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se mezcla cantidades crecientes de antígeno soluble con una cantidad constante de Anticuerpo.

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Uso de anticuerpos en pruebas de inmunodiagnóstico

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Uso de anticuerpos en pruebas de inmunodiagnóstico

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Los anticuerpos pueden usarse para identificar y detectar un antígeno específico en una muestra.
También se pueden detectar en el suero sanguíneo para demostrar la exposición previa a un agente infeccioso.

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Son anticuerpos que se obtienen de un hibridoma, de forma casi ilimitada. Pueden reemplazar a los antisueros convencionales en las pruebas de serología.

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Son pruebas en las que el antígeno y el anticuerpo se unen. Se puede realizar la medición de los inmunocomplejos que se forman. Es necesario que haya un reactivo marcado (puede ser con radioisótopos, colorantes o fluorocromos y enzimas).

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Ventajas y desventajas del radioinmunoanálisis

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Ventajas y desventajas del radioinmunoanálisis

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Ventajas: son pruebas muy sensibles.
Desventajas:

Es costoso el uso de sistemas de detección de isótopos.

La radioactividad es peligrosa.

La eliminación del material radioactivo debe hacerse a máxima seguridad.

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Se utilizan anticuerpos que se marcan con colorantes fluorescentes o fluorocromos. Estos anticuerpos se utilizan en inmunofluorescencia directa e indirecta. Se utiliza isotiocianato de fluoresceína (FITC). Este se une a los anticuerpos y cuando está expuesto a luz UV, emite una luz verde brillante que se puede ver en microscopio de fluorescencia.

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Estas pruebas se emplean para identificar la presencia de
un antígeno en una muestra de tejido.

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Se coloca la suspensión de partículas en un spectrofluorímetro y se mide la intensidad de fluorescencia unida a las partículas, dándonos una medida del nivel de anticuerpos presentes.

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Las técnicas serológicas se clasifican en tres categorías:
- Unión primaria: que miden directamente la unión del antígeno a un anticuerpo.

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Obtenido de la sangre coagulada. El suero se puede almacenar congelado y analizarse cuando sea conveniente.

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Uno de los reactivos mencionados previamente debe marcarse químicamente, de esta manera la prueba será positiva.

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Mide la inmunoglobulina (IgE) específica en el suero de los animales alérgicos.

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En la inmunoanálisis
de medicina veterinaria destaca el análisis de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA). Al igual que
otras pruebas de unión primaria, el ELISA puede emplearse para detectar y medir tanto anticuerpos como antígenos.

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Se han desarrollado inmunoanálisis
sencillos que pueden emplearse en la clínica y que dan información útil en un tiempo muy breve, como:

La inmunofiltración

La inmunocromatografía

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Los isótopos radiactivos tienen una vida media corta.

Son potencialmente peligrosos.

Requieren dispositivos de detección caros.

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En este instrumento, se bombea una suspensión de células por un tubo muy estrecho, de tal forma que las células pasan en una fila en
línea. Se dirige directamente un haz de láser al flujo de células y se observa el efecto de cada célula en el haz de luz.

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Las reacciones entre antígenos y anticuerpos normalmente se siguen de una reacción secundaria:

Los anticuerpos se combinan con antígenos solubles en solución, los inmunocomplejos resultantes pueden precipitar.

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Si la solución de un antígeno soluble se mezcla con un antisuero potente, la mezcla se vuelve turbia en unos pocos minutos y después flocula

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El suero que se analiza se diluye en una serie de concentraciones decrecientes y cada una de ellas se
analiza en busca de actividad.

El recíproco de la dilución
más alta que da una reacción positiva se denomina título, y proporciona una estimación de la cantidad de anticuerpos de ese suero.

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Los anticuerpos son bivalentes y pueden establecer enlaces cruzados con antígenos particulados, como una bacteria o eritrocitos extraños, originando su agrupamiento o aglutinación.

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Algunos virus pueden unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y de aves.

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La activación de la vía clásica del complemento por un anticuerpo unido a un antígeno da lugar a que se generen complejos de ataque a membrana capaces de lisar las membranas celulares.

