# data[].attributes.body
Noteer de instellingen voor apparatuur die je wilt gebruiken

Hoeveel V en A wil je de gel runnen?
Hoe stel je de PCR in? hoeveel cycli?

# data[].attributes.body
Bedenk dat het PCR-programma veel cycli heeft, bereken hoe lang het duurt voordat het hele programma afgerond is. Reken daar nog 20% tijd bij omdat het apparaat tussen elke stap moet opwarmen of afkoelen

Bedenk dat runnen van gel elektroforese ook tijd kost, langer dan de vorige weken wanneer je een hoger % agarosegel gebruikt. Beschrijf welke kleur uit de loading dye hoe ver gerund moet zijn wanneer je de gel wilt stoppen

# data[].attributes.body
Om de monsters te maken die in het PCR apparaat gaan moet je bedenken hoeveel ul monster DNA je bij hoeveel ul mastermix doet. Daarvoor moet je de concentratie van het gebruikte DNA weten.

In het pipetteerschema mastermix wordt er vanuit gegaan dat er 10 ul DNA per monster gebruikt wordt, je moet het volume DNA dan dus aanvullen tot 10 ul

Noteer hoeveel ul DNA en hoeveel ul demi je bij de mastermix pipetteert

Monster ____________ul
Mastermix__________ul
Totaalvolume_______ul

# data[].attributes.body
Maak, met behulp van de voorschriften en je monsterlijst, een pipetteerschema voor de mastermix.

Maak een pipetteerschema voor de 35S mastermix en een pipetteerschema voor de mais ADH mastermix

Tips:
- Voor hoeveel monsters maak je de mastermix?

Noteer de mastermix pipetteerschema's in je labjournaal

# data[].attributes.body
Vul hier het pipetteerschema voor agarosegel in

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

Kijk in de voorschriften, daar staat dat 0,7% agarose (tenzij er anders aangegeven is) vaak een goede concentratie agarose is

Er staat ook dat er 50 ml agarosegel nodig is

Agarosegel
______________________0,7_____ % gel
agarose _____________________g
TAE _________________________ ml
eindvolume _________50_____ ml

Dan is de hoeveelheid agarose en TAE makkelijk te berekenen.
0,7% = 0,7 g per 100 ml gel
er is 50 ml nodig, dus 0,35 g agarose
TAE is een buffer (hint: er staat ml in het pipetteerschema), dus aanvullen met TAE tot 50 ml

Het pipettteerschema is dan:
Agarosegel                       ______0,7_____ % gel
agarose                          ______0,35____g
TAE                 aanvullen tot 50_____ ml
eindvolume             _________50_____ ml

Noteer nog hoeveel ul sybrsafe erbij moet, zonder sybrsafe blijft het DNA in de gel onzichtbaar. Waarschijnlijk is het sybrsafe op het lab 10x verdund i.v.m. veiligheid

Toevoegen aan gel voordat hij gegoten wordt:
puur sybrsafe:                     1 ul of
10x verdund sybrsafe:     10 ul

# data[].attributes.body
Het kan handig zijn om een planning te bedenken om overzicht te houden over de labdag. Uiteindelijk op de praktijktoets word gekeken of je weet wat je moet doen, of dat in je hoofd zit of op papier mag je zelf bepalen.

Stappen die in je planning kunnen staan zijn bijvoorbeeld:

Materialen verzamelen

Gelplek inrichten

Epjes beschrijven

agarosegel oplossing maken

agarosegel gieten

agarosegel laten stollen

DNA verdunningsreeks maken

Loading dye toevoegen aan DNA monsters

DNA monsters in de gel doen

Gel runnen (stroom erop zetten)

Resultaten bekijken op safe imager (blauwe lichtbak) en fotograferen

Opruimen

# data[].attributes.body
Bij elk experiment heb je analysemonsters en zijn er controles nodig om te weten of de data van het analysemonster betrouwbaar is. Beschrijf hier welke monsters je wilt maken.
Beschrijf per controle:

wat je controleert

Welk DNA wel of niet in het monster moet

Welke primers er wel of niet in het monster moeten

Hoe de uitkomst er uit ziet wanneer het experiment goed verloopt

wel / geen bandje

Beschrijf in je labjournaal in een tabel de monsters
...

# data[].attributes.body
Vul hier het pipetteerschema voor ... in

Bedenk eerst de concentratie en het eindvolume

# data[].attributes.body
Vul de veiligheidsmap aan met informatie over chemicalien die er nog niet in staan

# data[].attributes.body
Detectie van GGO’s in Doritos

Eerder ben je begonnen met het aantonen van genetisch gemodificerde (GGO) mais in dorito door DNA uit Amerikaanse en Nederlandse Dorito’s en uit mais te isoleren. Deze week ga je van beide doritosoorten bepalen of dit DNA genetisch gemodificeerd is door de 35S promoter aan te tonen door middel van een polymerase chain reaction (PCR), dit doe je in duplo.

