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La PCR de punto final es una técnica en donde se amplifican las secuencias de ADN de forma exponencial esto con diversas aplicaciones en campos como la biología molecular, entre otros.

En este mural se presentaran diversos materiales que serán de utilidad para entender el funcionamiento de las PCR.

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Este es un video explicativo de como funciona la PCR, y como se usa en las pruebas de detección de Covid-19.

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Este blog brinda un pequeño resumen sobre la PCR de punto final,  explicando lo que es, como funciona, y que aplicaciones tiene.

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La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA.

Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.

La PCR ha revolucionado la biología debido a su capacidad de utilizar cantidades infinitesimalmente pequeñas de DNA y amplificarlo en cantidades susceptibles de análisis utilizando a la enzima DNA polimerasa, que es la encargada de sintetizar nuevas copias de DNA.

¿Cómo funciona la PCR?

La PCR típica en realidad, amplifica solo una región o secuencia diana elegida dentro de una muestra compleja de DNA mediante dos pequeñas moléculas de DNA monocatenario llamados iniciadores (primers o cebadores) de PCR.

Los iniciadores de PCR son la clave para amplificar solo una secuencia diana definida de una muestra compleja, incluso tan compleja como una muestra de DNA aislada de suelo o agua, que puede contener millones de fragmentos diferentes de DNA de los microbios que habitan estos entornos.

Ciclos de la PCR.

Esta técnica de PCR, conocida también como PCR punto final, se puede resumir como en la imagen anterior. Primero, se extrae el DNA bicatenario que contiene la región diana y luego se calienta hasta que se vuelve monocatenaria. A continuación, los iniciadores de PCR se parean al principio y al final de la región objetivo. Finalmente, la DNA polimerasa hace copias de la región diana.

El primer paso en la PCR es mezclar los siguientes componentes o ingredientes en un tubo:

1. La molécula de DNA original o el DNA diana en una pequeña cantidad es suficiente. El DNA diana puede ser parte de una muestra de DNA compleja, que contiene múltiples genomas de diferentes organismos, pero también podría ser tan simple como un fragmento de DNA previamente amplificado por PCR.

2. Se necesitan dos iniciadores de PCR para comenzar la síntesis de DNA. Estos son fragmentos cortos de DNA monocatenario que son complementarios a las secuencias en cada extremo del segmento de DNA diana. Estos iniciadores se obtienen mediante síntesis química de DNA.

3. Se necesita DNA polimerasa para sintetizar las copias de DNA. La PCR implica varios pasos de alta temperatura, por lo que se requiere una DNA polimerasa resistente al calor. Las polimerasas termoestables se aíslan de bacterias que viven en ambientes a temperaturas de hasta 90 ºC o más. La DNA polimerasa Taq de Thermus aquaticus es la más usada, pero muchas especies diferentes de bacterias termófilas han proporcionado características mejoradas para realizar copias de una secuencia de DNA diana durante la PCR.

4. La DNA polimerasa necesita un suministro de nucleótidos, o bloques de construcción para el nuevo DNA, con el objetivo de sintetizar las nuevas copias. Estos se suministran como desoxinucleósidos trifosfatos (dNTP).

5. Una solución amortiguadora o tampón que contiene las concentraciones adecuadas de iones y pH que garantizan las condiciones óptimas.

El segundo paso de la PCR es colocar el tubo con los ingredientes en una máquina especial llamada máquina de PCR o termociclador, que es capaz de alternar la temperatura del tubo de reacción de PCR de forma rápida y precisa.

El termociclador alterna la temperatura desde un máximo de 95 °C hasta un mínimo de 4 °C. Normalmente, una reacción de PCR se realizará en 20-40 ciclos con tres temperaturas diferentes en cada uno de los ciclos. Cada ciclo consta de una temperatura de desnaturalización, una temperatura de alineamiento y finalmente una temperatura de extensión.

Programa típico de termociclado para PCR.

De todos los avances técnicos en biología molecular moderna, la PCR es uno de los más útiles; de hecho, la PCR es lo suficientemente sensible como para amplificar el DNA de una sola célula.

Aplicaciones de PCR punto final

No es sorprendente que la PCR haya encontrado aplicaciones en todos los campos de la biología molecular y la biotecnología, tanto básica como aplicada. Estos incluyen análisis y manipulación de DNA, construcción de plantas y animales transgénicos, ciencia forense, diagnóstico médico, terapia génica y análisis ambiental.