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Si un microorganismo o un antígeno tienen actividad
biológica, es posible cuantificar los anticuerpos por su
capacidad de neutralizar dicha actividad. Las actividades que pueden ser neutralizadas son:

La hemólisis de eritrocitos.

La lisis de células nucleadas.

La enfermedad o muerte en los animales.

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La presencia de anticuerpos frente a un microorganismo específico en el suero de un animal indica la exposición previa a un epitopo presente en ese microorganismo.

Sin embargo, no demuestra que exista la infección o que cualquier enfermedad concurrente realmente está causada por el microorganismo en cuestión.

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Se pueden usar para detectar anticuerpos en el suero o para identificar antígenos específicos en los tejidos o en los cultivos tisulares.

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cuando se necesita analizar la presencia de anticuerpos no aglutinantes en la superficie de células como bacterias o eritrocitos. Las partículas lavadas se mezclan con antiglobulinas, si hay anticuerpos se aglutinan.

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Objetivo: identificar la presencia de anticuerpos específicos para un antígeno en un suero.
Fases:
1. Se mezclan los antígenos y el suero a analizar y del que se sospecha la presencia de anticuerpos (el complemento se inactiva con calor). Se incuba esta mezcla con suero de cobaya (ahí se incluye el complemento).
2. Se unen la mezcla incubada con eritrocitos recubiertos de anticuerpos.
Resultados y mecanismo:
-Si hubiera anticuerpos en el suero, se da la reacción y se forma una unión Ag-Ac-Complemento. Es decir, el complemento se activa y actúa. Cuando se colocan los eritrocitos, estos no se van a lisar porque el complemento ya no está presente. Se hace una suspensión turbia, que da positivo.
-Pero si no hay anticuerpos en el suero, no se produce la unión con los antígenos y por esto el complemento no se activa. Cuando se añaden los eritrocitos, estos van a ser lisados por el complemento que no se utilizó en la primera fase. Solución rojo transparente que da negativo.

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Es una forma de prueba de neutralización totalmente in vivo.

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Es una técnica mucho más sensible que la precipitación y se realiza mediante la unión química de un antígeno soluble a partículas inertes, como eritrocitos, bacterias
o látex.

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Las pruebas mas sensibles y especificas detectan directamente el antígeno o el anticuerpo de interés. Ejemplo inmunoadsorción ligado a enzimas

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Normalmente se usa esta prueba para detectar anticuerpos.
Se utiliza una microplaca con pocillos. Estas cuentan con una solución de antígeno.
Pasos:
1. Se coloca en la placa el suero que se va a analizar.
2. Los anticuerpos específicos para el antígeno de la microplaca, se van a unir a este.
3. Incubación y lavado (se mantienen los Ac unidos a los Ag)
4. Se añade una solución que contiene Antiglobulinas marcadas con enzimas. Estas se van a unir a los Ac que se habían unido a los Ag.
5. Incubación y lavado.
6. Se coloca una solución con el sustrato de la enzima. Se da la reacción catabólica y esto causa un cambio de color en la muestra.
El cambio de color es proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el suero.

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las inmunoglobulinas son moléculas complejas, que cuando se inoculan en otra especie son antigénicas.

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En un método simple se usa
una membrana recubierta con un anticuerpo (anticuerpo
de captura), que se fija en una base conectada a un lecho
absorbente.

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También se lo conoce como difusión
en gel, es un método simple que sirve para demostrar la precipitación de un
antígeno por un anticuerpo

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son extremadamente sensibles, y normalmente se usan para detectar cantidades traza de farmácos.

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Se basa en el paso de una solución que contiene antígenos a través de una banda porosa. Mientras se da el paso de esta sustancia, esta tiene contacto con anticuerpos marcados y estos se unen a los antígenos. Los inmunocomplejos se acumulan en la membrana porosa y se forma una línea rosa o azul que es indicativo de positividad para la presencia del antígeno.

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Se pueden determinar los anticuerpos frente antígenos de superficie celular en base a  la reacción de las células diana con
los anticuerpos y el complemento, y estimando la muerte celular resultante, ya que el complemento puede causar daño en la membrana, no
solo de los eritrocitos, sino también de las células nucleadas
y de los protozoos.