De genetishe sequentie die aantoont of de mais GGO is is de 35S promoter, die is afkomstig van cauliflower mosaic virus (CMV). De primers die je gebruikt zijn afkomstig van de NVWA (Nederlandse Voedsel en Waren Autoriteit), die deze ook gebruikt om aanwezigheid genetisch gemodificeerde mais in voedingsmiddelen aan te tonen. Om te controleren of het DNA van goede kwaliteit is heb je ook een primerset die ADH uit alle mais (GGO of niet-GGO) herkent. Vergeet niet het experiment in silico uit te voeren zodat je de resultaten goed kan interpreteren.

Op het lab is het DNA aanwezig dat je zelf (of klasgenoten) hebt geisoleerd uit doritos en mais, 35s of GGO controle DNA, 35S primers, mais ADH primers en alle materialen voor PCR.

Tips voor uitvoering:

De gebruikte GGO-promoter is afkomstig van cauliflower mosaic virus (CMV)

GGO-mais primers herkennen CMV-DNA, niet-GGO mais bevat dit niet

De latijnse naam van mais is zea mays

Controle primers herkennen mais-DNA (mais ADH)

Mais heeft een groot genoom, gebruik voldoende template DNA.

Analyse van het PCR-resultaat: je gaat kleine fragmenten analyseren. Hiervoor is het beter om een hoger percentage agarose te gebruiken. Maak een 1.5% agarosegel en run 15 minuten op 50 V en de rest van de tijd op 75 V.

Negatieve controle: Je hebt DNA geïsoleerd dat geen 35S promotor bevat (welke van je monsters was dat?).

Positieve controle: Als je zeker wilt weten dat je GGO-primers werken is er 35S DNA aanwezig, dit is gelabeld als '35S DNA' of 'GGO mais DNA'. Beschouw dit als  een klein genoom en gebruik de correcte hoeveelheid template DNA.

Om te controleren of het geïsoleerde DNA van goede kwaliteit is gebruik je ook een primerset die maisgenen herkent (eigenlijk doe je dus 2 PCRs).

Bij PCR gebruik je een mastermix. Dit lijkt erg op de reactiemix voor restrictie. Het is een oplossing waarin al je materialen aanwezig zijn behalve het te gebruiken DNA.

De optimale Tm voor de 35S primers is 56.5 oC. Dit is lager dan je zou verwachten als je het zelf berekent, maar het werkt het beste, dus stel deze temperatuur in voor de hybridisatie-stap.

# data[].attributes.body
Deze week is een keuze experiment. Als je bij het eerste keuzemoment DNA hebt geisoleerd uit doritos en mais dan ga je deze week deze PCR uitvoeren.

Werk samen voor de voorbereiding, anders is het misschien te veel.

# data[].attributes.body
Noteer hier het inzetschema voor de agarosegel

Het is vaak handig om van tevoren te plannen hoe je de agarosegel gaat indelen. Welk monster gaat in welk slotje? Noteer dat hier.

1:
2:
3:
4:
5:
6:
7:
8:
9:
10:
11:
12:
13:
14:
15:

# data[].attributes.body
Noteer hier een tabel met de benodigde materialen

Zoek in de voorschriften en de opdracht op welke materialen nodig zijn, maak een tabel waarin je op het lab ook de fabrikant kan noteren

Welk DNA heb je geïsoleerd / ga je gebruiken? Noteer die ook bij materialen
Welke primers heb je nodig? Noteer deze ook bij materialen

Materiaal, concentratie, fabrikant
...     ...     ...
...     ...     ...
...     ...     ...

# data[].attributes.body
Noteer hier de onderbouwde verwachting van het experiment

Onderbouw je verwachting met prinscreen-plaatjes van de BLAST resultaten (in silico-versie van het experiment)

Analysemonsters
Monster...
Wat verwacht je dat er uit komt?

Wel of geen GGO?

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet

wel of geen bandje?

Bij wel een bandje: hoeveel basenparen? --> zoek dit uit met BLAST

...

Waarom verwacht je dat?

...

Monster...
Wat verwacht je dat er uit komt?

Wel of geen GGO?

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet

wel of geen bandje?

Bij wel een bandje: hoeveel basenparen? --> zoek dit uit met BLAST

...

Waarom verwacht je dat?

...

Controles

Controle ...
Wat verwacht je dat er uit komt?

...

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet

wel of geen bandje?

Bij wel een bandje: hoeveel basenparen? --> zoek dit uit met BLAST

...

Waarom verwacht je dat?

...

Controle ...
Wat verwacht je dat er uit komt?

...

Hoe verwacht je dat het resultaat er uit ziet

wel of geen bandje?

Bij wel een bandje: hoeveel basenparen? --> zoek dit uit met BLAST

...

Waarom verwacht je dat?

...

etc...

# data[].attributes.body
Wat is het doel van het experiment?

Voor het doel staan vaak hints in de opdracht tekst

...

# data[].attributes.body
Noteer hier de benodigde voorschriften

In de opdracht tekst wordt vaak gehint naar de voorschriften. Kijk naar de opdrachttekst en kijk naar de index van de voorschriften. Als je dezelfde woorden tegenkomt zijn dat vast de benodigde voorschriften

...

...

# data[].attributes.body
Noteer in je labjournaal: Wat is het principe? Waarom werkt deze techniek?

Wat doet PCR?

Welke fases zijn er en wat gebeurt er dan in het monster?

Waarom kan je met PCR aantonen of doritos wel of niet GGOs bevatten?

...