrial (Região HVI – “Core Kit”)

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Iniciar por preparar os tubos de PCR de 200 µl num suporte, incluindo um tubo para controlo negativo. Manter os reagentes em gelo e homogeneizá-los brevemente em vórtex. Preparar a Master Mix com os primers (Tabela 2) num tubo de 1,5 ml para 5 reações (3 amostras, controlo negativo e 1 reação a mais por causa de erros de pipetação), seguindo os volumes indicados na Tabela 1, apresentada em baixo. Vortexar o Master Mix a velocidade média. Distribuir 24 µl do Master Mix em cada tubo de PCR, adicionando depois 1 µl de amostra ou, no caso do controlo negativo, 1 µl de água ultrapura. Colocar os tubos no DNA Thermal Cycler, inserir o programa de amplificação (Tabela 3) e iniciar o ciclo.

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Para determinar o tipo sanguíneo da vítima, dos suspeitos 1, 2 e 3, e do sangue encontrado nas Evidências 2 (calças) e 3 (faca), foram colocadas 4 gotas do respetivo sangue em cada um dos poços da placa (A, B e Rho). De seguida, foram adicionadas 4 gotas do soro Anti-A (garrafa azul) nos poços marcados com A, 4 gotas do soro Anti-B (garrafa amarela) nos poços marcados com B, e 4 gotas do soro Anti-Rh (garrafa verde) nos poços marcados com Rh. Com o auxílio de palitos, foi homogeneizado cada mistura de sangue e soro, utilizando um palito diferente para cada poço. Por fim, observa-se a ocorrência de aglutinação.

Podem-se obter os seguintes resultados:

Aglutinação no poço A indica presença do antigénio A (A+)

Aglutinação no poço B indica presença do antigénio B (B+)

Aglutinação no poço Rh indica fator Rh positivo (Rh+)

Ausência de aglutinação indica ausência do respetivo antigénio (A-, B-, Rh-).

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As amostras de DNA foram primeiro centrifugadas por 3 minutos a 14000 rpm e, depois, colocadas por ordem na placa com os respetivos brancos (5 μL; água destilada). De seguida, o DNA foi quantificado por espectrofotometria (260 nm) usando o equipamento Multiskan SkyHigh. Por fim, foi feita a leitura dos resultados.

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Numa investigação forense, as amostras problema são os vestígios recolhidos no local do crime, cuja origem se pretende determinar. As amostras de referência são materiais de origem conhecida (como sangue da vítima ou dos suspeitos), usados para comparação e identificação. A análise entre ambas permite estabelecer ligações entre o suspeito, a vítima e o local do crime, sendo essencial para confirmar ou excluir hipóteses com base científica.

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Resultados obtidos:

Vítima: A+

Suspeito 1: O-

Suspeito 2: AB+

Suspeito 3: O-

Evidência 2 (calças de ganga): O-

Evidência 3 (faca): A+

Conclusões: estes resultados indicam que o sangue presente nas calças pode ser do suspeito 1 (sexo feminino) ou do suspeito 3 (meio-irmão). Já o sangue presente na faca, é da vítima.

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Tabela 1: Volumes a adicionar de cada componente da reação de PCR.

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(*) As 5 reações consistem em: 3 amostras + Controlo Negativo + 1 reação por causa de erros de pipetagem

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Data e local do crime: 30 de março de 2020, às 23h30, numa casa isolada perto do Crato, Alentejo.

Descoberta: Turistas encontraram a porta aberta e, no interior, o cadáver já em decomposição de uma mulher idosa.

Vítima: Maria de Jesus, 77 anos, viúva, sem família conhecida, mas proprietária de vasta fortuna em terras rurais.

Linha de investigação: A Polícia Judiciária relacionou o homicídio com a operação “pirites alentejanas”, que visava um casal suspeito de vários assaltos a idosos em 2019, o chamado “gang do ouro”.