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Se puede analizar simultáneamente la expresión de múltiples antígenos de superficie celular, utilizando anticuerpos con diferentes fluorocromos.

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Estas pruebas proporcionan
una medida directa de la eficacia terapéutica de un antisuero y sus propiedades protectoras se miden
administrando el mismo en diluciones crecientes a un grupo de animales problema, que después se inoculan con una dosis estándar del microorganismo patógeno o de la toxina.

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Esta inhibición permite identificar un virus específico o cuantificar los niveles de anticuerpos en el suero.

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Ventajas y desventajas del uso de enzimas

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Ventajas y desventajas del uso de enzimas

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Ventajas: las enzimas son estables y relativamente baratas.
Desventajas: son moléculas grandes que pueden inhibir la actividad del anticuerpo. También pueden perder su actividad enzimática.

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Los anticuerpos unidos a antígenos particulados en cambio forman grumos o aglutinan.

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Si un anticuerpo activa el sistema de complemento y el antígeno está sobre una superficie celular, se da la lisis de la célula.

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Se utiliza una capa de agar que tiene pocillos. Uno de estos se llena con antígenos solubles y otro con antisuero. Tanto los Ac como los Ag se difunden de forma radial. Cuando estos se encuentran se forma un precipitado lineal.

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Se pueden utilizar inmunoglobulinas o antiglobulinas conjugadas con enzimas para localizar antígenos específicos en cortes de tejidos.

Ventajas sobre las pruebas de inmunofluorescencia,:

Los tejidos pueden examinarse con un microscopio óptico convencional.

Pueden teñirse de modo que las relaciones estructurales son fáciles de ver.

Inmunoperoxidasa directa:  el corte del tejido se trata con el anticuerpo marcado con una enzima, después de lavar, se incuba con una solución del sustrato apropiado de la enzima.

Prueba indirecta: el anticuerpo unido se detecta mediante una antiglobulina marcada.

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Se utilizan eritrocitos recubiertos como las partículas inertes que se unirán al Ag. Objetivo: formar un aglutinado en caso de presencia del antígeno.
Variante: uso de anticuerpos monoclonales bifuncionales. (Estos pueden reconocer dos epítopos diferentes.

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En las pruebas serológicas se debe tomar en cuenta la posibilidad de errores. Pueden darse por la falta de control en la prueba. Pero hay errores que muchas veces no se pueden evitar como la presencia de falsos positivos y falsos negativos.
Una prueba con muchos falsos positivos es poco específica.
Una prueba con muchos falsos negativos es poco sensible.

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Se puede llegar a producir antiglobulinas inespecíficas frente a todas las clases de inmunoglobulinas, o antiglobulinas muy específicas dirigidas frente a una sola clase.

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El antígeno no marcado desplaza al antígeno marcado de los inmunocomplejos, lo que nos da un resultado indirecto debido a que la cantidad de antígeno marcado
que se libera será proporcional a la cantidad de antígeno no marcado
que se añade.

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En esta prueba el antígeno se unirá al anticuerpo específico del suero, y se va a detectar este anticuerpo por la unión de una antiglobulina marcada con isotiocianato de fluoresceína.

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En esta prueba, el suero se separa por electroforesis y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y las bandas de antígeno se revelan mediante un anticuerpo específico y una antiglobulina marcada con una enzima o un radioisótopo.

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Se puede hacer el uso de oro y el selenio coloidales como marcadores en las pruebas de inmunocromatografía sencillas debido a que poseen color.

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Se puede usar el citómetro de flujo
para seguir cambios secuenciales en el inmunofenotipo de poblaciones celulares mixtas.

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Se puede observar un anillo de precipitado cuando una solución antigénica se difunde en un agar con antisuero específico, el área del anillo será proporcional a la cantidad de antígeno en el pocillo.

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Estiman la capacidad del
anticuerpo para neutralizar la actividad biológica del antígeno
cuando se mezcla con él in vitro.

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La selección de una prueba diagnóstica representa una solución intermedia entre su sensibilidad, su especificidad y su complejidad. Lo más apropiado suele ser el uso de la prueba más sensible y específica