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A clonagem gênica é uma técnica usada para amplificar fragmentos de DNA, bem como para outras manipulações das sequências de DNA. Outra técnica que vem sendo utilizada para amplificar sequência de DNA e também de DNA in vitro é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica permite a amplificação de fragmentos curtos de DNA e pode ser usada para produzir grandes quantidades de um determinado fragmento de DNA de qualquer ser vivo (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2013)

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A PCR tem dois requisitos fundamentais: um molde de DNA de fita simples do qual uma nova fita de DNA deve ser copiada e um iniciador (primer) com um grupo 3'OH, ao qual novos nucleotídeos são adicionados. Para copiar um molde de DNA em ciclos repetidos e replicar o fragmento que se deseja, a PCR, utiliza-se da enzima DNA-polimerase. Para que esse fragmento seja copiado, a polimerase é guiada por pequenos oligonucleotídeos iniciadores ou primers, que são hibridizados com o DNA-molde no início e no final da sequência de DNA desejada (BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2013, p. 561).

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A PCR tem três etapas, sendo cada uma delas repetidas várias vezes. Veja, a seguir, a descrição dessas etapas, conforme Snustad e Simmons (2017, p. 528):

Na 1ª etapa, o DNA genômico que contém a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento à temperatura de 92ºC por cerca de 15 segundos.

Na 2ª etapa, permite-se que o DNA desnaturado pareie com um excesso dos iniciadores oligonucleotídicos sintéticos mediante incubação de ambos a 50°C a 60°C por 30 a 60 segundos. Esse processo é chamado anelamento – termo emprestado da metalurgia, contexto no qual representa o fortalecimento de uma substância aquecida por meio de seu resfriamento. A temperatura ideal de anelamento depende da composição de bases do iniciador.

Na 3 a etapa, a DNA polimerase é usada para replicar o segmento de DNA entre os locais complementares aos iniciadores oligonucleotídicos. O iniciador oferece a 3′OH livre necessária para extensão covalente, e o DNA genômico desnaturado desempenha a função de molde necessária.

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Entenda Genética -  por Natácia E. de Lima

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Nesta aula, estudamos que a PCR é uma técnica originalmente denominada de amplificação da sequência de DNA ou amplificação do DNA in vitro. Tal técnica permite que os fragmentos de DNA sejam amplificados um bilhão de vezes em poucas horas, sendo menos onerosa e podendo ser concretizada totalmente in vitro, sem utilização de células. A PCR tem sido, portanto, de grande impacto na clínica médica, no diagnóstico de doenças genéticas, na ciência forense e na biologia evolutiva, sendo uma das técnicas moleculares mais utilizadas atualmente. Assim, a técnica de PCR em momento real ou PCR quantitativa permite alcançar o número de moléculas produzidas em cada ciclo.

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BORGES-OSÓRIO, M. R. L.; ROBINSON, W. M. Genética Humana. 3. ed. Porto Alegre: Grupo A, 2013.

SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.

https://www.youtube.com/watch?v=nU2xhINuDZA&t=133s

https://www.youtube.com/watch?v=KczObl4aNAM&t=4s

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