Modo de operação: Furtos de peças de ouro antigas em casas de idosos isolados, aproveitando a alta cotação do metal.

Suspeitos detidos: Um homem português e uma mulher afro-americana de New Jersey. Eles negam o homicídio, admitindo apenas furtos sem violência.

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Neste procedimento, realizou-se a extração de DNA das amostras 1 a 3 utilizando o método Chelex.

Este método baseia-se na utilização de uma resina quelante, composta por esferas de Chelex a 5%, que tem a capacidade de se ligar a iões metálicos como o ferro (Fe²⁺) e o magnésio (Mg²⁺). Estes iões, caso estivessem presentes, poderiam catalisar reações que degradariam o DNA, especialmente durante a exposição a altas temperaturas.

Etapas principais do método:

1. Preparação da suspensão de Chelex 5%, onde as amostras biológicas são adicionadas.

2. Lise celular por fervura, o que rompe as membranas celulares e nucleares, libertando o DNA.

3. Durante a fervura, o Chelex remove iões metálicos, protegendo o DNA da degradação térmica.

4. O DNA obtido encontra-se em cadeia simples (desnaturado), adequado para técnicas subsequentes como a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase).

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Cartão de Recolha de Impressões digitais feito na aula

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As impressões digitais foram recolhidas da faca e verificamos a presença de duas impressões digitais.

Após a comparação da impressão digital obtida com impressões previamente recolhidas da vítima e dos suspeitos, suspeitamos que havia uma impressão digital da vítima, que poderia ser de defesa, e outra impressão que possivelmente pertencia ao meio-irmão da vítima. Tudo indica que esta seria uma evidência do ataque.

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Impressões Comparadas: Suspeitos e Vítima

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Impressões Comparadas: Suspeitos e Vítima

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Vítima (género feminino)

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Suspeito 1 (género feminino)

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Suspeito 2 (género masculino)

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Suspeito 3 (meio irmão)

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Na amostra de DNA recolhida da ponta de cigarro (evidência #1), a concentração de DNA era de 147 μg/mL

Quanto à pureza, obtivemos um valor do rácio 260/280 de 1,44, o que indica possível contaminação com proteínas.

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Na amostra de DNA recolhida das calças de ganga (evidência #2), a concentração de DNA era de 2,91 μg/mL

Quanto à pureza, obtivemos um valor do rácio 260/280 de 0,918.

Estes resultados são maus. Indicam pouca quantidade de DNA na amostra e contaminação, possivelmente por causa do tipo de material.

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Na amostra de DNA recolhida da faca (evidência #3), a concentração de DNA era de 177 μg/mL

Quanto à pureza, obtivemos um valor do rácio 260/280 de 1,66, o que indica possível contaminação com proteínas.

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Tabela 2: Par de primers para a região HV1.

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(*) cálculo da temperatura de annealing feito pelo Tm Calculator da Thermo Fisher: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html

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Tabela 3: Programa da reação de PCR inserida no termociclador

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Verificação da Amplificação por Eletroforese em Gel de Agarose a 2%

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Verificação da Amplificação por Eletroforese em Gel de Agarose a 2%

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Preparação das amostras: adicionar 1 µl de Orange dye a 5 µl de amostra de DNA amplificado.

Preparação do gel de agarose a 2%: dissolver 0,6 g de agarose em 30 ml de tampão TAE 1x e aquecer até completa dissolução. Corrigir o volume com TAE 1x após arrefecimento e adicionar 1,2 µl de GelRed, misturando bem. Verter na moldeira nivelada e deixar solidificar durante mais ou menos 20 minutos.

Eletroforese: carregar as amostras nos respetivos poços do gel, juntamente com 6 µl de ladder de 100 bp. Realizar a eletroforese em tampão TAE 1x a 130 V durante 20 minutos. Visualizar os resultados no transluminador.

