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-Geduldig sein
-Konzentrationsfähig sein
-ein bisschen Vorwissen ;-)
-eine ruhige and

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Gel mit Banden unter UV-Licht

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Gel mit Banden unter UV-Licht

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Gelelektrophorese Behälter

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v.l.n.r. : Zentrifuge , Erhitzer, Waage, Feinwaage

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v.l.n.r. : Zentrifuge , Erhitzer, Waage, Feinwaage

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diverse Pipetten

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                                                                                                                                                           Bildergalerie  

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                                                                                                                                                           Bildergalerie  

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Saubere Sequenzen: DNA Sequenzierung

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Unsaubere Sequenzen: DNA Sequenzierung

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Am Donnerstag der 2. Woche hatte ich doch noch die Möglichkeit bei der Untersuchung von Fischen dabei zu sein und durfte sogar selber Hand anlegen. Unsere Aufgabe war es die Otolithen von Stöckern(Fischart) zu entfernen. Dies sind kleine Kalkplättchen die hinter den Augen sitzen und für die Wahrnehmung von Tönen und für den Gleichgewichtssinn verantwortlich sind. Das ist eine sehr blutige Angelegenheit und nichts für schwache Nerven :-). Da ich aber sowieso selber Angler bin hat mir die Arbeit nichts Ausgemacht und war sehr spannend.

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Die einzelnen Schritte von Proben nehmen über PCR und DNA Extraktion bis hin zur Sequenzierung dienen dem Aufbau einer Internationalen Gen-Datenbank.
Diese wird z.B für Herkunftskontrollen gebraucht, denn im Internationalen Fischfang wird viel Unfug getrieben wie zum Beispiel Verarbeitetes Dorschfilet als Lachsfilet auszugeben.

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PCR (polymerase chain reaction) CO1-Cytochrome c oxidase-PCR

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PCR (polymerase chain reaction) CO1-Cytochrome c oxidase-PCR

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Denaturierung: Bei 95°C brechen die wasserstoffbrücken zwischen den Doppelsträngen auf.

Annealing:
Bei 40-60°C lagern sich die Primer an die passende Stelle auf dem DNA-Einzelstrang an (Ausbildung von Wasserstoffbrücken). Je höher die Annealing-Temperatur gewählt ist, desto spezifischer findet die Anlagerung statt.

Elongation:
Bei 72°C synthetisiert die Taq-Polymerase vom 3'-Ende des Primers ausgehend den neuen "Doppelstrang" in 5'-3' -Richtung. Die Polymerase verknüpft dabei die dNTPs mehr oder weniger fehlerfrei komplementär zum Matrizenstrang und zwar so lang wie der Elongationsschritt andauert, bzw. bis der Strang zu Ende ist.
Dieser Schritt wird ca. 30 mal wiederholt (ca. 1 Milliarde DNA Kopien)

Komponenten:
Taq-Polymerase: thermostabiles Enzym(sehr teuer und empfindlich)
PCR-Puffer: meist als Konzentrat zur Polymerase mitgeliefert; schafft optimale Reaktionsbedingungen für die Polymerase
MgCl: hat großen Einfluss auf die Primer-Annealings-Spezifität
dNTPs: "Desoxynucleotidtriphosphate" dATP dTTP dGTP dCTP
Primer: ca. 20bp lange einzelsträngige Oligonucleotide, "Startsequenz"

PCR-Programm
98°C                 30 sec
98°C                 10 sec  } 32x
53°C                 30 sec  } 32x
72°C                 20 sec  } 32x
72°C                   8 min
4°C                     ∞

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-Das Gel der Gel-Elektrophorese mit dem Reagenz beladen
-Probenbehälter für die Seereise mit Hilfe von modernen Pipetten befüllen
-Pipetten Kalibrieren und Auswerten
-DNA extrahieren mit Hilfe von Zentrifugen etc
-Otolithen der Fische entfernen
-DNA sequenzieren und auswerten

Hier ein Paar grobe Einblicke in die jeweiligen Arbeitsschritte

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Gen: Cytochrom b

Cytochrom b kommt bei Eukaryoten im Mitochondrium im Cytochrom bc -Komplex vor.

Zutaten:

180ml-Agarosegel (1%):

1,8g Agarose
180ml TBE-Puffer (1x)

Proben zum Beladen:

25µl PCR-Produkt
+ 5µl Ladepuffer

Ladepuffer (L-Puffer) für Agarose-Gel:

50% Saccharose                =5g
0,25% Bromphenolblau    =0,025g
0,1% SDS                            =0,010g

in 10 ml ddH2O lösen

Ablauf:

-Agarosegel aufkochen und dann abkühlen lassen
-Agarosegel in eine Form geben
-Aushärten lassen
-Das Gel in den Elektrophorese-Behälter geben, DNA in die Geltaschen füllen und Strom einschalten(2h bei 110V)
-Gel entnehmen und unter UV licht Fotografieren(um Banden sichtbar zu machen)

-Banden aus dem Gel ausschneiden und in Probenbehälter geben

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Alle Personen im Institut sind sehr nett und hilfsbereit und haben immer ein offenes Ohr für die Praktikanten. Was mich besonders gefreut hat ist, dass ich fast alle Aufgaben die TAs haben auch machen durfte. Vor allem hat mir das Pipettieren der Proben spaß gemacht da man sehr genau, manchmal sogar auf den letzten Mikroliter genau, arbeiten muss. Das "Sezieren" war aber auch sehr Spannend. Beeindruckt hat mich auch die Anzahl der verschiedenen Geräte wie zum Beispiel Pipette, Zentrifuge, Thermocycler... . Als ich dann gefragt habe welches Gerät das teuerste sei, bekam ich eine unerwartete Antwort: "Die Taq-Polymerase"!
Ein Enzym von dem schon eine sehr geringe Menge ca. 400€ kostet.

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Palmaille 9
22767 Hamburg-Altona
Tele.: +49 4038905269

E-Mail: tina.blancke@thuenen.de

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-Überwachung der Umweltradioaktivität in Fisch.

-Chemische Spurenanalytik

-Biologische Effekte von Schadstoffen

-Meeresmüll im Fischernetz

-Fischkrankheiten und Mutationen

-Biodiversität und Wanderfische

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Im Thünen-Institut arbeiten Chemiker, Biologen, Fischwirte und Techniker eng zusammen, um gemeinsam mit internationalen Partnern die Forschung auf dem Gebiet der Fischereiökologie voranzubringen.
Die Aufgabe des Tühnen-Instituts besteht darin, die Meeresumwelt zu erforschen und zu überwachen um frühzeitig erkennen, was sich verändert, und wie sich das auf das Nutzungspotenzial lebender Ressourcen auswirkt.

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-Praxisorientiertes arbeiten
-freundlicher Umgang
-Spannende Aufgaben

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Institut für Fischereiökologie