En teoría, la PCR amplifica el DNA de manera exponencial, duplicando el número de moléculas diana con cada ciclo de amplificación. Cuando se desarrolló por primera vez, los científicos razonaron que el número de ciclos y la cantidad de producto final de la PCR podrían usarse para calcular la cantidad inicial de material genético en comparación con un estándar conocido. Para abordar la necesidad de una cuantificación sólida, se desarrolló la técnica de PCR en tiempo real.

Actualmente, una aplicación principal de la PCR de punto final es amplificar DNA específico para secuenciar, clonar y usar en distintas técnicas de biología molecular.

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¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR punto final)?

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La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction) amplifica una secuencia de DNA mediante ciclos repetidos de separación de cadenas y replicación del DNA. Con la PCR cada DNA recién sintetizado se convierte en una molécula molde para generar más, creando así una reacción en cadena que genera copias de DNA de manera exponencial.

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Este PDF habla un poco sobre las ventajas y desventajas de la PCR, el equipo y materiales que se utiliza para realizarla y algunas recomendaciones

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En la siguiente presentación se muestran diversos temas entre ellos se tocan puntos importantes sobre la PCR. 

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Entre los puntos mas importantes encontramos como se descubre la estructura del ADN y a partir de este se crean técnicas como la del PCR, como funciona, que tipos de PCR existen, entre otros aspectos a tomar en cuenta.

La presentación sobre PCR comienza desde el minuto 54: 43

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Tres profesionales comparten en esta presentación temas que se relacionan entre sí; Marco Vinicio Centeno menciona los factores que le dieron el origen a la vida, el procesos de evolución y adaptación de los seres vivos, concepto histórico de los cambios en la naturaleza, función de la genética, influencia del medio ambiente en los procesos [...]

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Hay diferentes maneras de obtener una muestra para una prueba de PCR. Los métodos más comunes son el análisis de sangre y el hisopado nasal.

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¿Qué ocurre durante una prueba de PCR?

Hay diferentes maneras de obtener una muestra para una prueba de PCR. Los métodos más comunes son el análisis de sangre y el hisopado nasal.

En la prueba de sangre, el profesional de la salud toma una muestra de sangre de una vena de un brazo con una aguja pequeña. Después de insertar la aguja, extrae un poco de sangre y la coloca en un tubo de ensayo o frasco. Tal vez sienta una molestia leve cuando la aguja se introduce o se saca, pero el procedimiento suele durar menos de cinco minutos.

El hisopado nasal consiste en tomar una muestra de la parte de adelante de las fosas nasales (narinas anteriores). La muestra también se puede tomar de la parte de atrás de las fosas nasales en un procedimiento conocido como hisopado de cornete medio (NMT, por sus siglas en inglés), o de la nasofaringe, la parte más alta de la nariz y la garganta. A veces, el médico le puede pedir que usted mismo se haga el hisopado de narinas o de cornete medio.

Durante el hisopado de narinas, usted primero inclina la cabeza hacia atrás. Luego, usted o el profesional de la salud:

Inserta suavemente un hisopo en una fosa nasal

Gira el hisopo y lo deja en su lugar por 10 a 15 segundos

Retira el hisopo y lo introduce en la otra fosa nasal

Gira el hisopo por la otra fosa nasal usando la misma técnica

Retira el hisopo

Durante un hisopado de cornete medio, usted primero inclina la cabeza hacia atrás. Luego, usted o el profesional de la salud:

Inserta suavemente un hisopo en el fondo de una fosa nasal, empujándolo hasta que sienta que se detiene

Gira el hisopo durante 15 segundos

Retira el hisopo y lo introduce en la otra fosa nasal

Gira el hisopo por la otra fosa nasal usando la misma técnica

Retira el hisopo

Durante un hisopado nasofaríngeo:

Usted inclina la cabeza hacia atrás

El profesional de la salud inserta un hisopo en una fosa nasal hasta la nasofaringe (la parte superior de la garganta)

Luego gira el hisopo y lo retira

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Pruebas de PCR: Prueba de laboratorio de MedlinePlus

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Hay diferentes maneras de obtener una muestra para una prueba de PCR. Los métodos más comunes son el análisis de sangre y el hisopado nasal. En la prueba de sangre, el profesional de la salud toma una muestra de sangre de una vena de un brazo con una aguja pequeña.

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Visualización de los productos de PCR punto final. M: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA.

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Explicación de funcionamiento de PCR de punto final.

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Explicación de funcionamiento de PCR de punto final.