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Ordem de Amostras (da esquerda para a direita):

Marcador Molecular

Amostra 1 (Evidência #1 - ponta de cigarro)

Amostra 2 (Evidência #2 - calça de ganga)

Amostra 3 (Evidência #3 - faca)

Controlo Negativo

Ao analisar o resultado do gel de agarose, não podemos retirar nenhuma conclusão pois, imediatamente, é possível observar que o controlo negativo está contaminado - amplificação de fragmento semelhante ao amplificado na coluna da Amostra 1.

Podemos também verificar que há amplificação de um fragmento semelhante ao amplificado no controlo negativo e amostra 1, e também de outro fragmento maior.

Conclusão: devido à clara contaminação das amostras usadas, nenhuma conclusão pode ser retirada deste processo. O passo seguinte seria refazer o protocolo, tendo em conta os possíveis erros cometidos.

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Estes resultados indicam contaminação das amostras usadas e, também, do controlo negativo. Existem diferentes erros possíveis que podem ter sido cometidos:

Contaminação cruzada, resultante, por exemplo, do manuseio incorreto de tubos ou reagentes ou da reutilização de pontas ou pipetas contaminadas;

Contaminação de reagentes;

Erros de pipetagem, como pontas encostadas a tubos ou superfícies contaminadas;

Problemas com os primers: primers degradados, formação de dímeros ou condições mal otimizadas.

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Teste de Orientação de Saliva - PHADEBAS

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Teste de Orientação de Saliva - PHADEBAS

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Em que consiste?

Na saliva humana, existe uma enzima, a α-amilase, que catalisa a hidrólise de ligações glicosídicas existentes, por exemplo, no amido.

O papel Phabedas (papel azul-claro, na imagem) tem complexos amido-corantes que são libertados na presença de α-amilase. Estes complexos estão imobilizados no papel e quando a enzima é libertada, os locais que contactam com esta, adquirem uma coloração azul-escura.

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Amostra 1 – ponta de cigarro.

Amostra 2 – calça de ganga da vítima com mancha.

Amostra 3 – faca.

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Amostra 4 – Amostra fornecida da vítima

Amostra 5 – Amostra fornecida do suspeito 1 (género feminino)

Amostra 6 – Amostra fornecida do suspeita 2 (género masculino)

Amostra 7 – Amostra fornecida do suspeito 3 (Meio irmão)

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Resultado: coloração azul-escura, positivo

Conclusão: há saliva na beata

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Em que consiste?

A fenolftaleína reage com o peróxido de hidrogénio, na presença de hemoglobina, e ao oxidar, adquire uma coloração cor-de-rosa.

O ferro e o peróxido de hidrogénio oxidam a fenoftalina (forma incolor) em fenolftaleína (forma cor-de-rosa).

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Teste do Kastle-Meyer positivo realizado em aula 

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Evidências Testadas: Faca e Calças de Ganga

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Evidências Testadas: Faca e Calças de Ganga

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Resultado: coloração cor-de-rosa, positivo.

Conclusões: presumivelmente estamos na presença de sangue, tanto nas calças como na faca, mas não sabemos se é realmente sangue humano ou não.

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Em que consiste?

O luminol é um composto quimioluminescente que brilha luz azul. É ativado com um agente oxidante, como o peróxido de hidrogénio, na presença de um catalisador, como o ferro presente na hemoglobina. Quando o luminol reage com o peróxido de hidrogénio, a energia criada pela reação é libertada na forma de um fotão de luz. O catalisador presente faz com que a reação seja muito rápida.

Este teste é mais caro que o teste Kastle-Meyer mas também é mais sensível.

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Evidências Testadas: Faca e Calças de Ganga

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Evidências Testadas: Faca e Calças de Ganga

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Resultado: luz azul, positivo.

Conclusões: mais uma vez, presumivelmente estamos na presença de sangue, tanto nas calças como na faca. Não sabemos se é realmente sangue humano ou não.