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La reacción en cadena de la polimerasa permite la amplificación exponencial de una secuencia deseada mediante el uso de cebadores que se aparean con la secuencia de interés, esta depende del uso de ADN polimerasas termoestables que pueden resistir múltiples ciclos de desnaturalización del molde.

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Las ADN polimerasas requieren una cadena molde con un cebador hibridado que contiene un hidroxilo 3 'para comenzar la extensión de la cadena. Calentando la molécula plantilla hasta cerca de 100 ° C en un tampón causa la desnaturalización térmica a medida que las hebras de la plantilla se derriten separándose de cada otro.

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Enfriamiento rápido del cebador / molde y un gran exceso molar del corto, cebador sintético cinéticamente activo asegura que una molécula de cebador encuentre e híbrida apropiadamente con su secuencia diana complementaria más rápidamente que el la hebra opuesta original puede hacerlo.

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Si se presenta a una polimerasa, este cebador recocido presenta una ubicación definida desde la cual comenzar la extensión del cebador. En general, esta extensión ocurrirá hasta que la polimerasa sea expulsada de la plantilla o hasta que alcance el extremo 5 'de la molécula plantilla y se quede sin plantilla para copiar.

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la PCR surge de incorporar simultáneamente un segundo cebador cercano de polaridad opuesta (es decir, complementario a la hebra opuesta a la que se hibrida el primer cebador) y luego someter la mezcla de molde, dos cebadores (a altas concentraciones), ADN polimerasa termoestable y tampón de polimerasa que contiene dNTP para ciclos repetidos de desnaturalización térmica, hibridación y extensión del cebador.

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Crea productos de longitud incierta a partir de la extensión de cada cebador de la molécula de plantilla original con cada ciclo, estos productos se acumulan de forma lineal y rápidamente son superados en número por el cebador a cebador definido. producto, conocido como el amplicón.

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Debe tener en cuenta cuestiones como las estructuras secundarias del ADN, la singularidad de la secuencia y la similitud de T m entre los cebadores. El uso de una polimerasa termoestable (es decir, una que no se inactiva por las altas temperaturas utilizadas en las etapas de desnaturalización) es un concepto identificado por Mullis y colaboradores.

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Se pueden aprovechar diferentes fuentes de enzimas con diferentes propiedades (por ejemplo, actividades de exonucleasa para una mayor precisión) para satisfacer las necesidades de aplicaciones individuales.

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El proceso de PCR funciona mejor cuando los cebadores están a distancias cortas entre sí (de 100 a 500 pares de bases), pero las reacciones bien optimizadas han tenido éxito a distancias de decenas de kilobases.

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Modificación covalente de la polimerasa, para asegurar que no ocurra ningún apareamiento y extensión inapropiados del cebador antes del primer paso de desnaturalización, evitando así la producción de productos incorrectos.

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El emparejamiento de la PCR con un paso preliminar de transcripción inversa (ya sea con cebado aleatorio o utilizando uno de los cebadores de PCR para dirigir la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ARN [transcriptasa inversa]) permite que las plantillas de ARN se conviertan en ADNc y luego se sometan a PCR regular , en una variación conocida como PCR transcripción inversa.

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La detección de productos de PCR se puede realizar de varias formas. Las "técnicas de punto final" posteriores a la reacción incluyen electroforesis en gel y tinción con colorante específico de ADN, o en su lugar electroforesis capilar, existen muchas técnicas para la detención de amplicones específicos como lo son: quimioluminiscencia, fluorescencia y técnicas electroquímicas. Alternativamente, PCR en tiempo real.

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Método de PCR en tiempo real efectivo en enfoques de cuantificación de plantillas, al ser en tiempo real se muestran buenas correlaciones entre el numero de termociclo y la concentración de la platilla inicial en el que se pueden medir señales claras generalmente denominado Limite de Ciclo (C T).

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El método más simple para la detección de PCR en tiempo real se basa en el uso de tintes que se unen selectivamente y se vuelven fluorescentes en presencia de ADN de doble hebra. Monitorea la fluorescencia en cada tubo de reacción durante estos pasos térmicos de cada ciclo y calcula el cambio en la fluorescencia por ciclo para generar una curva de amplificación sigmoidea.

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Un problema potencial con este enfoque es que los tintes indicadores no son específicos de secuencia, por lo que puede dar lugar a señales positivas falsas.

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Transferencia de Energía Resonante de Fluorescencia (FRET). 

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Transferencia de Energía Resonante de Fluorescencia (FRET). 

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Varios enfoques alternativos utilizan reporteros de fluorescencia basados en sondas, que evitan esta posible señal inespecífica. Los enfoques basados en sondas funcionan mediante la aplicación de un proceso llamado transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET).

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La transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET) ocurre solo cuando los fluoróforos informadores y extintores están muy cerca uno del otro, lo que lleva a la detección de luz en el extintor.

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Son increíblemente diversas. Esta conduce a aplicaciones médicas como la detección de agentes de enfermedades infecciosas en sensibilidades, especificidades y velocidades mucho mayores que los métodos alternativos.

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Mientras los dos sitios del cebador deben ser de secuencia conocida, la sección interna puede ser cualquier secuencia de una longitud general, que conduce directamente a aplicaciones para las que un PCR producto para una región que se sabe que varía entre especies puede ser producido y sujeto a análisis de secuencia para identificar la especie de la plantilla de muestra.

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Los biólogos evolutivos han hecho uso de la PCR para amplificar el ADN de muestras bien conservadas, con la posterior secuenciación y análisis filogenético, dando resultados fascinantes sobre la continuidad y evolución de la vida en la Tierra.

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Secuenciación de ADN | Khan Academy en Español

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Es posible realizar la detección diferencial de polimorfismos de un solo nucleótido que puede ser directamente indicativo de genotipos particulares o sirven como marcadores subrogados vinculados para genes cercanos objetivos de interés, mediante el diseño de cebadores de PCR con un nucleótido terminal 3 ′ específico para el polimorfismo esperado.

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Este multiplex La PCR es particularmente útil en aplicaciones forenses y situaciones de diagnóstico médico, pero implica niveles de complejidad que aumentan rápidamente para garantizar que múltiples conjuntos de cebadores no tenga interacciones no deseadas que conduzcan a productos falsos no deseados.