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En esta infografía sobre la PCR encontramos varios puntos importantes como ser el objetivo, las aplicaciones que puede tener, las etapas, las diferentes variantes del método, etc.

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Video Explicativo sobre la Historia de la PCR

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Video Explicativo sobre la Historia de la PCR

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En este video podemos encontrar un poco de historia de la PCR, de como surgió y como fue evolucionando conforme han pasado los años

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Roche y la PCR: un descubrimiento científico monumental

Reconocida como uno de los avances científicos más importantes del siglo XX, ¹ la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una manera rápida y sencilla de crear copias ilimitadas de ADN a partir de una sola hebra original. Se crean millones de copias de una sección de ADN en tan solo unas horas. El ADN copiado puede usarse de manera fiable en una gran variedad de pruebas para diagnosticar y monitorizar enfermedades o para investigación de biología molecular básica.

La PCR recibió el premio Nobel de Química en 1993.
La evolución y la revolución de la PCR
En 1983, Kary Mullis, PhD, un científico de Cetus Corporation, concibió la PCR como método para copiar ADN y sintetizar grandes cantidades de un ADN objetivo específico. A lo largo de los siguientes dos años, un equipo de científicos de Cetus que reconoció el impacto que la PCR podía tener en la biología molecular investigó, perfeccionó y convirtió el proceso teórico en una realidad.

El equipo se presentó por primera vez en 1985 en la reunión anual de la Sociedad norteamericana de genética humana. ² Más adelante ese mismo año, Science, una revista de la Asociación norteamericana para el avance de la ciencia ³ , publicó los resultados en la primera publicación del proceso.

Dos avances significativos han permitido que la PCR se convierta en la tecnología que conocemos hoy en día: la polimerasa Taq y el ciclador térmico.

En 1986, los científicos de Cetus aislaron la polimerasa Taq a partir de Thermus aquaticus, una bacteria que se halla en las primaveras cálidas. Puesto que Taq podía soportar altas temperaturas, se eliminó la necesidad de intervención humana durante la reacción, 4 con la consiguiente facilitación y el acortamiento del proceso. Sin una enzima resistente al calor como la polimerasa Taq, la PCR no podría utilizarse a gran escala, ya que el proceso habría sido demasiado complicado.

Antes de Taq, se utilizó la ADN-polimerasa de E. coli, una enzima que no podía soportar un calentamiento y enfriamiento rápidos, en el segundo paso de la PCR. Mediante E. coli, la polimerasa se reemplazaba manualmente en cada paso de la reacción conforme se degradaba por el calor ⁵ .

En 1987, PerkinElmer, otra compañía biotecnológica de EE. UU., lanzó un ciclador térmico, un instrumento programado para regular la temperatura de una reacción, de modo que calienta o enfría las muestras según sea necesario. De nuevo, este avance minimizó la interacción humana en la reacción, lo que da lugar a un proceso elegante, eficaz y facilitado.

El nacimiento de Roche Molecular Diagnostics

En 1991, Roche adquirió los derechos de PCR de Cetus e invirtió en el perfeccionamiento de la ciencia para su uso en el diagnóstico molecular para detectar enfermedades. Roche Molecular Diagnostics no solo ha definido y perfeccionado la PCR, sino que ha seguido siendo el líder indiscutible y pionero de esta tecnología.

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Roche y la PCR: un descubrimiento científico monumental Reconocida como uno de los avances científicos más importantes del siglo XX, 1 la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una manera rápida y sencilla de crear copias ilimitadas de ADN a partir de una sola hebra original.

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Video: Deteccion de Mycoplasma por PCR punto final

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Video: Deteccion de Mycoplasma por PCR punto final

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Mycoplasma es el grupo de bacterias mas pequeño que existe en cuanto a su morfología y tamaño de genoma.

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LEI | Detección de Mycoplasma por PCR punto final

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Especificidad y Sensibilidad de la PCR en la detección de Salmonella

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Especificidad y Sensibilidad de la PCR en la detección de Salmonella

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Para la detección de Salmonella en muestras de cultivo bacteriano y de tejidos biológicos provenientes de aves de corral con sintomatología sospechosa y previamente confirmadas como positivas. Para la PCR Punto Final se obtuvo una repetibilidad, especificidad y sensibilidad del 100%, y un valor Kappa de 0.98 para la reproducibilidad.

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Optimización de la técnica de PCR Punto Final y Tiempo Real para la detección de Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Gallinarum en aislamientos bacterianos y tejidos biológicos obtenidos a partir de aves de corral